利用改进的Oligo-Capping法构建甘蔗茎全长cDNA文库

Oligo-Capping法是目前全长cDNA文库构建的重要方法之一.笔者在引进、消化和吸收的基础上,通过对特异引物和接头序列的设计,及cDNA扩增反应条件的优化,对该方法进行了一些切实可行的改进,形成了一套简便易行的技术体系.利用本研究中改进的Oligo-Capping法,成功地构建了甘蔗茎全长cDNA文库.综合评价结果表明,本研究中所构建的甘蔗茎全长cDNA文库的库容大于2.5x106cfu,重组率为91%,全长率高达88.9%.本文库的构建为进一步甘蔗茎中全长基因的克隆和功能基因的表达分析奠定了基础.     

甘蔗锌指蛋白基因的克隆和表达分析

在对甘蔗(Saccharum officinarum)叶片全长cDNA文库测序的基础上,获得1个编码锌指蛋白基因的全长cDNA序列,命名为Sc-zf.生物信息学分析表明,该基因全长1 189 bp,编码171个氨基酸,具有zf-A20和zf-AN1两个锌指结构域;构建了包含Sc-zf开放读码框的原核表达载体,经IPTG诱导,目的基因原核表达产物大小约为18.3 kD;经定量PCR技术分析,该基因在黑穗病菌(Ustilago scitaminea)、水杨酸(SA)、H2O2、NaCl和PEG胁迫下表达特性不同,受到黑穗病菌和NaCl的诱导,PEG的抑制,但也受SA和H2O2的影响.     

甘蔗Lea基因cDNA全长克隆及表达特性

本研究从甘蔗叶片全长cDNA文库中获得了甘蔗Lea基因cDNA全长序列,命名为Sc-Lea。该基因全长921 bp, 含有一个495 bp编码164个氨基酸的的开放阅读框(open reading frame, ORF), 5’端非编码区（untranslated region,UTR）长64 bp,3’端UTR长362 bp,且在3’端UTR有明显的polyA结构, 起始密码子周围为CCCCAGCCATGGC, -3、+4位为G,C是该段序列的偏好碱基,符合Kozak规则。目的基因原核表达产物分子量大小约为17.9kD。同时还利用定量PCR技术研究了该基因在水杨酸（SA）、H2O2 PEG和NaCl等四种外源非生物胁迫因子作用下的表达特性。研究结果表明,甘蔗Lea基因的表达,会受到PEG和NaCl的强烈诱导,以及H2O2的抑制,同时也会受SA的影响。推测甘蔗Lea基因在甘蔗的抗旱和抗盐机制中发挥作用。