泸定百合过氧化氢酶(Ls-Cat1)基因的克隆及表达分析

过氧化氢酶(CAT)参与植物的多种胁迫反应。为探究百合中的CAT基因与百合抗镰刀菌病害的关系,根据百合尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)诱导的泸定百合(Lilium sargentiae Wilson)SSH文库中筛选到的CAT基因中间序列片段,通过RACE结合RT-PCR技术从泸定百合中克隆到1个CAT基因全长c DNA序列,该基因全长1 743 bp,包含1个1 479 bp的开放阅读框,编码492个氨基酸,命名为LsCat1(Gen Bank登录号:KU355272)。序列比对分析表明,Ls-Cat1编码的氨基酸序列中包含已确定的CAT保守基序。系统进化树分析显示,Ls-Cat1与其它物种CAT基因编码的氨基酸序列具有较高的相似性。qPCR结果显示,Ls-Cat1经百合镰刀菌诱导后明显上调表达,推测该基因可能与百合抗镰刀菌病害相关。本研究结果为揭示百合对镰刀菌枯萎病的抗病分子机制提供了一定的理论依据。     

陆地棉GhMYB9基因克隆及结合特性分析

MYB转录因子蛋白普遍存在于植物中,广泛参与植物的生长发育和代谢调控。为研究GhMYB9基因对棉纤维的调控机制,使用PCR方法,从棉花中克隆1个R2R3-MYB基因GhMYB9(Gen Bank登录号:AF336286.1);利用生物信息学方法分析其氨基酸序列;构建酵母表达载体。结果表明,该基因c DNA全长1 145 bp,开放阅读框长795 bp,编码264个氨基酸,预测其蛋白分子量约为29.624 k D,等电点为9.13。推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。GhMYB9基因组包含2个外显子和1个内含子。进化树分析表明,GhMYB9和Gh MYB聚在同一分支(HQ234875.1)。酵母单杂交试验结果表明,GhMYB9转录因子能够特异结合AC顺式作用元件。本研究结果为进一步阐明GhMYB9的生物学功能奠定了基础。     

丝瓜多酚氧化酶PPO基因家族的克隆与表达分析

多酚氧化酶(PPO)是参与酚类物质氧化的主要酶类之一,在果蔬褐变中发挥重要作用。为探究丝瓜中PPO基因家族的功能,以闽丝3号丝瓜为试验材料,通过转录组测序和RT-PCR方法获得了3个丝瓜PPO基因家族的c DNA序列,依次命名为Lc PPO1(Gen Bank登录号为KM506756)、Lc PPO2(Gen Bank登录号为KR819890)和Lc PPO3(Gen Bank登录号为KX092429);Lc PPO1基因全长2 026 bp,包含一个1 794 bp的ORF,编码598个氨基酸;Lc PPO2基因全长2 071 bp,ORF为1 722 bp,编码574个氨基酸;Lc PPO3基因全长2 189 bp,ORF为1 779 bp,编码593个氨基酸;3个基因均无内含子,其编码的蛋白与甜瓜、黄瓜同源蛋白的相似性较高。生物信息学分析表明,3个基因编码的酶蛋白均无信号肽,无跨膜结构域,为亲水性稳定蛋白,Wolf Psort预测其亚细胞定位于叶绿体。Lc PPO具有PPO蛋白的典型特征,分别具有PPO1-DWL、PPO1-KFDV 2个结构域和一个能够结合2个铜离子(Cu A、Cu B)的中央域酪氨酸酶。实时荧光定量PCR分析显示,Lc PPO家族的3个基因在丝瓜根、茎、叶、花和果实中均有表达。在丝瓜采后储藏期间,3个PPO基因初期表达上调,后期表达量受到抑制;在丝瓜鲜切条件下,Lc PPO1和Lc PPO2基因表达量总体呈先上升后下降趋势,Lc PPO3基因鲜切后表达量均低于采后0h。Lc PPO基因家族基因表达、PPO活性、总酚与丝瓜褐变关系密切,其中Lc PPO1、Lc PPO2在普通丝瓜果肉褐变过程中可能发挥着重要作用。本研究结果为进一步揭示丝瓜褐变的发生机理和丝瓜品种遗传改良奠定了一定的理论基础。     

