猪圆环病毒2型ORF3编码蛋白的体外表达

设计特异引物,以猪圆环病毒2型(PCV-2)杭州株HZ0201的基因组DNA为模板,PCR扩增出ORF3基因,构建了pGEX-4T-1-ORF3原核表达载体和pEGFP-C2-ORF3真核表达载体。ORF3基因全长315 bp,编码105个氨基酸。SDS-PAGE、Western blot分析及真核PK15细胞转染结果显示:ORF3蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式存在,分子量大小约为37.7 ku;ORF3重组蛋白在真核PK15细胞的细胞核和细胞浆都有表达,尤其在细胞核中表达量较高,且对细胞有一定的毒性。     

猪DDX1基因的克隆、序列分析及表达

根据已知人、小鼠、牛、鸡、犬和恒河猴等物种的DEAD-box解旋酶1(DEAD-box helicase 1,DDX1)基因mRNA序列设计引物,从猪肾传代细胞系(PK-15)中克隆DDX1基因编码区(CDs)序列,对该基因进行生物信息学分析、组织表达谱分析。进一步将猪DDX1基因CDs序列克隆至真核表达载体pCMV-Tag2B,构建的重组真核表达质粒转染PK-15细胞后运用Western blot和间接免疫荧光试验检测DDX1基因的真核表达。结果显示:成功克隆了猪DDX1基因的cDNA序列(GenBank登录号为KU522467),其开放读码框全长为2 223bp,编码740个氨基酸;与牛、鸡、黑猩猩、犬、人、小鼠、大鼠和恒河猴的氨基酸序列同源性分别为98.8%、93.5%、97.6%、98.8%、97.7%、97.0%、97.6%和97.8%。表达谱分析表明,猪DDX1mRNA在不同组织中的表达水平存在差异,表现为脂肪、肝脏和脾脏中高表达,而在胃、心脏和肌肉中表达较低。成功构建了猪DDX1基因真核表达质粒,经证实目的基因可以在真核细胞中特异性表达,且表达的DDX1蛋白主要定位于细胞质中,少量定位于细胞核中。结果表明:本试验克隆了猪DDX1基因的序列,分析了其在不同组织的表达规律,并构建了DDX1基因重组表达质粒,为该基因下一步的功能学研究奠定了基础。     

猪skMLCK基因全长cDNA测序及真核表达载体构建

为获得猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(skeletal muscle myosin light chain kinase,skMLCK)基因全长cDNA序列,构建猪skMLCK基因的真核表达载体,参考GenBank预测信息并利用Primer Premier 5.0和DNAMAN生物学软件,分2段进行RT-PCR扩增,进行猪skMLCK基因的cDNA全长克隆、测序、拼接、合成,构建猪skMLCK基因的真核表达载体。结果获得了猪skMLCK基因的全长cDNA序列,序列长度为1 851 bp。成功构建了猪skMLCK基因的真核表达载体,重组质粒为pEGFP-N1-skMLCK。猪skMLCK基因全长cDNA的测序和真核表达载体的构建为进一步研究猪skMLCK基因在肌纤维生长发育中的作用奠定基础,为通过基因水平来改善与评价猪肉质性状提出了一个新方向。     

猪白细胞介素18全基因的克隆、真核表达质粒的构建及其在猪肾细胞中的表达

通过RT-PCR方法自猪脾脏淋巴细胞中扩增mpIL-18基因.序列测定表明,pIL-18全基因核苷酸长度为579bp,编码192个氨基酸.将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组质粒pcDNA-IL18m,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确.阳性克隆鉴定后,在脂质体作用下转染猪肾细胞(PK15),通过提取RNA检测到了mpIL-18在PK15细胞中的表达.     

