Trx及其抑制因子TXNIP基因在发育不同阶段牛体外胚胎中的转录与表达

【目的】研究Trx及其抑制因子TXNIP基因在牛卵母细胞及不同发育阶段体外受精胚胎中的表达变化.【方法】采用实时荧光定量PCR方法,检测牛GV期卵母细胞、MⅡ期卵母细胞、受精卵、2-4细胞胚胎、8-16细胞胚胎、桑椹胚和囊胚中Trx1、Trx2和TXNIP基因mRNA的相对表达量.【结果】Trx1和Trx2基因在GV期卵母细胞和不同发育阶段的胚胎均有不同程度的表达.GV期卵母细胞Trx1mRNA表达量最高,随着卵母细胞的成熟及受精后胚胎的发育逐渐降低,囊胚期胚胎表达量又急速升高.Trx2基因在受精前的卵母细胞中高表达,受精后表达量逐渐下降,囊胚期胚胎Trx2 mRNA的表达量最低.内源性抑制因子TXNIP基因在2-4细胞胚胎阶段之前都是高表达,从8-16细胞胚胎阶段表达下降,在囊胚期胚胎表达量最低.【结论】牛卵母细胞及附植前胚胎自身的抗氧化能力在发育的不同阶段可能有所不同,而Trx1、Trx2及TXNIP基因在卵母细胞和不同发育阶段胚胎中的表达模式可能起到了重要的调控作用.     

Trx及其抑制因子TcNIP基因在发育不同阶段牛体外胚胎中的转录与表达

[目的]研究Trx及其抑制因子TcNIP基因在牛卵母细胞及不同发育阶段体外受精胚胎中的表达变化.[方法]采用实时荧光定量PCR方法,检测牛GV期卵母细胞、MⅡ期卵母细胞、受精卵、2-4细胞胚胎、8-16细胞胚胎、桑椹胚和囊胚中Trx1、Trx2和TcNIP基因mRNA的相对表达量.[结果]Trx1和Trx2基因在GV期卵母细胞和不同发育阶段的胚胎均有不同程度的表达.GV期卵母细胞Trx1 mRNA表达量最高,随着卵母细胞的成熟及受精后胚胎的发育逐渐降低,囊胚期胚胎表达量又急速升高.Trx2基因在受精前的卵母细胞中高表达,受精后表达量逐渐下降,囊胚期胚胎Trx2 mRNA的表达量最低.内源性抑制因子TcNIP基因在2-4细胞胚胎阶段之前都是高表达,从8-16细胞胚胎阶段表达下降,在囊胚期胚胎表达量最低.[结论]牛卵母细胞及附植前胚胎自身的抗氧化能力在发育的不同阶段可能有所不同,而Trx1、Trx2及TcNIP基因在卵母细胞和不同发育阶段胚胎中的表达模式可能起到了重要的调控作用.     

父源性印记基因在牛早期胚胎中的表达

【目的】研究父源印记基因在牛早期胚胎中的表达模式。【方法】利用Real-time PCR技术,检测Gnas、Grb10和Xist这3个父源性印记基因在牛体外受精（In vitro Fertilization,IVF）和孤雌激活（Parthenogenetic Activation,PA）胚胎各发育阶段的表达情况。【结果】对于IVF和PA两种来源的牛胚胎,Gnas在胚胎各发育阶段的表达没有明显差异;Grb10在2细胞阶段的PA胚胎中的表达量明显高于在IVF胚胎的,但从4细胞阶段到囊胚阶段,Grb10在两种来源的牛胚胎中表达没有明显差异;从2细胞阶段到8细胞阶段,Xist在两种来源的牛胚胎中表达没有明显差异,但从16细胞期开始,Xist在PA胚胎中的表达明显高于IVF胚胎的表达量。【结论】对于牛IVF胚胎和PA胚胎,Gnas、Grb10和Xist从2细胞期到囊胚期都可以检测到表达,但表达模式不同。这3个父源性印记基因在牛胚胎发育过程中可能发挥着重要的作用。     

