鸡新城疫病毒F基因与鸡白介素-2(IL-2)基因在真核载体中串连表达及免疫原性

为了探索鸡白介素-2(IL-2)对鸡新城疫病毒(NDV)F蛋白免疫效果的增强作用,本研究通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)利用连接子(G2SG3S)将鸡IL-2基因和鸡NDV F基因串连,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了表达质粒pcDNA-IL-2-F.通过脂质体介导DNA瞬时转染法,将重组质粒pcDNA-IL-2-F和pcDNA-F分别转染鸡胚成纤维细胞,Western blot验证表明,pcDNA-IL-2-F和pcDNA-F均能瞬时表达F蛋白,表达蛋白分别为76.0和59.6 kD,表达蛋白的大小与预期一致并具有抗原性.将表达质粒免疫SPF鸡(Gallus domedticus),6d后开始用ELISA方法检测NDV的特异抗体,免疫20 d后,用F48E9进行攻毒.结果显示,免疫pcDNA-IL-2-F的鸡群产生的抗体水平(P＜0.05)高于混合免疫pcDNA-IL-2和pcDNA-F,高于免疫pcDNA-F的鸡群,但比免疫Lasota组的抗体水平要低.攻毒试验说明免疫pcDNA-IL-2-F组比免疫其他质粒组保护率高,这说明串连表达的免疫效果要好于二者的联合使用,为病毒病疫苗的研制提供了思路.     

运送鹅源新城疫病毒DNA疫苗的减毒沙门氏菌及其免疫原性

根据GenBank中发表的新城疫病毒融合蛋白(F)基因序列,设计一对引物,通过RT-PCR扩增出鹅源新城疫病毒分离株JS5F基因,约1700bp,测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1,得到候选DNA疫苗pVAX1-F0将pVAX1-F转化减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)X4550,获得运送DNA疫苗的重组沙门氏菌X4550(pVAX1-F).以2×108CFU/只的剂量两次免疫CD1小鼠,免疫小鼠可以检测到特异性针对NDVF蛋白的血清抗体应答,X4550(pVAX1-F)免疫组抗体水平显著高于X4550(pVAX1)组(P＜0.05),表明该运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌系统在体内能够成功释放所携带的质粒,并能够刺激机体产生免疫应答.     

C3d对减毒沙门氏菌介导的NDV DNA疫苗诱导的特异性体液免疫应答的增强作用

采用PCR技术从重组质粒pVAX1-F扩增出新城疫病毒F48E8株的融合蛋白(F)基因,将其克隆入含有3 拷贝C3d 编码基因的pTR-C3d3质粒中,获得重组质粒pTR-F-C3d3。将F-C3d3基因片段从pTR-F-C3d3中切出,克隆入真核表达质粒pVAX1中,获得重组真核表达质粒pVAX1-F-C3d3。将pVAX1-F-C3d3转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建成功携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pVAX1-F-C3d3)。重组菌分别以1×109 CFU的剂量两次口服免疫1日龄SPF鸡,结果显示,SL7207(pVAX1-F-C3d3)激发产生的血清抗体效价与SL7207 (pVAX1-F)免疫组之间存在显著性差异(P < 0.05)。SL7207(pVAX1-F-C3d3)免疫组的小肠黏膜抗体效价高于SL7207(pVAX1-F)免疫组,但两者间差异不显著(P > 0.05)。提示C3d可增强减毒沙门氏菌介导的NDV DNA疫苗诱导的特异性体液免疫应答水平,这为提高基于减毒沙门氏菌的NDV基因工程疫苗的免疫效果提供了新的途径。     

高致病性猪蓝耳病弱毒疫苗与灭活疫苗体液免疫效果比较

[目的]分析比较高致病性猪蓝耳病弱毒疫苗和高致病性猪蓝耳病灭活疫苗体液的免疫效果。[方法]随机分为试验A组、B组和对照组,分别给予高致病性猪蓝耳病弱毒疫苗接种、高致病性猪蓝耳病灭活疫苗接种和生理盐水,观察三组仔猪接种28 d、60 d、90 d时的S/P值和PRRS抗体阳性率。[结果]试验A组仔猪免疫后28 d时S/P值达到2.0以上,上升速度较快,且免疫28 d后,试验A组的PRRS抗体检测阳性率为96.67%,明显高于试验B组,组间差异具有统计学意义。[结论]高致病性猪蓝耳病弱毒疫苗的抗体水平和抗体上升速度较快,免疫作用较强,在使用时可以优先考虑弱毒疫苗。     

