微流体技术在家畜体外胚胎生产中的应用进展

体外胚胎生产技术是提高良种家畜繁殖效率的关键核心技术之一。然而，由于体内、外环境差异造成的卵母细胞成熟质量差、体外胚胎发育率低等问题严重制约了该技术的产业化应用。微流体技术是利用尺寸为几十到几百微米的微通道精确控制和操纵亚微米结构流体的科学与技术，由于其具有样品消耗少、分析速度快、高通量和高集成化等特点，正广泛应用于化学、医学、生命科学等领域。在家畜体外胚胎生产若干技术环节中，微流体技术显示出巨大的应用前景。本文综述了微流体技术在卵母细胞选择培养、精子分选、体外受精、体外胚胎培养以及配子和胚胎超低温冷冻保存中的应用进展，为提升家畜体外胚胎生产效率提供新思路。     

O-GlcNAc修饰水平变化对牛卵母细胞体外成熟的影响

旨在探究O-β-N-乙酰葡糖胺（O-linked beta-N-acetylglucosamine,O-GlcNAc）修饰水平变化对牛卵母细胞体外成熟的影响。本研究以牛卵母细胞为研究对象,检测O-GlcNAc转移酶（O-GlcNAc transferase,OGT）、O-GlcNAc糖苷酶（O-GlcNAcase,OGA）及O-GlcNAc蛋白在牛体外成熟卵母细胞中的分布;将卵丘-卵母细胞复合体分别在添加4 mmol·L^-1 OGT抑制剂BADGP和100 μmol·L^-1 OGA抑制剂PUGNAc的体外成熟液中进行体外成熟,将未添加组作为对照组,分别统计各组卵母细胞第一极体排出率和体外受精胚胎发育率,并采用荧光定量PCR和Western blot检测O-GlcNAc蛋白、OGT、OGA、GFAT和TXNIP的mRNA和蛋白表达。结果表明,OGT和O-GlcNAc蛋白共定位于牛体外成熟卵母细胞的细胞质和细胞核中,而OGA和O-GlcNAc蛋白共定位于体外成熟卵母细胞的细胞质中,且相对集中在卵母细胞的皮质区。与对照组相比,BADGP处理组和PUGNAc处理组卵母细胞第一极体排出率（（52.8±5.1）%&（60.9±1.9）%vs.（70.8±5.4）%）和体外受精囊胚发育率（（9.6±4.9）%&（10.0±5.8）%vs.（21.5±4.3）%）均显著降低（P<0.05）。BADGP处理显著降低了OGT的表达,使卵母细胞的O-GlcNAc修饰水平发生下调,OGA的表达降低;而在PUGNAc处理组中,卵母细胞OGA的表达显著下调,O-GlcNAc修饰水平升高,OGT的蛋白表达显著减少;抑制OGT显著上调己糖胺生物合成途径关键限速酶GFAT mRNA的表达,而抑制OGA则显著下调GFAT mRNA的表达;此外,O-GlcNAc修饰水平改变显著上调了葡萄糖调控关键因子TXNIP的表达。研究结果表明,O-GlcNAc修饰水平改变会降低牛卵母细胞体外成熟及发育能力,卵母细胞通过反馈调节OGT、OGA、GFAT以及TXNIP的表达,应对O-GlcNAc修饰水平的波动。     

马-牛无透明带卵异种克隆的研究

 【目的】开展异种克隆,为濒危动物的保护、细胞核重编程与核质互作研究提供新途径。【方法】以马耳成纤维细胞为供体,牛卵母细胞为受体,采用无透明带手工克隆方法构建异种胚胎,比较不同的激活液、培养液、体细胞同期方式、核移植方法对马-牛异种克隆胚胎体外发育的影响。【结果】（1）A23187 + 6-DMAP联合激活获得的克隆胚胎发育较好,囊胚率2.60%;（2）克隆胚胎于mCR1aa中的卵裂率和桑葚率显著高于CR1aa和SOF（83.65%vs 77.49%,74.87%;22.36%vs19.37%,18.98%,P＜0.05）,且发育到囊胚（2.72%）,CR1aa与SOF间无显著差异;（3）供体细胞经血清饥饿或接触抑制处理后,获得的异种克隆胚的融合率、卵裂率、桑葚率和囊胚率无显著差异;（4）无透明带手工克隆法的融合率显著高于显微注射法（90.33% vs 72.94%）,卵裂率、桑葚率和囊胚率无显著差异;（5）马-牛异种克隆胚与牛同种克隆胚比较,融合率和卵裂率无差别,桑葚率和囊胚率有显著差异（21.78%vs63.52%;2.71%vs37.48%）。【结论】牛卵母细胞能支持马体细胞去分化,进行核重编程。但由于二者的物种距离较远,异种克隆胚胎的发育能力远低于同种克隆胚胎。     