绵羊胚胎不同发育阶段及其组织中MicroRNA-483-5p表达分析

[目的]研究MicroRNA(miR)483-5p在中国美利奴羊胚胎不同发育阶段肾脏和脐带组织中的表达变化,以了解其在绵羊胚胎发育中的重要作用.[方法]选择中国美利奴羊胚胎不同发育时期(45、85、115和135 d 4个时期)肾脏和脐带组织为研究材料,采用半定量RT-PCR检测第45d绵羊胚胎不同组织中miR483-5p的表达;同时利用实时荧光定量PCR对miR-483-5p在绵羊胚胎不同发育阶段肾脏和脐带组织的表达变化进行实时检测.[结果]miR-483-5p在所检测的绵羊45 d胚胎各组织中广泛表达,其中以肌肉、心脏和肺脏组织表达丰度最高.实时荧光定量PCR结果显示,不同发育阶段绵羊胚胎肾脏和脐带组织miR -483-5p的表达具有明显的时空选择性.脐带组织miR-483-5p随着胚胎发育其表达量呈逐渐下降的趋势;肾脏组织miR-483-5p则是随着胚胎发育在第85 d其表达量下降到最低,其后在115和135 d其表达量又逐渐上升.不同发育阶段胚胎肾脏、脐带组织miR-483-5p的表达量呈显著性差异(P＜0.05).[结论]miR-483-5p在绵羊胚胎不同发育阶段肾脏或脐带组织中表达明显不同,表明其表达具有选择性;依据miR -483-5p表达的差异性及其涉及的生物学功能,推测miR-483-5p在绵羊脐带和肾脏组织中具有一定的调控作用.研究为进一步了解miR-483-5p在胚胎肾脏和脐带发育中的作用机制提供一定的理论依据.     

军牧1号公猪睾丸组织不同发育时期IGF-Ⅰ基因表达量研究

胰岛素样生长因子I是1种具有促进动物生长发育和繁殖的的肽类物质。动物要达到正常的性成熟和生殖能力则需要适当的IGF-Ⅰ水平。睾丸是雄性动物的重要生殖器官,为了探讨IGF-Ⅰ基因对于雄性动物睾丸组织发育的影响,本实验采用Real Time RT-PCR方法研究了IGF-Ⅰ基因在军牧1号白猪不同发育阶段睾丸组织的表达规律。结果表明:IGF-Ⅰ在不同发育阶段的睾丸组织中均表达,但是各个不同发育时期的表达量差异显著,六月龄时(性成熟阶段)表达量最高。本研究为深入探讨IGF-I基因调控动物繁殖机能以及在生产中如何提高家猪的繁殖力奠定了分子生物学基础。     

Vasa基因在斑马鱼不同发育时期的mRNA 表达分析

Vasa基因在果蝇中首次报道后,作为不同物种早期原始生殖细胞(PGC)标记基因被普遍接受.但对其研究都集中于早期胚胎,对性腺分化及成熟时期的Vasa表达及功能少有研究.RT-PCR结果显示,Vasa基因在整个发育阶段的表达量先上升再下降.荧光定量PCR结果显示,在同一发育时期,精巢、卵巢表达量基本一致,卵巢略高于精巢.mRNA原位杂交显示,Vasa基因早期在斑马鱼生殖干细胞特异表达,随后在精巢表达于精原细胞和初级精母细胞,在卵巢表达于Ⅲ、Ⅳ、V时相卵母细胞.研究结果有助于鉴定斑马鱼生殖干细胞和进一步研究性分化和逆转的细胞机制.     

