大丽花花粉活力及离体萌发研究

为筛选大丽花花粉活力有效的测定方法,了解大丽花不同品种的花粉活力,以大丽花栽培品种为试验材料,采用4种方法检测大丽花花粉活力,在此基础上,采用单因素试验和正交设计试验分别对大丽花花粉的离体萌发培养条件及培养基组分进行优化,得到最优方案后进一步检测、比较不同品种之间的花粉活力。研究结果显示,TTC染色法不能使花粉着色,I₂-KI和孢粉染色法不能有效区分有活力和无活力花粉,离体萌发法效果良好,可准确直观地反映大丽花花粉活力状况, 是测定大丽花花粉活力的有效方法。当培养条件为pH 6.0、温度25℃、培养时间2.5 h时,花粉萌发率最高。培养基组分对大丽花花粉萌发的影响程度依次为PEG>蔗糖>硼酸,实际最佳处理组合为A₃B₄C₂,即PEG4000 25 g/L、蔗糖60 g/L、硼酸50 mg/L的处理组合下,大丽花花粉萌发率最高达62.1%。采用上述获得的最优方案检测22个大丽花品种的花粉活力,花粉萌发率为11.75%~78.72%,不同品种的花粉萌发率差异大,其中,‘兰花公主’的花粉萌发率最低,‘波彻儿’最高。大丽花品种的花粉活力多样性丰富,所测定的22个大丽花品种有14个品种正常可育,杂交时可用作父本;8个品种为半不育或低不育,杂交时更适合作母本。     

川乌头F3′5′H基因的cDNA克隆与表达分析

利用RT-PCR结合RACE技术,从川乌头(Aconitum carmichaeli Debx.)花朵中克隆到1个类黄酮-3′,5′-羟基化酶基因的cDNA全长序列,全长1720bp,包含1个编码506个氨基酸的开放阅读框,命名为Ac-F3′5′H(GenBank登录号:JN635708)。序列分析表明Ac-F3′5′H编码的氨基酸序列中包含有已确定的保守基序,包括CYP基序、I螺旋区和血红素结合区等。氨基酸序列比对显示Ac-F3′5′H与其它物种的F3′5′H有很高的序列相似性。以川乌头18SrRNA基因(FJ748878)为内参,通过半定量RT-PCR对Ac-F3′5′H的时空表达模式进行了分析,结果显示Ac-F3′5′H随花朵发育,表达量呈递增趋势,并且在正在开放的花朵中达到最高,而在根、茎、叶中不表达,推测该基因可能在调节川乌头蓝色花朵形成中发挥作用。     

OT百合新品种‘火凤凰’和‘金龙’

 ‘火凤凰’亲本为OT百合‘OT11’和东方百合‘D36’,‘金龙’亲本为东方百合‘D38’和OT百合‘OT11’,两个品种均是由切割柱头授粉结合胚挽救技术获得的OT百合切花新品种。‘火凤凰’花瓣黄红复色,内外瓣中下部红色,中上部黄色,花形紧凑。‘金龙’花黄色,生长势强,生育期短。两个品种耐热性良好,适种地区广泛。     

百合抗镰刀菌资源鉴定及抗病相关基因筛选

 对20个百合种质资源的组培苗进行尖孢镰刀菌百合专化型（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）室内接种鉴定;以筛选出有较好抗性的大花卷丹（Lilium leichtlinii var. maximowivzii Baker）为材料,以镰刀菌诱导12和24 h的作为处理组,无菌水处理作为对照组,采用SMART技术构建了百合经镰刀菌诱导后的抑制差减正、反向两个SSH文库。在正向文库中选择了4个抗病相关的ESTs,用半定量RT-PCR分析这些ESTs的表达情况。经接种鉴定,20个百合种质资源中,对百合镰刀菌表现高抗的有3个,中抗9个,感病8个;SSH文库ESTs片段大小为200 ~ 2 000 bp。依据斑点杂交结果,从正向SSH文库中挑取50个单克隆进行测序和比对分析,得到6种共10条抗病相关EST。通过半定量RT-PCR对其中的4条抗病相关ESTs：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase,S/TPK）、谷胱甘肽S–转移酶（glutathione S-transferase,GST）、过氧化物酶（peroxidase,POD）和亲环素（cyclophilin,CYP）的表达情况进行了分析,证明它们在一定程度上都受百合镰刀菌诱导而表现上调表达,推测其可能参与了百合对镰刀菌枯萎病的抗病过程。     

西南鸢尾花色变异实时定量PCR内参基因的筛选与验证

为筛选适用于不同花色西南鸢尾花色合成途径相关基因表达分析的内参基因,本研究根据西南鸢尾及其白花变型白花西南鸢尾花蕾组织的转录组测序数据,筛选了6个常用内参基因(ɑ-TUB、β-TUB、AQP、ACT、GAPDH、UBQ),同时以百合18S做为对照内参基因,在西南鸢尾及其白花变型白花西南鸢尾的花蕾组织中,分别通过反转录PCR(RT-PCR)初筛和RT-qPCR检测表达量,并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件对7个候选内参基因的稳定性进行评价。RT-PCR初筛结果显示,7个候选内参基因引物的特异性均较好,在6个样品间没有明显差异;RT-qPCR分析表明,7个候选内参基因的表达量存在一定差异,其中18S表达量最高,UBQ最低;geNorm、NormFinder和BestKeeper分析结果表明,ACT表现最稳定,最适合做为内参基因,β-TUB相对稳定性最低;以Actin为内参对西南鸢尾类黄酮/花青素和类胡萝卜素2类色素合成途径中部分相关基因的RT-qPCR分析结果与转录组测序结果相一致。本研究为鸢尾属植物花色素合成相关基因表达分析内参基因的筛选以及鸢尾属植物资源利用和花色育种研究提供了理论参考。     