PK-15细胞的ISG15基因敲除促进PRV的复制

本试验旨在研究干扰素刺激基因15（interferon-stimulated gene 15,ISG15）敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）复制的影响。通过CRISPR/Cas9技术构建猪ISG15基因敲除猪肾上皮（PK-15）细胞系,利用CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ISG15基因对细胞活力的影响,采用间接免疫荧光技术检测PK-15以及PK15-ISG15^-/-细胞感染PRV的增殖差异,通过RT-qPCR检测PRV-EP0、PRV-gE、PRV-VP16和IFN-β的转录水平,Western blot检测PRV-gE和ISG15的蛋白表达水平,以及通过病毒噬斑检测对子代病毒感染力的影响。结果表明,sgRNA1和sgRNA2均成功敲除ISG15基因;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,敲除ISG15基因对PK-15细胞活力无影响;间接免疫荧光检测结果表明,PRV感染后,PK15-ISG15^-/-细胞中的荧光强度明显高于PK-15细胞;RT-qPCR和Western blot结果表明,敲除ISG15可以促进PRV的转录和蛋白表达;病毒噬斑试验进一步显示,敲除ISG15可以促进PRV的复制。另外,RT-qPCR结果显示,敲除ISG15可以抑制PRV感染引起的IFN-β转录上调。本研究成功构建了PK15-ISG15^-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实ISG15基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖,并推测这种抑制作用可能与IFN通路有关。     

他莫昔芬对猪伪狂犬病病毒体外增殖的影响

【目的】 研究他莫昔芬（Tamoxifen）在PK15细胞模型上对猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）感染的抗病毒作用。【方法】 以PK15细胞为模型,采用CCK-8细胞计数法检测他莫昔芬对细胞活力的影响;利用ANNEXIN V-FITC/PI凋亡试剂盒检测他莫昔芬对细胞周期和凋亡的影响;利用CytoFLEX流式细胞仪和荧光显微镜检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-GFP后病毒增殖的差异;利用实时荧光定量PCR和Western blotting方法分别检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-QXX后PRV gB基因mRNA和蛋白表达水平的变化;利用病毒滴度测定法检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-QXX后对病毒的抑制情况。【结果】 他莫昔芬用药浓度在6 μmol/L时对细胞活力无影响;在6 μmol/L以下时,与空白组相比,他莫昔芬处理组对细胞周期与凋亡没有显著影响（P>0.05）。在同一时间点,他莫昔芬处理组PRV-GFP在PK15细胞中的增殖速度极显著低于对照组（P<0.01）;实时荧光定量PCR结果表明,他莫昔芬处理后极显著抑制了PRV gB基因mRNA在PK15细胞中的表达（P<0.01）;Western blotting结果显示,不同给药浓度同一时间点,他莫昔芬都显著或极显著抑制了PRV gB蛋白的表达（P<0.05;P<0.01）;病毒滴度测定结果表明,在PK15细胞中,同一时间点他莫昔芬处理组的PRV-QXX子代病毒的复制速度显著或极显著低于对照组（P<0.05;P<0.01）。【结论】 他莫昔芬能显著抑制PRV在PK15细胞中的增殖。     

猪生长激素基因的克隆及在哺乳动物细胞中的表达

应用RT—PCR技术克隆了猪生长激素(pGH)cDNA，该基因编码蛋白的信号肽序列与已有报道的pGH基因存在2个氨基酸残基的差异，而成熟肽却无差异。将pGHcDNA定向插入真核表达载体VRl020，构建了重组真核表达质粒VpGH；利用脂质体法转染哺乳动物细胞COS7，对转染后的COS7细胞进行RT—PCR、ELlSA和免疫荧光分析，分另1在转录和翻译水平证实了目的基因在COS7细胞中得到正确转染表达。     