慢病毒介导EGFP在小鼠胚胎的体外表达

为探讨3种感染方法对不同发育阶段胚胎中EGFP基因表达影响,利用透明带下注射法、胞质内注射法及透明带切口与慢病毒共培养法感染1-细胞期小鼠胚胎,分别提取以上3种方法感染慢病毒的不同发育阶段胚胎的EGPF基因,并以其为模板,扩增出630bp的EGPF基因片段。结果表明:慢病毒转染后在不同发育阶段的胚胎中,均扩增出EGFP目的片段(630bp)。当透明带下注射病毒时,90p L注射组(C组)和60p L注射组(B组)的EGFP基因阳性率显著优于30p L注射组(A组)(p0.05)。当胞质注射病毒时,C组显著优于其他组(p0.05),但胚胎发育的后期A组和B组差异不显著(p0.05)。透明带做切口的胚胎与含不同浓度慢病毒共培养时,从1-细胞期到4-细胞期胚胎为止组间差异不显著(p0.05),而胚胎发育的后期2×103cfu·μL~(-1)组和3×103cfu·μL~(-1)组均极显著优于1×103cfu·μL~(-1)组(p0.01),但2×103cfu·μL~(-1)组和3×103cfu·μL~(-1)组间差异不显著(p0.05)。透明带下注射慢病毒与胞质内注射慢病毒时,注射90p L(病毒滴度3×103cfu·μL~(-1))组的EGFP基因体外表达效果最好;透明带做切口的胚胎与含不同浓度慢病毒共培养时,在3×103cfu·μL~(-1)滴度培养液中培养的EGFP基因体外表达效果最好。     

黄体酮对斑马鱼胚胎生长发育轴基因表达的影响

为了研究黄体酮对水生生物的生态毒理效应,以斑马鱼为试验材料,研究黄体酮对斑马鱼早期胚胎发育阶段下丘脑-垂体-生长轴相关基因转录表达的影响。将斑马鱼胚胎分别暴露在含0、6、45和90 ng/L的黄体酮水环境中144 hpf(hours post fertilization,受精后)。结果显示:黄体酮在不同暴露时间点可以调节生长激素释放激素(ghrh)基因的转录表达,可以诱导生长激素(gh)和胰岛素生长因子1受体a(igf1ra)基因的转录表达,但抑制了胰岛素生长因子2(igf2a、igf2b)和胰岛素生长因子1受体b(igf1rb)基因的转录表达。此外,黄体酮暴露对生长激素受体(ghra、ghrb)和胰岛素生长因子1(igf1)基因的转录表达没有显著影响。试验表明黄体酮能够改变斑马鱼早期胚胎发育阶段下丘脑-垂体-生长轴相关基因的转录表达水平,进而对斑马鱼的生长发育具有潜在的危险。     

花绒寄甲HSP7O基因的特征与表达

为阐明热休克蛋白70(HSP70)在花绒寄甲(Dastarcus helophoroides)发育及雌雄成虫抵抗环境胁迫中的作用,利用实时荧光定量PCR技术分析了其在发育阶段和环境胁迫时的表达情况.从花绒寄甲转录组中获得3条HSP70基因,分别命名为D.hHSP69.09、D.hHSP70.11和D.hHSP7 1.88.发育阶段定量结果显示,3条HSP70在所有发育阶段均有表达,D.hHSP69.09在1龄幼虫期表达量最高;D.hHSP70.11和D.hHSP71.88在雄虫中表达量最高.在检测的成虫组织中,D.hHSP69.09和D.hHSP70.11在卵巢表达量最高;D.hHSP71.88在脂肪体中表达量最高.HSP70基因随温度升高(23℃升至44 ℃)、41℃下处理时间(0～ 270 min)延长、氧化剂浓度(0～ 70 mmol·L-1)的升高表达量先增加后减少,雌雄表达量差异较大.饥饿试验显示,雌雄虫表达模式不同;随饥饿时间延长,雄虫HSP70基因表达量有所降低,雌虫一定时间内有所上升.因此,花绒寄甲HSP70可能与不同发育期的转换、幼虫的蜕皮行为相关;HSP70对温度、氧化和饥饿胁迫的应激敏感程度和表达水平不同,能够有效应对高温、氧化、饥饿等环境胁迫.     