PRRSV GP5和M蛋白重组腺病毒对猪的安全性和免疫效力

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP5 重组腺病毒(recombinant Adenovirus-GP5,rAd-GP5)和M蛋白重组腺病毒(rAd‐M)分别接种4只30日龄PRRSV阴性断奶健康仔猪，结果为仔猪接种后2周内体温和食欲正常，猪血液、鼻塞、粪便和猪舍环境中重组腺病毒及其野生型腺病毒检测均为阴性。同时，将rAd‐GP5、rAd-M、rAd-GP5+M (rAd-GP5和rAd-M,V/V=1)和PRRSV-Resp弱毒株分别接种4只30日龄PRRSV阴性仔猪，不同时间检测PRRSV抗体，结果为免疫后14和45 d可检出PRRSV ELISA抗体和中和抗体；免疫后60～90 d，rAd-GP5和rAd-M免疫组ELISA抗体滴度均达1∶2400以上，与PRRSV‐Resp弱毒免疫组相似，而中和抗体滴度达1∶6以上，低于PRRSV-Resp弱毒免疫组；rAd-M免疫组ELISA抗体和中和抗体滴度则低于rAd‐GP5免疫组。rAd-GP5和rAd-M混合免疫组ELISA抗体达1∶4800,其中和抗体滴度与其单独免疫组相似。15只仔猪免疫后28 d进行攻毒保护试验，结果为重组腺病毒免疫猪攻毒后3 d平均体温为39.5℃,病毒血症和排毒时间仅为2周，与PRRSV-Resp弱毒免疫组相似，而空白对照组病毒血症和排毒时间至少60 d。攻毒后7～14 d，rAd-GP5和rAd‐M免疫组ELISA抗体和中和抗体水平明显升高。研究表明rAd-GP5和rAd-M重组腺病毒具有较好的安全性，均可诱导猪体产生较好的免疫反应，两者具有明显的协同免疫作用。     

表达伪狂犬病毒gC糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果研究

通过双酶切将伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)Fa株gC囊膜糖蛋白基因片断亚克隆到5型腺病毒AdMax系统穿梭质粒pDC316中，得到pDC316-gC。用此质粒与腺病毒DNA辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染293细胞,初步成功包装出重组腺病毒Adv-gC。进一步通过PCR鉴定和病毒空斑纯化，得到纯的高效价Adv-gC病毒液。间接免疫荧光实验证明此重组病毒能表达PRV gC蛋白。该病毒经肌肉免疫BALB/c小鼠,结果表明能诱导小鼠产生特异的体液和细胞免疫反应，即针对gC蛋白的总抗体IgG、针对PRV的中和抗体和足垫迟发型超敏反应DTH。攻毒实验表明，此重组病毒能提供100％的免疫保护，而对照组为0%。表达PRV gC基因复制缺陷型重组腺病毒的构建及其免疫效果的初步测试，为研制PRV新型活载体疫苗奠定了基础。     

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与生长抑素融合表达质粒(pGM-CSF/SS)的构建及其对小鼠的免疫

从猪真核表达质粒pGM-CSF通过PCR扩增出猪GM-CSF基因的编码序列,将GM-CSF基因亚克隆到生长抑素真核表达质粒pcS/2SS中,构建GM-CSF与生长抑素(SS)的融合表达质粒pGM-CSF/SS,酶切鉴定和DNA测序证实重组的融合表达质粒pGM-CSF/SS构建正确。选择30只小鼠,随机分为三组,其中1组为对照组,2组和3组分别肌肉注射pcS/2SS和pGM-CSF/SS,研究pGM-CSF/SS对小鼠的免疫效果。结果表明：GM-CSF可增强小鼠脾脏淋巴细胞的增殖能力,以pGM-CSF/SS组增殖能力最强,分别比对照组和pcS/2SS提高8.4%（P＜0.05）。肌肉注射pcS/2SS和pGM-CSF/SS免疫小鼠均能有效激发免疫系统,产生较强的免疫应答,与对照组相比,生长抑素抗体P/N值都有所提高,且随着免疫时间的延长,呈现不断增高的趋势;pGM-CSF/SS组P/N在试验的各个时期均高于pcS/2SS组。阳性鼠的比例以肌注pGM-CSF/SS为最高,达60%,pcS/2SS肌注组为30%,对照组没有出现阳性鼠;这些结果证明,GM-CSF对生长抑素DNA疫苗有一定的免疫增强作用,为研究GM-CSF基因对生长抑素DNA疫苗的免疫增强作用提供了理论基础。     