Trx及其抑制因子TcNIP基因在发育不同阶段牛体外胚胎中的转录与表达

[目的]研究Trx及其抑制因子TcNIP基因在牛卵母细胞及不同发育阶段体外受精胚胎中的表达变化.[方法]采用实时荧光定量PCR方法,检测牛GV期卵母细胞、MⅡ期卵母细胞、受精卵、2-4细胞胚胎、8-16细胞胚胎、桑椹胚和囊胚中Trx1、Trx2和TcNIP基因mRNA的相对表达量.[结果]Trx1和Trx2基因在GV期卵母细胞和不同发育阶段的胚胎均有不同程度的表达.GV期卵母细胞Trx1 mRNA表达量最高,随着卵母细胞的成熟及受精后胚胎的发育逐渐降低,囊胚期胚胎表达量又急速升高.Trx2基因在受精前的卵母细胞中高表达,受精后表达量逐渐下降,囊胚期胚胎Trx2 mRNA的表达量最低.内源性抑制因子TcNIP基因在2-4细胞胚胎阶段之前都是高表达,从8-16细胞胚胎阶段表达下降,在囊胚期胚胎表达量最低.[结论]牛卵母细胞及附植前胚胎自身的抗氧化能力在发育的不同阶段可能有所不同,而Trx1、Trx2及TcNIP基因在卵母细胞和不同发育阶段胚胎中的表达模式可能起到了重要的调控作用.     

哺乳动物体内、外生产胚胎的表观遗传差异研究进展

体外胚胎生产作为一项高效的辅助生殖技术,对优质种质资源的保存利用及遗传改良具有重要意义。但与体内生产胚胎相比,体外生产胚胎在培养过程中出现生长发育缓慢、卵裂率低、凋亡比例增加等问题,移植后伴随着胎盘肥大、孕期延长等问题,还可能出现早产、出生体重降低、巨胎综合征(LOS)等,这与基因表达异常和表观遗传修饰异常有重要关系。文章简单回顾了近年来表观修饰学在体内、外生产胚胎的研究进展,主要介绍了印记基因的表观修饰、DNA甲基化及组蛋白乙酰化在哺乳动物体内、外生产胚胎之间的差异,简述了微阵列技术在体内、外生产胚胎之间的应用,以期找到导致体内、外胚胎质量差异的关键印记基因及其作用途径,探讨体外生产胚胎质量低于体内胚胎的原因,进而改善体外胚胎生产体系。     

牛胚胎玻璃化冷冻技术研究进展

胚胎冷冻保存是保存和繁殖遗传优势动物的主要工具,是胚胎移植产业的重要组成部分。目前广泛使用的冷冻方法主要有慢速冷冻和玻璃化冷冻2种。由于玻璃化冷冻具有成本低、效率高、操作简单等优点,玻璃化冷冻法越来越受到人们的重视。经过多年研究,研究人员已经在玻璃化冷冻方法、冷冻液等方面取得了大量进展,玻璃化冷冻法已经开始进入商业化应用。本文综述了牛胚胎冷冻保存技术的研究进展,旨在为相关从业人员提供一定借鉴和参考。     

玻璃化冷冻牛GV卵母细胞全基因组甲基化模式初探

旨在研究玻璃化冷冻对牛GV期卵母细胞全基因组甲基化的影响。本研究收集新鲜、玻璃化冷冻的牛GV卵母细胞，采用单细胞全基因组甲基化测序（ScWGBS）技术对新鲜、玻璃化法冷冻牛GV卵母细胞的全基因组甲基化水平进行检测，旨在揭示两者DNA甲基化模式的差异。结果表明，玻璃化冷冻不会对牛GV卵母细胞的全基因甲基化水平造成显著影响。基于基因本体（GO）和信号通路（KEGG）对140个差异甲基化区域（DMRs）进行分析，发现DMRs主要参与细胞发育、细胞骨架组织等功能，主要富集在PI3K-Akt信号通路、GnRH信号通路等，并筛选出与卵母细胞成熟（TSC2）、细胞骨架（NUDC）、细胞活力（MAFK）等相关的基因。上述结果，可为提高GV卵母细胞玻璃化冷冻效率奠定信息基础和研究方向。     