小鼠早期胚胎发育过程中胚胎发育相关功能基因mRNA的表达

运用半定量RT-PCR技术对候选功能基因在表达水平上检测不同交配组合胚胎早期发育过程中存在的差异,选取正常DDK品系小鼠和BALB/c品系小鼠,进行不同组合交配.选取8个功能基因EGF,EGF-R,TGF-α,Bcl-2,Mcl-1,C-myc,H-ras,LIF作为候选基因.结果表明,在2细胞期有EGF,Bcl-2,Mcl-1 3个基因进行表达,且3个基因表达差异显著(P＜0.05);在4细胞期有6个基因进行表达,EGF,Bcl-2,Mcl-1,EGF-R 4个基因表达差异显著(P＜0.05);在8细胞期有7个基因进行表达,EGF,Bcl-2,Mcl-1,EGF-R 4个基因表达差异显著(P＜0.05).杂交胚胎从8细胞期之后即桑葚期开始发生凋亡现象,因胚泡形成障碍,而导致胚胎早期死亡;候选基因中Mcl-1,Bcl-2,EGF,EGF-R基因在胚胎细胞中表达量差异显著(P＜0.05),并且与正常胚胎相比杂交胚胎中差异基因的表达均下调,这些基因表达水平的下调可能间接地引发早期胚胎致死现象.     

瘦蛋白受体基因在肉鸡不同组织中的表达差异

为了探讨瘦蛋白受体(OBR)基因在肉鸡不同组织中的表达差异,采用半定量RT-PCR和Northern blot方法检测OBR基因在不同发育阶段的肉鸡高脂系公鸡多种组织中的表达情况.结果表明:OBR基因在所检测的8种组织中均有表达,且表达量存在差异,其中大脑、心脏中的表达量高,并显著高于其他组织(p<0.05),腿肌和胸肌中的表达量较低.     

花绒寄甲HSP70基因的特征与表达

为阐明热休克蛋白70(HSP70)在花绒寄甲(Dastarcus helophoroides)发育及雌雄成虫抵抗环境胁迫中的作用,利用实时荧光定量PCR技术分析了其在发育阶段和环境胁迫时的表达情况。从花绒寄甲转录组中获得3条HSP70基因,分别命名为D.h HSP69.09、D.h HSP70.11和D.h HSP71.88。发育阶段定量结果显示,3条HSP70在所有发育阶段均有表达,D.h HSP69.09在1龄幼虫期表达量最高;D.h HSP70.11和D.h HSP71.88在雄虫中表达量最高。在检测的成虫组织中,D.h HSP69.09和D.h HSP70.11在卵巢表达量最高;D.h HSP71.88在脂肪体中表达量最高。HSP70基因随温度升高(23℃升至44℃)、41℃下处理时间(0~270 min)延长、氧化剂浓度(0~70 mmol·L-1)的升高表达量先增加后减少,雌雄表达量差异较大。饥饿试验显示,雌雄虫表达模式不同;随饥饿时间延长,雄虫HSP70基因表达量有所降低,雌虫一定时间内有所上升。因此,花绒寄甲HSP70可能与不同发育期的转换、幼虫的蜕皮行为相关;HSP70对温度、氧化和饥饿胁迫的应激敏感程度和表达水平不同,能够有效应对高温、氧化、饥饿等环境胁迫。     

数字差异显示法在猪早期胚胎基因表达分析上的应用

借助于NIH生物信息中心Unigene里的数字差异显示软件平台,分析了猪植入前后早期胚胎发育9个EST文库的105 227个ESTs,筛选出了104个差异表达ESTs,对已知功能的差异表达基因进行GO分类分析,发现这些差异基因参与了广泛的生物功能和过程。同时,这些差异表达ESTs的聚类分析结果显示,体外和体内发育的囊胚基因表达存在较大的差异。对这些差异表达ESTs表达模式的分析结果显示,猪植入前早期胚胎发育阶段基因呈振荡模式表达,其中线粒体和核糖体相关基因的表达在囊胚中的表达丰度要明显高于其他阶段。表达数字差异显示的结果能为猪早期胚胎发育机理的研究提供线索。     