花生生长素抑制蛋白基因AhARP的表达分析

种子休眠性是花生重要的农艺性状。为了挖掘控制花生种子休眠的重要基因,以花育52号为试材,通过转录组测序获得生长素抑制蛋白基因的全长,该基因全长为918bp,开放阅读框为363bp,编码121个氨基酸,推导出的蛋白质分子量为13.44 k Da,理论等电点p I=9.64。序列比对表明,该序列与花生生长素抑制蛋白基因Ah ARP一致,确认该c DNA序列为编码花生生长素抑制蛋白基因的全长c DNA序列。荧光定量PCR结果表明,Ah ARP基因在种子休眠阶段表达量较高,种子休眠解除后表达量降低;乙烯利释放吸涨种子休眠过程中,Ah ARP基因受到明显诱导;说明Ah ARP基因可能与花生种子休眠有关。Ah ARP基因的序列、结构、性质以及功能的初步分析,为进一步研究该基因在花生种子休眠中的功能机制奠定了基础。     

钝齿棒杆菌精氨酸生物合成相关基因簇argCJBDFR的扩增及序列分析

采用PCR方法扩增钝齿棒杆菌精氨酸生物合成基因簇argCJBDFR,其序列长为6080bp,其中含有argJ、argB、argD、argF和argR5个完整的开放阅读框。序列和结构分析表明这5个结构基因编码的氨基酸序列与谷氨酸棒杆菌的相应基因编码的氨基酸高度同源,同源性分别为92%、95%、96%、97.5%和100%。     

甘蔗锌指蛋白基因的克隆和表达分析

在对甘蔗(Saccharum officinarum)叶片全长cDNA文库测序的基础上,获得1个编码锌指蛋白基因的全长cDNA序列,命名为Sc-zf.生物信息学分析表明,该基因全长1 189 bp,编码171个氨基酸,具有zf-A20和zf-AN1两个锌指结构域;构建了包含Sc-zf开放读码框的原核表达载体,经IPTG诱导,目的基因原核表达产物大小约为18.3 kD;经定量PCR技术分析,该基因在黑穗病菌(Ustilago scitaminea)、水杨酸(SA)、H2O2、NaCl和PEG胁迫下表达特性不同,受到黑穗病菌和NaCl的诱导,PEG的抑制,但也受SA和H2O2的影响.     

桃果实PpFPPS和PpGGPPS基因的克隆及表达分析

本试验以桃果实为试验材料,利用RT-PCR结合RACE技术克隆获得法尼基焦磷酸合成酶(FPPS)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)基因的全长c DNA序列,分别命名为Pp FPPS和Pp GGPPS,并对它们进行生物学信息及表达分析。结果表明,Pp FPPS全长1 501 bp,开放阅读框1 029 bp,编码342个氨基酸;Pp GGPPS全长1 547 bp,开放阅读框1 113 bp,编码370个氨基酸。进化树分析表明,Pp FPPS与苹果和梨的亲缘性较高;Pp GGPPS与橡胶树的亲缘性较高。蛋白质序列分析表明,Pp FPPS和Pp GGPPS均含有5个保守域和2个天冬氨酸富集区(FARM和SARM),同属反式-异戊烯转移酶家族。实时荧光定量PCR分析表明,随着果实成熟度的提高,Pp FPPS和Pp GGPPS基因在桃果实果皮和果肉中的表达量总体上呈先增加后降低的趋势,并在膨大和硬熟期达到最大值。果实膨大期后,Pp FPPS和Pp GGPPS基因在果皮中的表达显著高于果肉,这可能是桃果实成熟后期果皮类胡萝卜素含量高于果肉的重要原因。本研究结果为进一步深入研究桃果实类胡萝卜素生物合成的分子机理奠定了理论基础。     

粉菠萝FVE同源基因的克隆及表达分析

FWE是植物自主开花途径中的关键基因,主要通过抑制FLC的表达来调控花发育过程。本研究利用粉菠萝似echmeafasciata）茎尖组织转录组序列数据,通过RACE技术克隆获得了粉菠萝中n,E同源基因A毋yE的cDNA全长序列。该序列全长为1672bp,开放阅读框为1404bp,编码由468个氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白序列中含有6个保守的WD重复区域。氨基酸序列比对结果表明,4椰E基因编码的氨基酸序列与其它物种中WE的同源序列具有较高的相似性。qRT—PCR（实时荧光定量PCR）分析结果显示,粉菠萝中A椰E基因对外源乙烯的刺激产生了应答。在采用乙烯利灌心处理不同时间的过程中,发现A删E基因的转录水平均在处理后1d时达到最大,推测A椰E可能参与乙烯信号反应,该基因在粉菠萝自主开花途径中的调节作用可能受乙烯影响。     

