SMYD3对克隆猪早期胚胎发育的影响研究

目的:检测并分析SMYD3基因在猪卵母细胞体外成熟、孤雌激胚胎与体细胞核移植早期胚胎中的表达模式,研究SMYD3基因表达对猪核移植早期胚胎发育及多能性基因表达的影响.方法:通过在猪体细胞核移植胚胎中过表达和干扰SMYD3基因,观察卵裂率、四细胞率和囊胚率,并采用RT-qPCR检测不同处理组各时期SMYD3的表达情况以及多能性基因Nanog和Oct4的表达量.结果:qRT-PCR结果显示,SMYD3基因在猪卵母细胞体外成熟过程中表达较低;在孤雌激活和核移植早期胚胎发育过程中均呈现先升高后降低的表达规律,其中在4细胞和8细胞期胚胎中表达较高.过表达SMYD3基因显著提高猪核移植胚胎的囊胚率(14.63%vs 9.68%,p0.05),下调SMYD3基因表达显著降低囊胚率(6.74%vs 9.68%,p0.05).上调SMYD3组猪核移植囊胚Nanog和Oct4基因表达水平显著提高(p0.05);下调组囊胚中Nanog基因检测不出,Oct4基因表达无显著差异.结论:上调SMYD3基因表达可提高猪体细胞克隆的囊胚发育率,提高核移植胚胎体外发育能力.     

牛早期胚胎发育中差异基因的表达研究

利用mRNA差异显示技术成功筛选到牛早期胚胎差异表达的3个基因,即calm3、trm112l和clip1,并通过RT-PCR技术检测了各基因在卵母细胞、8细胞期和囊胚期的表达情况。结果显示,在卵母细胞和8细胞期胚胎,基因calm3和trm112l的表达量无显著性差异,而在囊胚期的表达量与前两个时期的表达量存在显著性差异,推测这两个基因在牛胚胎发育过程中的表达可能属于母型调控, 提示该基因在卵母细胞成熟和合子基因激活中起一定作用。基因clip1在牛卵母细胞、8细胞期和囊胚期的表达量均无显著性差异,可能既存在母型调控又存在合子型调控。基因calm3、trm112l和clip1在牛早期胚胎发育过程中mRNA表达量存在时间性差异,可能与其参与不同的生理活动有关。     

牛的3种单个早期胚胎中基因表达的差异

为建立哺乳动物单个早期胚胎中基因表达的分析方法,解决胚胎实验中取材困难的矛盾,本研究以牛体内受精胚(in vivo cultured,IVC)、体外受精(in vitro fertilization,IVF)和体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)3种来源的7日龄囊胚作实验材料,通过单个胚胎直接裂解后进行逆转录结合随机引物指数扩增的方法富集相应cDNA.对克隆囊胚cDNA库中随机挑选的15个阳性克隆进行测序和EST分析.并运用特异性的引物,对哺乳动物胚胎发育的3个重要基因Nanog,Oct-4和Sox2的表达进行了扩增和表达检测.结果表明,在哺乳动物胚胎囊胚阶段,这3个维持细胞多能性的相关基因的表达都相当活跃;相对于体内胚和体外受精胚,克隆胚中这3种基因的表达明显偏低.本方法为牛植入前胚胎发育阶段特异性基因的筛选和基因表达模式的研究提供了有效的材料和技术途径.     

小鼠2细胞胚胎基因表达谱分析

2细胞胚胎是哺乳动物植入前胚胎发育的关键时期。采用Oligo小鼠全基因组芯片对昆白小鼠2细胞胚的前期与后期胚胎总RNA进行芯片杂交,并分析基因表达谱。结果显示,2细胞胚胎表达的基因有5 136个;晚期和早期胚胎差异表达的基因1 248个,其中上调基因847个,下调基因401个;差异表达基因通路分析,多数基因参与细胞周期调控相关通路;基因本体论(GO)分类结果显示,参与细胞组成、细胞加工、催化活性和分子结合的基因占多数,部分基因参与细胞器组成、代谢加工、生物学调控和细胞信号转导等。     