TRIM8基因在小鼠组织和早期胚胎中的表达及其功能初探

【目的】研究TRIM8基因在小鼠组织和早期胚胎中的表达情况及其沉默后对早期胚胎体外发育的影响。【方法】采用RT-PCR、免疫印迹分别检测TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠不同组织（心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、子宫、卵巢和睾丸）中的表达情况,采用免疫组化技术对TRIM8在卵巢中进行定位。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、免疫印迹法检测TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠早期胚胎（1-细胞胚胎、2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、8-细胞胚胎、桑葚胚和囊胚）中的表达规律,用免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术对TRIM8在早期胚胎中进行定位。利用RNA干扰技术沉默TRIM8基因,研究该基因沉默对小鼠早期胚胎体外发育的影响。【结果】TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠不同组织中均表达,但在子宫、卵巢和睾丸中表达水平相对较高。在卵巢中,TRIM8蛋白主要定位在不同发育阶段的卵母细胞中。TRIM8基因及其编码的蛋白在早期胚胎中均有表达,但其mRNA表达水平在1-细胞到4-细胞期胚胎中的表达水平显著高于8-细胞到囊胚期胚胎。TRIM8蛋白主要定位在不同时期胚胎的胞质中。TRIM8基因沉默组的囊胚率显著低于对照组(P<0.05)。【结论】TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠各组织及早期胚胎中均有表达,主要定位在早期胚胎的胞质中;沉默TRIM8基因会显著降低囊胚发育率。TRIM8可能参与调控小鼠早期胚胎的发育进程。     

甲炔诺酮对斑马鱼胚胎下丘脑-垂体-生长轴基因表达的影响

[目的]研究甲炔诺酮对水生生物的生态毒理效应。[方法]将受精后的斑马鱼胚胎分别暴露在含0、6、45和87 ng/L的甲炔诺酮水环境中144 h,研究甲炔诺酮对斑马鱼胚胎下丘脑-垂体-生长轴相关基因转录表达的影响。[结果]甲炔诺酮在不同暴露时间点可以调节生长激素释放激素(ghrh)、胰岛素生长因子1(igf1)和胰岛素生长因子2b(igf2b)基因的转录表达,可以诱导生长激素(gh)基因的转录表达,但会抑制胰岛素生长因子1受体b(igf1rb)基因的转录表达。此外,甲炔诺酮暴露对生长激素受体(ghra、ghrb)、胰岛素生长因子2a(igf2a)和胰岛素生长因子1受体a(igf1ra)基因的转录表达没有显著影响。[结论]甲炔诺酮能够改变斑马鱼早期胚胎发育阶段下丘脑-垂体-生长轴相关基因的转录表达水平,进而对斑马鱼的生长发育具有潜在的危险。     

团头鲂HoxB3a基因全长cDNA克隆及表达

Hox基因是脊椎动物一类重要的生长和发育调节基因,其所编码具螺旋-转角-螺旋结构的转录因子能与靶基因特定区域DNA结合,从而调节动物胚胎发育过程中体轴的形成和器官组织的生长.本研究采用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了团头鲂HoxB3a的全长cDNA,并对团头鲂不同时期的胚胎和成鱼的不同组织进行了RT-PCR分析,以探索HoxB3a基因的时空表达特征.序列比对分析结果显示,团头鲂HoxB3a编码的氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)、大西洋鲑(Salmo salar)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、青鳉(Oryzias latipes)、条纹鲈(Morone saxatilis)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的相似性分别为96%、85%、77%、76%、78%、66%和67%,同源性较高,这说明HoxB3a基因在长期的进化中具有较高保守性.RT-PCR结果表明,团头鲂HoxB3a基因从16 hpf(hours post fertilization)胚胎期到出苗期都有表达,在成鱼大部分器官或组织中具表达活性,预示该基因存在着重要的生物学功能.Hoxb3a基因全长cDNA的克隆、胚胎不同阶段表达及组织细胞表达特征研究,为进一步探索该基因的发育通路奠定了基础.     