猪CD151基因的克隆及过表达细胞系的构建

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)主要感染猪肺泡巨噬细胞,但对猪源的其他细胞系不易感。本试验通过构建PK15-CD151和3D4/21-CD151过表达细胞系,为深入研究PRRSV感染宿主细胞的机制奠定基础。应用分子生物学方法、实时荧光定量PCR和荧光显微镜技术,对基因CD151在组织中的分布情况进行检测、基因克隆、真核表达载体的构建、对CD151在PK15和3D4/21细胞内的过表达情况,以及对细胞生长增殖的影响进行了研究。结果显示:CD151基因在不同组织内均有表达,但表达量有差异;PB真核表达载体构建成功,荧光显微镜下可见转染PB载体和CD151基因共转染的PK15和3D4/21细胞表达强烈的绿色荧光,实时荧光定量PCR分析结果进一步证实,CD151在转染后的细胞中获得超表达,并且对细胞的生长增殖无影响。本试验成功构建了PK15-CD151和3D4/21-CD151过表达细胞系,过表达细胞系的成功构建为进一步探索CD151在PRRSV感染细胞过程中的协同作用提供了细胞模型,特别是对深入研究PRRSV的入侵及宿主识别具有重要意义。     

干扰素基因刺激因子基因敲除对猪伪狂犬病病毒复制的影响

研究干扰素基因刺激因子(STING)基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响。用CRISPR/Cas9技术敲除猪肺巨噬细胞系(3D4/21)的STING基因,用T7核酸酶检测靶基因敲除效率,用细胞计数试剂盒检测基因敲除细胞的活力,用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组病毒PRV-GFP感染基因敲除细胞,用流式细胞术检测感染细胞的荧光强度,用定量RT-PCR检测PRV的gB、TK基因表达及其感染细胞的IL-1β、IFN-β、ISG15基因转录,用Western blot检测PRV gE蛋白表达水平,用病毒滴定法测定子代病毒滴度。结果显示:设计的3个STING基因外显子2特异sgRNA均能切割3D4/21细胞的靶序列,其中sgRNA3的基因编辑效率最高;对sgRNA1介导STING基因敲除系进行克隆化,获得基因敲除细胞系3株,基因敲除对细胞活力无影响;亲本细胞培养的PRV-GFP感染阳性细胞占80.77%,STING基因敲除细胞培养的PRV-GFP感染阳性细胞占95.55%;STING基因敲除对PRV基因表达具有促进作用,亲本3D4/21细胞的病毒滴度为10~(6.2) TCID_(50)·0.1 mL~(-1),STING基因敲除细胞的病毒滴度为10~(8.3)TCID_(50)·0.1 mL~(-1),病毒感染细胞的IL-1β、IFN-β和ISG15转录下调明显。STING基因敲除能促进PRV在3D4/21细胞中复制,可能与感染细胞的IL-β、IFN-β和ISG15表达抑制有关。     

凋亡相关斑点样蛋白敲除PK-15细胞系的建立及对PRV感染的影响

本试验旨在研究凋亡相关斑点样蛋白（ASC）的基因敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）感染PK-15细胞的影响。以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞（PK-15）ASC基因稳定敲除细胞系,通过T7核酸酶检测靶基因的敲除效率;CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ASC基因对细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测PK-15以及PK15-ASC^-/-细胞感染PRV-GFP病毒的增殖差异;RT-PCR检测PRV-gB及IFN-β、ISG15、IL-1β mRNA表达水平;Western blot检测PRV gE蛋白的表达;TCID₅₀检测子代病毒感染力的滴定。结果表明：两对特异性sgRNA均能对ASC进行基因编辑,但经过T7核酸酶酶切检测进行基因编辑效率分析,结果表明,sgRNA2的基因编辑效率最高;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,PK-15以及PK15-ASC^-/-细胞活力无影响;流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-ASC^-/-细胞中的增殖显著低于PK-15细胞;定量RT-PCR结果表明,PRV-gB基因在PK15-ASC^-/-细胞中的转录水平显著低于PK-15细胞,而IFN-β、ISG15基因在PK15-ASC^-/-细胞中的转录水平显著高于PK-15细胞;Western blot结果表明,PRV的gE蛋白在PK15-ASC^-/-细胞中的表达显著低于PK-15细胞;滴度测定结果表明敲除ASC基因能够显著抑制子代病毒的增殖能力。本研究成功构建了PK15-ASC^-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实敲除ASC基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖。     