抗二氟沙星单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR技术,从抗二氟沙星单克隆抗体X1杂交瘤细胞株总RNA中扩增VH和VL基因片段,克隆入pUC18载体,测序进行（X1）可变区基因的克隆及序列分析。通过互联网检索发现VH和VL基因与Ig同源,分别符合小鼠IgVH和Igκ基因特征。VH基因全长363bp,编码121个氨基酸;VL基因全长为348bp,编码11...     

诸葛菜OvCYP86MF基因的克隆及其特性分析

为进一步阐明细胞色素P450基因CYP86MF在诸葛菜发育中的分子机理,本文根据已知同源基因保守序列设计特异引物,利用RT-PCR和RACE技术从诸葛菜中获得一个细胞色素P450基因(OvCYP86MF)全长cDNA序列,该序列全长为1876bp,含有1605bp的完整开放阅读框,可编码534个氨基酸,分子量和等电点分别为61.4kDa和6.90,具有细胞色素P450蛋白的典型特征,即保守结构域FNAGPRLCIG;原核表达显示该基因的融合蛋白在体外可以诱导表达;DANSTAR和Clustal W软件分析表明该基因的全长cDNA序列及其编码氨基酸序列与十字花科物种拟南芥相似性很高,达到80%以上,亲缘关系最近;与CYP86C亚家族成员在氨基酸水平上的相似性均高于50%,因此推断该基因属于CYP86C这个亚家族。Northern杂交分析表明该基因在花蕾中特异表达。     

茶树黄酮醇合成酶基因的克隆与原核表达

本研究采用EST测序技术和RT—PCR技术,获得了一个茶树茶多酚代谢中的重要基因——黄酮醇合成酶（FLS）基因,在GenBank登录（GenBank accession No．EF205150）,其序列全长1317bp,其中开放阅读框长996bp,编码331个氨基酸,3]端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37．5kD,理论等电点为5．80。序列分析表明它与葡萄FLS基因序列的亲缘关系比较近。将该基因重组到表达载体pET-32a（＋）中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树黄酮醇合成酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约61kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。用Ni-NTA亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,得到了纯度在90%以上的纯化蛋白,为进一步研究PET-FLS融合蛋白的活性及功能奠定了基础。     

小金海棠S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因（MxSAMS）的克隆和表达分析

从本实验室建立的小金海棠缺铁差减文库中分离出一个cDNA片段,在GenBank中发现该片段与其它植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因具有90%的同源性。利用RACE技术成功地获得小金海棠（Malus xiaojinensis）SAMS基因(MxSAMS)的cDNA全长序列（GenBank登录号：EU639408）,该基因cDNA全长1 479 bp,最大开放阅读框1 176 bp,编码392个氨基酸,酶蛋白理论分子量为42.99 kD;与其它植物的蛋白质氨基酸序列同源性在88.1%~92.6%之间。推测的MxSAMS蛋白质三级结构包含3个保守结构域和一个保守的ATP结合位点GAGDQG。Southern 杂交显示,MxSAMS基因在小金海棠基因组中是单拷贝的。半定量RT-PCR结果表明,该基因在小金海棠的根和叶中均受缺铁胁迫诱导增强表达。     

早酥梨病程相关基因非表达子1基因（NPR1）克隆及原核表达

本研究以成年早酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Zaosu)叶片为材料,通过RT-PCR克隆早酥梨病程相关基因非表达子1基因(NPR1)并获得其全长序列1771 bp,开放阅读框为1761 bp,编码586个氨基酸(GenBank登录号:FJ769372).利用NCBI/Blastp和ClustalX软件进行相似性分析表明,目的基因编码蛋白质序列与日本梨(p.pyrifolia)、秋子梨(P.ussuriensis)、苹果(Malus xdomestica)、烟草(Nicotiana tabacum)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的NPR1蛋白相似性分别为99%、98%、98%、67%和59%.将其连接pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(EScherichia coli)BL21,经IPTG诱导表达获得大小约为91 kD的目的融合蛋白,融合蛋白主要以包涵体形式表达,表达量约占总蛋白17%.     