泸定百合泛素基因(Ls-Ub)的克隆及表达分析

泛素(ubiquitin,Ub)与植物对外界的多种胁迫反应相关。为了研究百合中的泛素基因与百合抗镰刀菌病害的关系,本研究根据百合尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.lilii)诱导的泸定百合(Lilium sargentiae Wilson)SSH文库中筛选到的Ub EST序列,通过RACE结合RT-PCR技术从泸定百合中克隆到1个Ub基因全长c DNA序列,该基因全长996 bp,包含一个长690 bp编码229个氨基酸的开放阅读框,命名为Ls-Ub(Gen Bank登录号:KY996308)。序列比对分析结果表明Ls-Ub与其它物种Ub基因编码的氨基酸序列具有高度的相似性。Q-PCR结果显示百合镰刀菌诱导后Ls-Ub强烈上调表达,且明显高于水处理对照的表达水平。推测该基因可能与百合抗镰刀菌病害相关。本研究将为揭示百合抗镰刀菌枯萎病的分子机制提供一定理论依据。     

利用Affymetrix芯片分析DON诱导抗赤霉病小麦品种望水白的基因表达谱

中国小麦地方品种望水白不但高抗赤霉病,而且其籽粒中DON(脱氧雪腐镰刀菌烯醇,被认为是赤霉病的致病因子)含量也低.为了研究望水白低DON含量的分子机制,利用Affymetrix小麦基因芯片对望水白受DON诱导调控的基因进行高通量的检测,以DON诱导后12 h和24 h混合样品作为处理组,水处理做为对照.总共检测到差异表达的基因1 114个,其中上调表达的基因有949个,下调基因165个.在上调表达基因中,推断有功能的基因涉及转录因子、信号蛋白、着丝粒蛋白以及与病程相关的基因,如:腺苷三磷酸结合盒转运蛋白,谷胱甘酞转移酶、细胞色素P450酶、苯丙氨酸解氨酶、葡萄糖基转移酶以及抗病蛋白等.对上调表达中的部分基因进行RT-PCR分析,证实它们都受DON诱导上调表达,与芯片检测结果吻合.     

泸定百合过氧化氢酶(Ls-Cat1)基因的克隆及表达分析

过氧化氢酶(CAT)参与植物的多种胁迫反应。为探究百合中的CAT基因与百合抗镰刀菌病害的关系,根据百合尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)诱导的泸定百合(Lilium sargentiae Wilson)SSH文库中筛选到的CAT基因中间序列片段,通过RACE结合RT-PCR技术从泸定百合中克隆到1个CAT基因全长c DNA序列,该基因全长1 743 bp,包含1个1 479 bp的开放阅读框,编码492个氨基酸,命名为LsCat1(Gen Bank登录号:KU355272)。序列比对分析表明,Ls-Cat1编码的氨基酸序列中包含已确定的CAT保守基序。系统进化树分析显示,Ls-Cat1与其它物种CAT基因编码的氨基酸序列具有较高的相似性。qPCR结果显示,Ls-Cat1经百合镰刀菌诱导后明显上调表达,推测该基因可能与百合抗镰刀菌病害相关。本研究结果为揭示百合对镰刀菌枯萎病的抗病分子机制提供了一定的理论依据。     

钝裂银莲花花色素合成相关基因qRT-PCR内参基因的筛选

为了筛选适合于钝裂银莲花类黄酮/花青素合成途径中相关基因qRT-PCR表达分析时的内参基因,根据钝裂银莲花蓝/白不同花色花器官组织的转录组测序结果,选取了多聚泛素酶基因(polyubiquitin,UBQ)、微管蛋白基因(β-tubulin,β-TUB)、水通道蛋白基因(aquaporin,AQP)、肌动蛋白基因(actin,ACT)、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、组蛋白基因(histone,HIS)、转录延伸因子基因(elongation factor 1-β,EF-1β)和60S核糖体蛋白基因(60S ribosomal protein L13-1,RPL13)等8个常用内参基因作为候选基因,以钝裂银莲花的叶片、茎杆和蓝/白色花器官等不同组织为试验材料,通过qRT-PCR检测这8个候选内参基因的表达情况,利用geNorm、NormFinder和BestKeeper等软件对其稳定性进行分析评价。结果表明:8个候选内参基因中,UBQ表现最稳定,而β-TUB相对稳定性最差。以最稳定的UBQ为内参对钝裂银莲花类黄酮/花青素合成途径中16个相关基因表达情况进行qRT-PCR分析,结果与前期转录组测序结果一致。UBQ为钝裂银莲花花色素合成途径相关基因表达分析的最适内参基因。