猪脂肪组织表达序列标签(ESTs)的研究

 对猪脂肪组织cDNA文库的2104个克隆进行EST研究,其中563个ESTs在猪种中已有匹配序列,682个在人类及其它物种中可以找到同源序列,376个ESTs为未知新基因,有298个因序列质量差无法做分析,185个在EST库中有同源序列。所分析的376个新ESTs中,其中有159个具有ORF结构,43个具有Poly(A)和CpG特征,这些结果初步显示了猪脂肪组织的功能基因表达特点。     

表达在猪卵巢组织的新直向同源基因SLC25A3的模拟分析及其试验研究

目的借助比较基因组学、模拟分析和具体试验,快速获取直向同源序列结构和功能信息。方法通过"基于模式生物基因导向的EST功能注释法"鉴别出猪直向同源ESTs,以一个直向同源的线粒体磷酸载体编码基因SLC25A3为基础,结合组织表达信息,筛选卵巢组织中表达的ESTs序列进行该基因的虚拟克隆,并通过引物步移法进行具体的试验序列研究。结果鉴别、获取了直向同源基因SLC25A3的基因结构及功能信息,进行了试验具体研究,获得了该基因的cDNA全序列,实现了功能信息的物种间传递。结论结合基于模式生物基因导向的EST功能注释法和大量生物信息学工具,可以快速获得直向同源基因及其序列和功能信息,实现有价值信息在物种间的快捷转移和传递,为比较基因组学研究中序列功能注释与分析提供可靠的选择。     

猪BYSL基因克隆、序列特征及表达分析

BYSL基因是哺乳动物胚胎着床和胚胎发育的关键因子。为进一步研究猪BYSL基因的结构与功能,揭示其表达模式,本研究结合基因同源序列克隆技术和RT-PCR方法克隆了猪BySL基因;利用生物信息学软件对该基因进行序列特征和结构分析;利用Real-time PCR技术分析了BYSL基因的时空表达模式。结果表明,猪的BYSL编...     

miRNA-145、Oct4和Sox2基因在小鼠早期胚胎发育分化中的表达情况

【目的】揭示miRNA-145、Oct4和Sox2基因与早期胚胎细胞表型间可能存在的关联,为阐明miRNA-145调控早期胚胎发育分化的分子机制奠定基础。【方法】利用手术法收集SPF级昆明小白鼠体内生产的2-细胞胚胎和囊胚,采用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测小鼠2-细胞胚胎和囊胚中miRNA-145、Oct4和Sox2基因的表达情况。【结果】在小鼠早期胚胎由2-细胞胚胎发育至囊胚的过程中,miRNA-145在囊胚中的表达量显著高于在2-细胞胚胎中的表达量（P〈0.05,下同）,而Oct4和Sox2在囊胚中的表达量显著低于在2-细胞胚胎中的表达量。【结论】miRNA-145基因表达量上调与Oct4、Sox2基因表达量下调是随着小鼠早期胚胎发育分化的进行同时发生。     

荣昌猪唾液腺全长cDNA文库的构建及ESTs分析

【目的】构建荣昌猪唾液腺全长cDNA文库,并进行部分表达序列标签(ESTs)的测序及分析,为荣昌猪种质资源的保存、开发和挖掘提供重要的分子信息。【方法】以14日龄荣昌猪仔猪为材料,取其唾液腺,采用SMART法构建唾液腺全长cDNA文库,并进行ESTs测序、注释及功能分析。【结果】初级文库滴度为5.88×106PFU/mL,重组率为99.67%,大部分插入片段长度为400~2 000bp。共获得144条有效ESTs序列,共计108条非重复序列,包括23个重叠群和85个单一序列,77(占71.29%)条序列为已知功能基因,31(占28.71%)条为未知功能序列,其中18条为新基因。GO分类和KEGG途径分析结果显示,荣昌猪唾液腺表达基因功能主要包括细胞成分、分子功能和生物学过程3个类群。在细胞成分类群中,细胞外的成分所占比例最高;在分子功能类群中,酶抑制剂活性所占比例最高;而在生物过程类群中,以转运和定位等过程最突出。表达的基因主要参与补足物和凝固级联、百日咳、加压素调控的水再吸收及味觉传导等代谢途径。【结论】成功构建了荣昌猪唾液腺全长cDNA文库,解析了荣昌猪唾液腺的表达特征。     