CRISPR/dCas9技术在基因表达调控中的研究进展

CRISPR/dCas9是在CRISPR/Cas9基因编辑系统的基础上改造升级建立起的一种用于调控基因组转录与表观遗传修饰的系统,它不仅继承了CRISPR/Cas9系统的精准性,同时还展现出了良好的作用效果。在该系统中dCas9蛋白保留了Cas9蛋白结合DNA的能力而切割功能不复存在。将dCas9蛋白与不同的激活、抑制效应子域和表观遗传调控酶偶联,可以对基因表达与表观遗传修饰进行精确调控。组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、DNA甲基化等表观遗传修饰过程是基因表达的基础,对整个生命过程作出了巨大的贡献,同时表观遗传与多种疾病和癌症都存在因果关系,因此以CRISPR/dCas9系统为框架的不同表观遗传修饰系统在人类疾病治疗和癌症研究领域具有重要的研究价值。笔者简要介绍了CRISPR/Cas9系统的发现过程以及作用原理,主要总结了以CRISPR/dCas9系统为框架的不同调控系统在基因表达调控和表观遗传调控中的应用以及优化过程,以期为从事相关领域的科研工作者提供一些参考。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对牛冷冻精液品质及受精能力的影响

本试验旨在探究牛冷冻-解冻精液中添加不同浓度表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对精液品质及受精能力的影响。在牛冷冻-解冻精液中添加不同浓度(0、5、10和20μmol·L~(-1))EGCG,38.5℃孵育1h后,检测精子动力学参数、结构完整性、精子中相关酶活力和体外受精能力。结果表明,10μmol·L~(-1)EGCG处理显著提高了精子活力(TM,%)和鞭打频率(BCF,Hz,P0.05);与对照组相比,5、10和20μmol·L~(-1)EGCG处理组精子质膜和顶体完整率显著升高(P0.05);5和10μmol·L~(-1 )EGCG处理组精子线粒体膜完整率显著升高(P0.05);10和20μmol·L~(-1 )EGCG处理能够显著提高精子中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力,10μmol·L~(-1 )EGCG处理降低乳酸脱氢酶(LDH)活力和丙二醛(MDA)含量(P0.05);10和20μmol·L~(-1 )EGCG处理显著提高了精子受精后早期胚胎卵裂率和囊胚率(P0.05)。综上表明,10μmol·L~(-1)EGCG处理牛冷冻-解冻精液能提高精液品质及受精能力。     

新鲜、玻璃化冷冻牛卵母细胞体外受精囊胚全基因组甲基化模式初探

旨在初步分析新鲜及玻璃化冷冻牛卵母细胞体外受精囊胚全基因组甲基化模式。本研究采用单细胞全基因组甲基化测序技术(scWGMS)检测新鲜、玻璃化冷冻牛卵母细胞体外受精囊胚全基因组甲基化水平和差异甲基化区域(DMR),探讨两者之间DNA甲基化水平上的差异。结果表明,新鲜卵母细胞体外受精囊胚的整体甲基化水平显著高于玻璃化冷冻卵母细胞体外受精囊胚的整体甲基化水平(P<0.05)。采用基因本体分析(GO)和相关信号通路(KEGG)对143个DMRs分析,发现生物学过程主要显著富集在新陈代谢、生长发育、细胞定位、细胞刺激反应等,通路主要富集在生长发育、核酸结合及组蛋白乙酰化上,并筛选出几个与之相关的候选基因(FARP2、PI4KA、FAM3D、NCOR2、ZNF827等)。本研究初步发现,玻璃化冷冻牛卵母细胞体外受精囊胚的全基因组甲基化水平显著降低,且DMR区域主要集中在ATP结合、生长发育及组蛋白乙酰化,为提高玻璃化冷冻卵母细胞体外受精囊胚质量提供信息参考。