鸡γ干扰素对H5亚型禽流感疫苗的免疫增强作用

利用表达鸡γ干扰素的重组鸡痘病毒(rFPV-IFN-γ)与表达H5亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒(rFPV-HA)或灭活疫苗联合应用，接种SPE鸡、无母源抗体商品鸡和含有母源抗体商品鸡，研究鸡γ干扰素的免疫增强作用。结果发现，rFPV-IFN-γ和rFPV-HA联合应用诱导的HI抗体应答水平同rFPV-HA单独免疫相近；rFPV-IFN-γ和灭活疫苗联合应用后HI抗体应答水平略低于灭活疫苗单独免疫组。攻毒后，对于SPF鸡和无母源抗体商品鸡，rFPV-IFN-γ与rFPV-HA或灭活疫苗联合免疫诱导的保护率同相应疫苗单独免疫相当，均为95％～100％；对含有母源抗体的商品鸡，10^6PFU的rFPV-HA与10^5PFU的rFPV-IFN-γ联合免疫组保护率(33．5％)高于rFPV-HA单独免疫组(11．4％～16．8％)，而其它剂量组合的rFPV-HA与rFPV-IFN-γ联合应用不能提高免疫保护效力；rFPV-IFN-γ与灭活疫苗联合免疫含母源抗体商品鸡诱导的保护率同灭活疫苗单独免疫组相近。结果表明，rFPV-IFN-γ不能促进疫苗诱导的HI抗体应答；适当剂量组合的rFPV-HA与rFPV-IFN-γ联合免疫含有母源抗体的商品鸡，可提高免疫保护效力，发挥免疫增强作用。     

重组E2蛋白-乳胶凝集试验检测猪瘟病毒血清抗体

人工合成4条两两互补的DNA序列,经磷酸化和退火后与经BglⅡ酶切的pET-E2载体连接,得到pET-E2HA重组质粒.该质粒除表达E2蛋白A/D抗原区外,还表达3个串联的人流感病毒(Human influeoza virus)血凝素表位.重组质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),用IPTG诱导表达.利用纯化后的表达产物与流感病毒血凝素单抗及乳胶建立了诊断猪瘟抗体水平的乳胶凝集试验.利用盐酸胍溶解包涵体并过His·Bind柱,获得纯化的重组蛋白.研究结果表明,乳胶凝集方法具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、价格低廉且可用于现场检测等优点,是一种适合基层兽医单位用于猪瘟病毒(Classical swinefever virus,CSFV)血清抗体检测的新方法.     

HA基因密码子及表达载体优化的H5亚型禽流感DNA疫苗免疫保护效果比较

为评估HA基因密码子优化及不同表达载体对H5亚型禽流感DNA疫苗免疫效果的影响，pCIHA5、pCAGGHA5 、pCIoptiHA5和 pCAGGoptiHA5分别以100 和10 μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡，4周后分别用100 LD50的高致病力禽流感病毒(HPAIV) A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]鼻腔途径进行攻击，观察发病与死亡情况，分别于攻毒后第3、5和7无采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况，同时检测免疫后、攻毒前及攻毒后血清HI抗体、AGP抗体的动态变化，对4种疫苗单次免疫的免疫保护效果进行比较评估。结果表明，100 μg剂量组中， pCAGGoptiHA5和pCAGGHA5 均可对免疫鸡形成100％完全保护（不发病、不致死和不排毒），pCIoptHA5(75%) 和pCIHA5(50%)仅可形成部分免疫保护；10 μg剂量免疫组中， pCAGGoptiHA5和pCAGGHA5 可对免疫鸡形成100％的保护（不发病和不致死），pCIoptiHA5可形成对免疫鸡的部分免疫保护(75%)，而pCIHA5则基本不能形成免疫保护。结果表明，HA基因密码子的优化以及鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平，增强免疫保护效果同时证明，通过密码子和载体的优化，可使H5亚型禽流感DNA疫苗有效免疫保护剂量降低至10 μg，其推广应用已具备充分的经济可行性。pCAGGoptiHA5作为免疫效果良好、成本低廉的优化DNA疫苗，有望成为预防H5亚型高致病力禽流感的高效、安全新型基因工程疫苗。     