猪肝脏组织表达序列标签(ESTs)的初步分析

 构建了猪肝脏组织cDNA文库 ,并对文库中随机挑选的 4 38个克隆的表达序列标签 (ESTs)进行了研究。结果表明 ,在所研究的 4 38个ESTs中 ,186个在猪种中已有匹配序列 ,37个在人类及其它物种中可以找到同源序列 ,2 15个为未知功能基因。试验还测定了文库中 4 5个cDNA克隆的全长插入序列 ,结果表明 ,19个为已知功能基因 ,11个没有发现开放阅读框 ,其它 15个具有开放阅读框 ,但基因的功能未知。这些结果初步代表了肝脏组织的功能基因表达谱。     

猪体内与孤雌激活早期胚胎发育特定阶段差异表达基因筛选

 【目的】研究早期胚胎发育基因,筛选猪早期体内发育胚胎和体外孤雌激活胚胎的差异表达基因,探讨影响胚胎发育的分子基础。【方法】分别采用孤雌激活和手术（猪体内发育）的方法收集2细胞、4细胞、8-16细胞时期的胚胎,利用SPEDDRT-PCR挑选不同时期的差异表达产物,将所获得的产物按照片段大小分离纯化后通过反向Northern杂交去除假阳性条带。将阳性条带克隆入T载体中,经过PCR鉴定后挑选其中的阳性克隆进行测序。【结果】筛选了11个代表不同时期表达差异的cDNA片段,编号为DDD1-DDD11。经过与GenBank数据进行同源性分析,发现其中DDD3、DDD11没有同源序列信息,提交数据库获得GenBank登录号（EU597224、EU597228）,其余序列发现相似性较高的数据。【结论】对体内正常发育胚胎和孤雌激活胚胎进行对比、分析,发现体内4细胞期和体内8-16细胞期各有1个片段为新基因片段,为进一步分析发育相关基因及其功能奠定基础。     

Isolation, Identification of Differentially Expressed Sequence Tags in the Backfat Tissue from Meishan, large White and Meishan×Large White Cross Pigs

In order to detect the molecular mechanism of heterosis in pigs, the mRNA differential display technique was performed to investigate the differences of gene expression in the backfat tissue from Meishan,Large White and Meishan×Large White cross pigs.Nine 3'-end anchored primers in combination with ten 5'-end arbitrary primers were used to perform the differential display PCR and nearly 3 000 reproducible bands were examined .Fifteen expressed sepuence tags that were differentially expressed were isolated and then isdentifide through semi-quantitative RT-PCR.BLAST analysis revealed that the fifteen expressed sequence tags (ESTs) were ntt homologous to any of the known porcine genes or ESTs. These novel ESTs were then submitted to GenBank.     