猪核糖核酸酶L基因真核表达载体的构建与表达

为了研究猪核糖核酸酶L(sRNase L)的抗病毒能力,利用pXJ41载体构建猪RNase L基因真核表达载体pXJ41-sRNase L,采用poly(I∶C)转染PK-15细胞刺激诱导sRNase L基因转录mRNA;根据Gen Bank上sRNase L基因编码区序列设计引物并加入真核表达增强序列Kozak序列,通过RT-PCR扩增sRNase L编码基因序列,并将其克隆至真核表达载体pXJ41,通过双酶切和测序鉴定重组质粒;将重组表达载体pXJ41-sRNase L转染Marc-145细胞,Western blot检测sRNase L在Marc-145细胞中表达。结果显示:成功扩增得到sRNase L基因全长;成功克隆至真核表达载体pXJ41并能够在Marc-145细胞中成功表达。结果表明:成功构建了真核表达载体pXJ41-sRNase L并在Marc-145细胞中实现了sRNase L的表达,为进一步研究sRNase L在猪体内先天性免疫中抗病毒能力及其机制提供了条件。     

干扰素调节因子3基因敲除对伪狂犬病病毒增殖的影响

试验旨在研究敲除干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)复制的影响。使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了IRF3基因敲除PK15细胞系。通过构建重组质粒pIRF3-sgRNA,转染至HEK293T/17细胞,收获慢病毒并感染PK15细胞,经嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7酶切鉴定后通过有限稀释法获得PK15-IRF3~(-/-)单克隆稳定细胞系。为验证敲除IRF3基因稳定细胞系是否构建成功,采用实时荧光定量PCR、Western blotting方法检测PRV相关基因及蛋白的表达,应用荧光显微镜和流式细胞术观察病毒复制情况并进行病毒滴度检测。结果显示,PK15-IRF3~(-/-)细胞系感染PRV-GFP后PK15-IRF3~(-/-)细胞荧光强度明显强于PK15细胞。感染PRV野毒(PRV-QXX)后PK15-IRF3~(-/-)病毒滴度明显强于PK15细胞,PRV的gE蛋白水平明显高于PK15细胞。在mRNA水平检测两种细胞中PRV TK基因的变化也得到相同的结果。进一步研究表明,在感染PRV-QXX后,PK15细胞中IFN-βmRNA会随着时间增加显著增高(P0.05),但PK15-IRF3~(-/-)细胞中IFN-βmRNA则无明显变化。上述结果表明,敲除IRF3基因后显著促进PRV的增殖,IRF3在病毒的复制中发挥着重要作用,为伪狂犬病的防控提供了新的方法和策略。     

猪细小病毒VP2蛋白病毒样颗粒在伪狂犬病病毒表达系统中的表达

利用PCR技术从猪细小病毒（PPV）SC1株基因组中扩增VP2全基因,并将其插入真核表达载体pPI-2.EG-FP中,构建转移载体pPI-2.EGFP.VP2。采用脂质体介导法将猪伪狂犬病病毒（PRV）SA215株DNA与pPI-2.EGFP.VP2DNA共转染Vero细胞,待出现细胞病变后收集病毒液。经空斑纯化,并同时采用检测PPV VP2基因的PCR方法筛选获得重组病毒PRV SA215/VP2株。以兔抗VP2的多克隆抗体建立的免疫荧光技术可检测到Vero细胞发出的特异性荧光,表明PPV VP2成功插入到PRV SA215基因组中,并获得表达。进一步电镜观察表明,感染PRV SA215/VP2的Vero细胞中可同时观察到PRV与PPV 2种类病毒样颗粒。结果表明,成功实现了利用PRV载体表达PPV VP2蛋白病毒样颗粒,为进一步研制PPV病毒样颗粒疫苗奠定了基础。     