毛竹液泡膜Na+/H+逆向运输蛋白基因克隆及表达分析

植物Na+/H+逆向转运蛋白具有稳定细胞质内Na+浓度和调节pH值的功能,对植物的耐盐性具有重要的作用。利用RT-PCR和RACE技术分离出毛竹(Phyllostachys pubescens)Na+/H+逆向转运蛋白编码基因PpNHX1的cDNA序列,全长2290bp(GenBank登录号为GU295174)。该基因的编码蛋白PpNHX1包含545个氨基酸残基,进行BLASTp比对,发现其与芦苇(Phragmites communis)PcNHX1、水稻(Oryza sativa)OsNHX1的序列同源性分别为89%和88%。系统发育分析表明,PpNHX1蛋白与禾本科植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的亲缘关系较近,与质膜型Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较远。以半定量RT-PCR检测PpNHX1基因的表达情况,发现PpNHX1受到200mmol/L NaCl胁迫的诱导,在4h内的表达量随NaCl处理时间延长持续增强,其中根部的表达增强幅度明显高于茎和叶;但4h后,PpNHX1在根与叶中的表达量均有所下降。推断PpNHX1基因在盐胁迫下的表达调控与毛竹耐盐能力密切相关。     

绿色杜氏藻DvGGPS生物信息学及转录差异研究

香叶酰香叶酰焦磷酸合成酶(GGPS)能够催化焦磷酸异戊烯酯(IPP)与二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)反应形成二萜化合物通用前体香叶酰基香叶酰焦磷酸(GGPP)。为深入了解GGPS蛋白在类胡萝卜素合成途径中的作用,通过Illumina Hi Seq TM 2000高通量测序获得Dv GGPS基因c DNA全长序列,对GGPS基因序列进行生物信息学分析,并研究花生四烯酸(AA)、乙酰水杨酸(ASA)和硫酸铈铵(ACS)对Dv GGPS基因转录水平的影响及绿色杜氏藻类胡萝卜素含量变化。生物信息学分析结果表明,Dv GGPS基因c DNA全长2 229 bp,含1 041 bp开放阅读框,编码346个氨基酸。GGPS蛋白质序列理论等电点(p I)为5.82,相对分子质量为37.66 k Da,该蛋白为疏水性蛋白,无信号肽和跨膜区域。二级结构预测显示该蛋白分子中α-螺旋结构最多,占57.23%。同源比对结果表明,绿色杜氏藻GGPS蛋白与雨生红球藻亲缘关系最近。qRT-PCR结果表明,62.5 mg·L~(-1)AA、50 mg·L~(-1)ASA和0.8 mg·L~(-1)ACS处理的Dv GGPS基因转录水平达到最高,此时类胡萝卜素含量也均有提高,说明绿色杜氏藻类胡萝卜素的生物学合成可能是通过诱导Dv GGPS基因表达实现的,Dv GGPS基因在类胡萝卜素生物合成中起关键作用。Dv GGPS基因的克隆及表达调控研究为今后探明类胡萝卜素积累的分子机理提供了重要参考,也为进一步通过代谢工程手段提高绿色杜氏藻类胡萝卜素含量奠定了理论基础。     

巴西橡胶树K~＋通道蛋白基因HbKCO1的克隆与表达分析

本研究采用RT-PCR结合RACE技术,成功地克隆了一个新的巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)K+通道蛋白基因并分析了其结构和表达特征.结果表明,该基因cDNA全长1482 bp,拥有1059 bp的开放阅读框(ORE),编码353个氨基酸残基.同源性和聚类分析证实,该基因属于植物KCO家族,命名为HbKCO1(GenBank登录号为EU827609).半定量RT-PCR分析结果显示,HbKCOl在巴西橡胶树不同器官中均有表达,但叶片中表达量最高,茎次之,根、胶乳和树皮中的表达量最低;高钾、盐胁迫(NaC1)和Ca~(2+)可以促进叶片中HbKCOl的表达,钾饥饿和ABA则起到抑制作用;胶乳中HbKCOl的表达几乎不受乙烯利(ET)和茉莉酸(JA)的影响.     