用ZBED6基因敲除猪研究心脏发育的分子机制

【目的】ZBED6基因是一个调控肌肉生长发育的转录因子,为了探讨 ZBED6 在心肌生长发育中的调控机制,利用RNA Sequencing（RNA-Seq）技术比较ZBED6基因敲除巴马小型猪（ZBED6-KO)和同日龄正常巴马小型猪（ZBED6-WT)的心脏组织转录组,挖掘ZBED6基因的敲除对家猪心脏组织发育及基因表达的影响。【方法】利用t-test对ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织大小的表型特征进行显著性分析,利用实时荧光定量PCR对ZBED6基因的靶基因IGF2的表达量进行定量。通过制作石蜡组织切片对心肌进行组织学分析,比较其组织结构的差异。提取ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织的总RNA,以Illumina Hiseq 2000平台进行RNA-Seq分析。以猪Sus_scrofa10.2为参考序列,用转录组的标准流程筛选ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织中的差异表达基因,对差异基因进行GO和IPA富集分析。随机选择9个差异表达基因,利用实时荧光定量PCR验证RNA-Seq结果的可靠性。【结果】ZBED6-KO猪心脏重以及IGF2表达量均显著高于ZBED6-WT猪（P＜0.05）,与ZBED6-WT猪相比,ZBED6-KO猪肌纤维的宽度较宽,结缔组织较少,ZBED6基因的敲除对家猪心脏的生长发育有一定的促进作用;测序结果显示,各样本获得至少10 G的数据量,每个样本clean ratio、Q30 data均达到90%以上,其中62.8%-80.1%的reads能比对到猪的基因组上,表明测序饱和度良好,测序数据真实可靠;对测序数据进行分析,筛选到 184个差异基因,其中上调的基因114个,下调的基因70个,注释的141个,未注释的43个;差异基因层次聚类分析显示,ZBED6-KO组（x1、x3、x6）的3个个体表达模式相似,ZBED6-WT组（x2、x4、x5）的3个个体表达模式相似;GO和IPA富集分析得到13个显著的GO条目,33条显著的pathway通路,差异基因主要富集在免疫反应、肌肉发育和RhoA信号等相关的通路;qRT-PCR 检测9个差异表达基因的表达模式与RNA-Seq分析结果一致,证实了RNA-Seq结果的可靠性。【结论】首次以ZBED6-KO巴马小型猪为模型,利用RNA-Seq技术探究了ZBED6敲除对心脏发育和功能的影响,丰富了ZBED6 对心脏发育和功能的研究。     

不同类型猪小肠组织差异EST的鉴定及其SNPs分析

采用DDRT-PCR技术,对中国地方猪种和杜长大（大白×长白×杜洛克）猪的小肠组织进行差异EST分析。试验提取了地方猪和杜长大猪小肠组织的总mRNA,反转录成cDNA,利用3条锚定引物和6条随机引物组成18个引物对其进行PCR扩增,对特异性差异条带进行测序分析和鉴定其EST;针对EST序列特征,在不同产脂能力猪种中开展SNPs分析。结果表明,18个引物对共得到180多条EST序列,其中地方猪种个体间差异EST为6条,杜长大猪个体间差异EST为12条,地方猪与杜长大猪间差异EST为8条。选取具有代表性的3条种群间差异EST进行序列研究,结果显示,G24-300在种群之间的表达量存在明显的差异,是在杜长大猪群中高表达的EST;G01-360具有丰富的SNPs,并且其基因频率分布在不同类型猪群中存在明显的差异。     

用单胚mRNA差异显示技术筛选山羊早期胚胎发育相关基因

用单胚构建的mRNA差异显示技术,对体外培养的山羊早期2、4、8~16细胞期胚胎的基因表达进行研究,并选择1条在2细胞期胚胎特异表达的条带进行分析。结果表明:该片段与人类肽基精氨酸脱亚胺酶基因具有83%的同源性。该基因通过对组蛋白和细胞骨架蛋白翻译后的修饰作用,对早期胚胎发育过程中基因转录和表达的调控起着重要作用,是羊早期胚胎发育过程中的重要影响因子。     

库尔勒香梨萼片脱落与宿存相关基因的差异表达分析

[目的]利用mRNA差异显示(mRNA differential display PCR,DDRT-PCR)技术,寻找、筛选并确定与库尔勒香梨萼片脱落和宿存相关基因的差异表达时期以及相关的差异基因.[方法]以新疆库尔勒香梨盛花前期、盛花期及其盛花后期三个时期同一花序的第2和第4朵花为试材,通过DDRT-PCR技术分离和克隆库尔勒香梨萼片脱落和宿存相关基因片段.[结果]分离得到42条差异片段,其中双引物片段有7条,在GenBank中同源性比较发现有2条与控制开花以及激素调节有密切关系的SPL和MYB类转录因子有很高的同源性,分别是78;和86.83;.[结论]实验为获得香梨萼片脱落与宿存差异表达基因建立的体系.为相关基因全长的克隆奠定基础,并为进一步验证其功能提供依据.