干扰素调节因子3基因敲除对伪狂犬病病毒增殖的影响

试验旨在研究敲除干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)复制的影响。使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了IRF3基因敲除PK15细胞系。通过构建重组质粒pIRF3-sgRNA,转染至HEK293T/17细胞,收获慢病毒并感染PK15细胞,经嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7酶切鉴定后通过有限稀释法获得PK15-IRF3^-/-单克隆稳定细胞系。为验证敲除IRF3基因稳定细胞系是否构建成功,采用实时荧光定量PCR、Western blotting方法检测PRV相关基因及蛋白的表达,应用荧光显微镜和流式细胞术观察病毒复制情况并进行病毒滴度检测。结果显示,PK15-IRF3^-/-细胞系感染PRV-GFP后PK15-IRF3^-/-细胞荧光强度明显强于PK15细胞。感染PRV野毒(PRV-QXX)后PK15-IRF3^-/-病毒滴度明显强于PK15细胞,PRV的gE蛋白水平明显高于PK15细胞。在mRNA水平检测两种细胞中PRV TK基因的变化也得到相同的结果。进一步研究表明,在感染PRV-QXX后,PK15细胞中IFN-βmRNA会随着时间增加显著增高(P<0.05),但PK15-IRF3^-/-细胞中IFN-βmRNA则无明显变化。上述结果表明,敲除IRF3基因后显著促进PRV的增殖,IRF3在病毒的复制中发挥着重要作用,为伪狂犬病的防控提供了新的方法和策略。     

猪圆环病毒Ⅱ型Rep基因在PK15细胞中的表达及特性

为研究猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Rep基因在PK15细胞中的表达特性，通过PCR方法克隆了PCV2杭州株(HZ0201)Rep基因全长945bp片段，与真核表达栽体pCI—neo构建为重组质粒pCI-PCV2-Rep。pCI-PCV2-Rep质粒转染PK15细胞后48h，通过RT-PCR可检测到PCV2 Rep mRNA的转录；用猪PCV2多抗血清作间接免疫荧光试验，可检测到Rep基因表达产物。在表达量低的细胞中，PCV2 Rep蛋白主要位于PK15的细胞浆，在表达量高的细胞中，细胞浆和细胞核中均含有大量的Rep蛋白，表明Rep对PK15细胞的细胞浆和细胞核的亲嗜性没有明显差别。     

MLKL基因敲除对猪伪狂犬病病毒复制的影响

【目的】 构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like，MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO)，研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)复制的影响。【方法】 根据MLKL序列设计特异性编辑位点，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体，转染至PK-15细胞，经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系，通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平;采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平;采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】 试验成功构建MLKL-sgRNA载体，筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株，Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH(感染后36 h除外)和PRV Bartha-K61的病毒滴度(P<0.01;P<0.05)。PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO细胞后，坏死细胞明显减少。【结论】 本研究构建了MLKL基因敲除的PK-15细胞株，与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞显著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的复制和存活能力，为PRV Bartha-K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了一种可行性策略。     

猪伪狂犬病病毒变异株GD株的分离鉴定及TK和gE基因的进化分析

为了解猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)流行变异毒株的病原学特性及分子遗传变异特点,本研究从广东省某疑似暴发猪伪狂犬病的猪场采集的病料中分离到一株PRV毒株,命名为GD株。该病毒在PK-15细胞中能够产生典型的PRV细胞病变,病毒滴度可达109.0 TCID50/mL。将病毒感染KM SPF小鼠,接种小鼠在4 d内全部死亡,并且均出现典型的PR症状。序列比对结果显示,PRV GD株的TK和gE基因与国内外PRV参考株的核苷酸同源性分别为99.4%～100%和97.6～99.9%,氨基酸同源性分别为99.4%～100%和95.5%～99.8%。基于gE基因的遗传进化分析发现,PRV GD株与国内近几年分离鉴定的流行变异毒株位于同一分支上。与经典株相比,PRV GD株的gE蛋白氨基酸序列在48和496位均有1个天冬氨酸(D)的插入,符合PRV变异株的典型特征。本研究成功分离到一株PRV变异株,为PRV流行变异毒株的防控和新型疫苗的研究提供一定的科学依据。     