甜高粱蔗糖合成酶基因（Susy2）的克隆及结构和功能分析

本研究以甘蔗蔗糖合成酶基因(susy2)cDNA序列为探针,对高粱EST数据库进行同源检索,将获得的4条与甘蔗相似性很高的EST序列进行拼接,后经基因组PCR、分子克隆和序列分析验证获得了甜高粱(sorghum bicofor)蔗糖合成酶基因DNA序列(Susy2,GenBank登录号为FJ513325).该序列全长4587 bp,起始密码子至终止密码子序列长4350 bp,包含一个2409 bp的开放读码框.该序列包含15个外显子和14个内含子,剪接方式都为GU/AG模式.Susy2编码的蛋白由802个氨基酸组成,分子量大小为91.7 kD,等电点pI为6.15.保守结构域分析表明,此蛋白含有一个475个氨基酸的GTI糖基化酶保守结构域(275～759),有4个ADP结合位点,能催化6-磷酸果糖和UDPG形成6-磷酸蔗糖.     

奥利亚罗非鱼3种C型溶菌酶基因的克隆及其序列分析

本研究结合RT-PCR和RACE法获得了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)三种C型溶菌酶基因C-1,-2和C-3的全长cDNA.3个基因的cDNA分别为581 bp、662 bp和695 bp,各编码143、156和143个氨基酸(GenBank accession No:EU913095,EU913094和EU836689),相互间氨基酸序列的同源性在63.9%~67.8%之间.3个基因均具有与其它物种C型溶菌酶相同的8个保守半胱氨酸残基和2个活性位点Glu~(35)和Asp~(52),可认为它们均为C型溶菌酶基因.在系统进化树中这3个基因首先与同属高等真骨鱼类的聚类,最后再与低等真骨鱼类的聚类,系统进化关系与传统鱼类分类地位相吻合,显示真骨鱼类C型溶菌酶的进化速度与物种的进化速度基本一致.蛋白分析软件分析显示这3个基因均具有C型溶菌酶的典型结构、相似的蛋白二、三级结构,推测应具有与C型溶菌酶相似的生理功能.但3个基因氨基酸序列间存在一定差异,其中C-1的等电点较低且碱性氨基酸较少,因此3种溶菌酶可能具有生理功能上的差异与分工.     

棉花MADS-box蛋白基因（GhMADS-13）的克隆和表达分析

一组具有MADS-box结构域的转录因子在控制花器官的诱导与发育中起着重要作，以中棉所36（CCRI）均一化全长cDNA文库为基础，结合EST测序分析，分离获得一个棉花的MADS-box基因全长cDNA。该基因cDNA全长1079bp，包含一个732bp的完整的开放阅读框，编码234个氨基酸，具有典型的MADS-box结构域和完整的K区，命名为GhMADS-13（GenBank：FJ409870）。与拟南芥、葡萄等植物的AGL6类基因具有高度的同源性。实时定量RT-PCR分析表明，GhMADS-13在CCRI36的花器官发育中早期表达量逐步增加，后期有下降趋势。推测GhMADS-13可能在开花诱导和花器官发育过程中起着重要作用。     

一种新的精子膜蛋白sp18基因的克隆及其在E.coli 中的表达

摘要：利用sp18 mAb筛选小鼠睾丸λgt11-cDNA表达文库,命名为sp18（GenBank登录号：AF129872）的阳性克隆由 1 468 bp组成,开放阅读框（open reading frame, ORF）长约429 bp,编码142个氨基酸。起始密码ATG位于第694 bp,终止密码位于第1 122 bp,polyA位于1 245~1 250 bp。核苷酸同源性分析表明,sp18 cDNA的10~651 bp与人视神经Hr44的532~ 1 173 bp、sp18 cDNA的10~816 bp、864~1 444 bp与牛视神经Hr44的1 408~2 208 bp、2 250~2 309 bp的cDNA序列有很高的同源性, 高达98%。推测sp18基因可能是生殖系统存在的一种新基因。sp18编码蛋白的理论分子量约为15.7 kD,有8个N-糖基化位点和12个O-糖基化位点,亲水性分析表明sp18多肽是一种精子跨膜蛋白,跨膜区位于第17~33氨基酸处。将sp18 cDNA亚克隆到原核表达载体pET-30a(+),在E. coli BL21（DE3）中得到诱导表达,其表观分子量约为16.5 kD,表达量约占菌体总蛋白的32%。Western blot分析表明sp18 mAb能识别重组的sp18膜蛋白,表明重组蛋白具有免疫原性,为进一步研究sp18基因的功能打下了基础。