转基因动物技术在畜牧生产上的应用

转基因动物技术应用于畜牧生产 ,在改良动物生产性状、提高畜禽抗病力以及生产人药用蛋白等非常规畜牧产品方面 ,已显示出广阔的应用前景。1　转基因动物技术概述使动物组织能够特异表达外源蛋白质 ,需要人为地将编码这种蛋白质的基因转移到动物的胚胎中 ,使目的基因能够整合到动物染色体上 ,进而得到表达。目前 ,在转基因上主要有 4类 :A参与编码和调节机体组织生长发育的基因。例如 :促生长基因方面的研究有导入生长激素 (GH)基因 ,胰岛素样生长因子 (IGF - 1)和人生长激素释放因子 ;B与动物生产力密切相关的经济性状的主效基因。例如 …     

牛早期胚胎发育中差异基因的表达研究

利用mRNA差异显示技术成功筛选到牛早期胚胎差异表达的3个基因,即calm3、trm112l和clip1,并通过RT-PCR技术检测了各基因在卵母细胞、8细胞期和囊胚期的表达情况。结果显示,在卵母细胞和8细胞期胚胎,基因calm3和trm112l的表达量无显著性差异,而在囊胚期的表达量与前两个时期的表达量存在显著性差异,推测这两个基因在牛胚胎发育过程中的表达可能属于母型调控, 提示该基因在卵母细胞成熟和合子基因激活中起一定作用。基因clip1在牛卵母细胞、8细胞期和囊胚期的表达量均无显著性差异,可能既存在母型调控又存在合子型调控。基因calm3、trm112l和clip1在牛早期胚胎发育过程中mRNA表达量存在时间性差异,可能与其参与不同的生理活动有关。     

黄鳝脂肪酸去饱和酶及延长酶基因cDNA的克隆与表达

为了解黄鳝合成长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的能力,利用Trizol提取黄鳝肝脏总RNA,经RT获得cDNA,基于脂肪酸去饱和酶(FAD)及延长酶(FAE)基因同源系列设计简并引物进行黄鳝cDNA的PCR扩增、测序,获得黄鳝FAD及FAE基因部分片段序列。然后分析黄鳝FAD及FAE的同源性和系统进化情况及黄鳝胚胎和胚后发育期仔鱼该两个基因的表达水平。结果表明:黄鳝FAD与军曹鱼的△6去饱和酶同源性高达85%,其次是大菱鲆(83%),FAE与军曹鱼、线鳢、澳大利亚金枪鱼等的同源性高达89%;但FAD和FAE在系统发育树中均自呈一支。FAD和FAE基因在黄鳝胚胎和胚后发育阶段均有表达,以出膜后2～4 d表达量最高。提示黄鳝具有合成LC-PUFA的能力,但不同发育阶段合成能力不同。     

牛体外发育胚胎特定阶段差异表达基因的研究

[目的]研究不同发育时期牛体外受精胚胎在基因表达模式上的差异.[方法]利用单个胚胎mRNA差异显示技术,对单个8细胞期胚胎与囊胚进行mRNA差异显示,获得1条特异表达条带,对其进行克隆、测序,并与GenBank进行对比.[结果]该序列与牛核糖体蛋白131基因(ribosomal protein 131,RPL3])具有99%的同源性.采用实时定量PCR技术检测8细胞期和囊胚期胚胎RPL31的mRNA表达量,结果表明,RPL31在8细胞期胚胎的相对表达量为囊胚期胚胎的3.2倍.[结论]为揭示和阐明控制牛早期胚胎发育的相关机理提供依据. Abstract： The cattle different stage embryos obtained from in vitro was studied using the technology of single preimplantation embryo mRNA different display:single 8-cell and blastocyst stage embryos were studied using technology of mRNA different display and one different fragment was found.The result suggested that this fragment displayed high homology (99%) to cattle mRNA for ribosomal protein L31.Then to detect the expression of RPL31 mRNA in 8 cell and blastocyst stage embryos by real-time quantitative PCR,the result showed the relative amount of 8 cells was 3.2 times of blastocyst's.