猪lipasin基因的克隆及其对肝细胞LPL基因转录的影响

旨在克隆猪lipasin基因,并检测其对肝细胞LPL基因转录的影响。本试验利用同源电子克隆技术克隆猪lipasin基因,构建其真核表达载体转入肝细胞,探讨其对LPL基因转录的影响。结果表明,成功克隆了猪lipasin基因,目的片段大小为615bp,上传至GenBank(登录号:KF017598),开放阅读框为594bp,编码197个氨基酸,liapsin蛋白的分子量和等电点分别为21.99ku和6.79;成功构建了真核表达载体PB-EGFP-lipasin,实现lipasin基因在肝细胞中的过表达,与对照组相比,PB-EGFP-lipasin转染的细胞中LPL基因的转录水平显著下降。结果提示,猪lipasin可能通过抑制肝细胞LPL的转录影响脂代谢。     

猪Mx1基因的克隆表达及抗病毒活性研究

本文应用(RT-PCR)技术,从猪瘟弱毒疫苗和Poly:IC共刺激7 h的PK15细胞的cDNA中扩增出编码Mx1蛋白的全长基因,并通过引物设计填补了PK(15)细胞系Mx1 cDNA序列中3’端11bp的缺失,成功获得Mx1完整基因的克隆。构建了重组表达质粒pRetroQ-sMx1,转染HEK293T细胞并表达Mx1蛋白,利用微量细胞病变抑制法测定其抗病毒活性。双酶切鉴定和核酸序列测定证实pRetroQ-sMx1真核表达质粒构建成功,转染HEK 293T细胞后,能够检测到绿色荧光,Western blot证实为目的蛋白。微量细胞病变抑制法测定重组蛋白具有一定的抗水疱性口炎病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒的活性。重组Mx1具有一定抗病毒生物功能,为进一步研究重组Mx1蛋白的活性以及Mx1抗病毒药物奠定了基础。     

过表达Fad24使猪DFAT细胞在成脂诱导条件下转向成骨分化

旨在探索过表达Fad24基因对猪DFAT细胞诱导成脂分化的影响。根据猪Fad24基因序列设计引物，克隆猪Fad24基因的全长CDS区片段，构建猪Fad24过表达载体，通过测序比对碱基和氨基酸序列，通过脂质体瞬时转染技术，将过表达Fad24载体转染猪DFAT细胞，从mRNA水平验证了Fad24基因在猪DFAT细胞中的过表达水平，然后将过表达Fad24的猪DFAT细胞在体外诱导成脂分化，从形态学、Fad24、成脂和成骨分化核心转录因子表达水平上进行了检测。结果表明，猪Fad24过表达载体碱基序列一致性高达99.8%,氨基酸序列一致性高达100%;过表达Fad24的猪DFAT细胞Fad24的表达量高出正常猪DFAT细胞表达量约45倍；成脂分化诱导5 d时，与对照组的正常分化比较，过表达Fad24的猪DFAT细胞成脂分化完全被抑制，相反强力转向成骨分化，细胞积聚成许多小结节，诱导7 d时已形成典型的成骨样大结节，表面可见细胞分泌物；经茜素红染色鉴定，证实细胞分泌物中含有矿化物质沉淀；经Real-time PCR检测，证实过表达Fad24试验组显著下调成脂分化核心转录因子PPARγ2、SREBP...