含CSFV T细胞表位的猪细小病毒样颗粒的表达及小鼠免疫试验

将纯化的重组子pM-VP2-E290阳性质粒利用杆状病毒表达系统进行表达,表达产物应用SDS-PAGE、Western blot和Dot ELISA进行分析,确定所表达的蛋白分子量大小约为67kD,且具有天然蛋白的抗原特异性。应用免疫电镜对表达产物进行观察,可见到细小病毒样颗粒。病毒样颗粒在无免疫佐剂参与的情况下,免疫6～8周龄的BALB/c小鼠,同时设猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)的灭活疫苗免疫组及磷酸盐缓冲液(PBS)接种组作为参比对照,检测小鼠的细胞免疫和体液免疫学指标。结果表明,表达蛋白所形成的细小病毒样颗粒,不仅能诱导小鼠机体产生抗猪瘟病毒的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,还能刺激小鼠产生高效价的抗猪细小病毒的特异性抗体,而且机体所产生的抗体效价显著高于灭活疫苗对照组。     

含CSFV T细胞表位的猪细小病毒样颗粒的表达及小鼠试验免疫研究

摘要：纯化的重组子pM-VP2-E290阳性质粒，与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞sf9，通过同源重组，形成具有感染活性的重组杆状病毒，并利用重组病毒的LacZ表型进行噬斑纯化。纯化后的高效价重组杆状病毒在昆虫细胞中进行表达，表达产物应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、免疫印迹（Western-blot）和免疫酶斑点技术（Dot-ELISA）进行分析，确定所表达的蛋白分子量大小约为67KD，且具有天然蛋白的抗原特异性。应用免疫电镜对表达产物进行观察，可见到细小病毒样颗粒。病毒样颗粒在无免疫佐剂参与的情况下，免疫6-8周龄的BALB/c小鼠，同时设PPV的灭活疫苗免疫组及PBS接种组作为参比对照，检测小鼠的细胞免疫和体液免疫学指标。结果表明，表达蛋白所形成的细小病毒样颗粒，不仅能诱导小鼠机体产生抗CSFV的特异性CTL反应，还能刺激小鼠产生高效价的抗PPV的特异性抗体。而且机体所产生的抗体效价显著高于灭活疫苗对照组。     

非洲猪瘟病毒生物学特性及在猪肉生产中的防控措施研究

非洲猪瘟是一种烈性外来疾病,不属于人畜共患病,但会造成大量猪死亡,自中国首次发现疫情以来,多个地区相继暴发疫情,扑杀大量生猪,给生猪养殖业带来巨大的损失。目前还没有针对非洲猪瘟的特效药和有效疫苗,还需要进一步的研究。该文从非洲猪瘟病毒的生物学特性、防控难点以及在猪肉食品生产中的防控方法等方面进行概述,提出食品企业应做好应对措施,在食品生产过程中全面防控,增强从业人员的防控意识,防止非洲猪瘟病毒通过猪肉产品在市场中传播,旨在为抑制非洲猪瘟的扩散和食品企业对非洲猪瘟病毒的防控提供参考。     

广西霞烟鸡抗马立克氏病选育报告

鸡的马立克氏病(MD)抗病育种是防制 MD 的一个新方向。经三年多的研究,采用马立克氏病病毒(MDV)强毒株攻击霞烟鸡1日龄雏鸡,选留幸存者进行繁殖,其后代未经MD 疫苗接种,以自然感染进行选择,并结合后裔攻毒测定法进行抗 MD 的选育。至三世代时,鸡抗 MD 的能力已大为提高。三世代雏鸡1日龄攻毒后,10周龄时 MD 总保护率为74%,与对照组的35%有非常显著的差异(P<0.001),其中自然死亡鸡的 MD 肿瘤阳性率为16%,与零世代的48.1%有非常显著的差异(P<0.001).与对照组的37.5%亦有显著差异(P<0.05);1日龄经火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗免疫,14日龄以 MDV 强毒攻毒后,三世代10周龄时对 MD总保护率为96.9%,而对照组为87%。抗病核心群目前已有基本种鸡500羽。     

麻鸭白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆、表达及生物学活性

根据GenBank发表的鸭IL-18 cDNA基因序列，设计、合成一对引物，直接从成年麻鸭脾淋巴细胞提取总RNA，经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增麻鸭IL-18成熟蛋白基因，扩增产物进行了T-A克隆、测序，获得了麻鸭IL-18成熟蛋白基因全序列，其大小为513 bp，编码一条由170个氨基酸残基组成的多肽。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pQE30，构建重组表达质粒pQE30-mDuIL18，转化大肠杆菌M15，并用IPTG 诱导。重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到相对分子质量为19.76 Ku的重组蛋白，Western blotting证实该重组蛋白可与兔抗鸡IL-18血清发生特异性反应。表达产物以包涵体形式存在，包涵体经变性、复性处理后进行鸭T淋巴细胞转化试验表明，重组蛋白具有明显促进鸭T细胞转化的生物学活性。用mDuIL-18（150 ng or 200 ng /鸭）和AIV 疫苗免疫鸭2周后，HI抗体平均滴度达到7.5–7.7 log 2 ，而只用AIV 疫苗免疫和用mDuIL-18（100 ng /鸭）和AIV 疫苗免疫的HI抗体平均滴度仅达到6.3–6.6 log 2，表明mDuIL-18提高AIV灭活油乳苗诱导的免疫应答。这为研究鸭IL-18结构和生物学应用，以及研制新型免疫佐剂和免疫调节剂奠定基础。     

鸡传染性鼻炎自家油乳苗免疫的研究

本试验用从广西分离的二株引起鸡传染性鼻炎的副鸡嗜血杆菌 ( H aemophilus paragallinarum,H.pg) GX 97、GX 981株研制成自家油乳苗 ,进行后备鸡免疫试验 ,免疫后 3、 6、 9和 1 2个月进行免疫抗体检测和攻毒试验。结果表明 ,免疫后 6个月 90 %免疫鸡的抗体滴度在 1∶ 640以上 ,9个月抽样攻毒有 75%～ 80 %的鸡获得保护。大田免疫试验也获得了良好的效果。证明自家油乳苗免疫接种也是防制该病的一个有效途径。     

Construction of Canine parvovirus DNA Vaccine and Detection of Its Inoculated Mice

用PCR方法扩增犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV) 貉分离株(PV/貉/CC/1/86)的VP2蛋白基因，并将其克隆入pMD18-T，命名为pTCPV，进行测序分析。结果除发现300G→S突变外，还发现32G→D突变。然后将PV/貉/CC/1/86 VP2蛋白基因克隆入真核表达载体pVAX1的CMV启动子的下游，构建了CPV核酸疫苗的真核表达质粒pVCPV。pVCPV转染BHK-21细胞能够表达CPV VP2蛋白，所表达的CPV VP2蛋白能够与抗CPV的阳性抗体发生特异性的抗原-抗体反应。用pVCPV免疫接种小鼠，用ELISA和微量中和试验检测免疫小鼠抗CPV抗体阳性，但是没有检测到抗CPV HI抗体； pVCPV免疫小鼠的脾淋巴细胞对特异性和非特异性抗原刺激均有明显的增殖。结果表明, pVCPV免疫接种小鼠能够诱导机体产生抗CPV的特异性体液免疫和细胞免疫。     

SjFer与GM-CSF共表达核酸疫苗对小鼠免疫保护效果的研究

【摘要】：目的 探讨粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)对日本血吸虫铁蛋白核酸疫苗抗攻击感染免疫保护力的影响。 方法 以pGEX-5x-3/SjFer为模板，PCR扩增SjFer，以小鼠总RNA为模板RT-PCR扩增GM-CSF。常规方法构建SjFer/pc、GM-CSF-SjFer/pc及GM-CSF/pc。85只雌性供试小鼠随机分为5组，即生理盐水、pcDNA3.0、GM-CSF/pc、SjFer/pc、GM-CSF-SjFer/pc组，每组小鼠17只。于0，2，4周注射纯化质粒50 ug/次到每只小鼠左后肢股四头肌。每次免疫前尾静脉采血收集血清，ELISA检测血清内特异性IgG水平。末次免疫后一周每组随机选5只小鼠无菌取脾，MTT法检测淋巴细胞增殖情况。末次免疫后两周每只经腹部感染(40±1)条尾蚴，45 天后宰杀小鼠，以观察减虫率和减卵率。结果 SjFer/pc和GM-CSF-SjFer/pc均可诱导小鼠血清内特异性IgG水平。SjFer/pc和GM-CSF-SjFer/pc诱导小鼠产生的减虫率分别为36.27 ％和39.22 ％，减卵率分别为36.10 ％和49.04 ％。结论 GM-CSF对SjFer/pc的免疫保护力有增强作用。