环介导等温扩增技术快速检测猪流行性腹泻病毒

为建立一种快速、灵敏的检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究针对PEDV的NP基因设计LAMP引物,对反应体系优化并进行特异性及敏感性等试验.结果表明,该方法在65℃下恒温扩增60 min,经SYBR Green Ⅰ染色后仅肉眼观察即可判定结果.该方法特异性好,与传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒及大肠杆菌等无交叉反应,对重组质粒最低检测限度为16拷贝/μL,灵敏度高于普通PCR.该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作方便,适于临床检测PEDV.     

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立与应用

针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因设计LAMP引物,对反应体系的条件优化并进行特异性及敏感性等试验。结果显示:该方法在60℃下恒温扩增60min,使PEDV的M基因得到了高效率特异性扩增。本试验方法特异性好,与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRSSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)及猪伪狂犬病病毒(PRV)等无交叉反应,同时也具有较好的灵敏性,最低检测分子拷贝数为1.0×102 copies/μL。反应结束后加入SYBR GreenⅠ在紫外灯下观察颜色变化,结果显示阳性扩增产物呈现绿色荧光。结果表明:该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作便捷,适于临床检测PEDV。     

猪流行性腹泻病毒LAMP检测方法的建立及初步应用

猪流行性腹泻病毒是引起仔猪腹泻死亡的主要病原。为实现对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的快速检测,利用PEDV S基因设计特异性引物,通过优化各种反应条件,建立了检测PEDV的环介导等温扩增快速检测方法(LAMP)。此方法特异性好,敏感度强,将反转录后的病毒c DNA稀释到108倍仍可检出,是PCR方法的100倍。本研究建立的LAMP方法操作简便、灵敏度高、特异性强,为临床PEDV的快速检测和预防奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒一步法双重RT-PCR检测方法的建立与应用

本研究旨在建立一种用于临床腹泻病例中猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）快速检测的一步法双重RT-PCR方法。根据GenBank中收录的PEDV和TGEV的基因序列,分别设计两对特性引物,经最佳反应条件的优化和选择,结果显示,该一步法双重RT-PCR检测方法能同时特异性扩增PEDV和TGEV,该方法可检测到稀释度1×10^-5的疫苗毒。应用本方法检测2015年度实验室收集的疑似样品,PEDV阳性率为100%。本研究建立的方法快速、敏感性高、特异性强,可用于临床PEDV和TGEV的快速检测及流行病学调查。     

黑蜂王台病毒环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种快速检测蜜蜂黑蜂王台病毒(BQCV)的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究根据Gen Bank中登录的BQCV-JL1株基因序列(KP119603.1)设计了多套LAMP引物,通过引物筛选,反应体系和反应条件优化,建立了可视化LAMP方法,并且评价了该方法的特异性、敏感性、重复性和稳定性。结果显示,建立的LAMP方法在63℃下可对BQCV核酸进行高效扩增,可视化判定结果与real-time Turbidimeter仪检测结果一致;该方法具有较强的特异性和较高的敏感性(最低检出限量为4.0×102拷贝/μL),为普通PCR的100倍。临床样品检测结果表明LAMP法检出率高于常规PCR。本研究建立的可视化LAMP方法操作简便,适用于BQCV的快速检测。     

牛副流感3型病毒Nano-PCR、LAMP方法的建立及初步应用

试验旨在建立牛副流感3型病毒（bovine parainfluenza type-3 virus,BPIV3）纳米PCR（Nano-PCR）与环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）新型快速分子检测技术,对其进行特异性和敏感性对比试验,并对10份临床样品进行了检测。特异性与敏感性试验结果显示,建立的Nano-PCR和LAMP方法只对BPIV3特异,而对牛呼吸道合胞体病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒无交叉反应;建立的Nano-PCR和LAMP方法具有相同的敏感性,均是普通PCR的10倍,最低核酸检出量均为4.16×10²拷贝/μL。临床检测结果显示,建立的两种方法阳性符合率为100%,且阳性检出率均高于普通PCR。因此,本试验建立的Nano-PCR和LAMP方法为BPIV3的临床诊断提供了更快速、敏感、可靠的工具。     

猪流行性腹泻病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用简

为建立一种快速、敏感的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）检测方法,试验据GenBank中PEDV基因组序列,设计并合成针对M基因的内、外2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测PEDV的巢式RT-PCR方法。结果显示,单一使用外引物或内引物进行常规RT-PCR时检测限量均为50 pg PEDV RNA模板,而使用巢式RT-PCR可检测到50 fg PEDV RNA模板。使用该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒的扩增结果均为阴性。结果表明,建立的巢式RT-PCR方法特异性、敏感性好,可快速准确地检测出样本中微量PEDV核酸。     

基于PEDV ORF3基因的强弱毒株鉴别方法的建立及初步应用

为了建立一种快速鉴别PEDV强毒株和弱毒株的RT-PCR方法,针对PEDV ORF3基因设计一对引物,优化其反应体系和退火温度,并测试其特异性和敏感性。结果显示,在退火温度55.2℃,上、下游引物各0.5μL时PCR扩增效果最理想。特异性试验结果显示本方法对9种常见猪病病原的核酸模板均不产生扩增条带;敏感性试验显示该方法的检测下限为T-ORF3_IS 272拷贝/μL和T-ORF3_VC 14.4拷贝/μL。将本试验建立的RT-PCR法与已建立的双重RT-PCR方法进行比较,结果显示两种方法符合率为99.2%,且本法的实际检出率更高。对120份临床样本检测结果显示,PEDV强弱毒株的阳性率分别为87.18%和84.21%,其中9份样本中同时检出2种PEDV毒株,但并未对检测方法的准确性造成影响。建立了一种基于ORF3基因的RT-PCR检测法,该方法特异性强、灵敏度高,可准确区分PEDV野毒株和弱毒株。     

基于PEDV M基因RT-LAMP快速检测方法的建立与应用

为建立一种快速、灵敏、方便的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)早期诊断方法,本研究针对PEDV的M基因片段设计了4条引物,对反应体系的时间、温度进行了优化,对试验的特异性和敏感性进行了评估,初步建立了逆转录环介导恒温扩增技术(RT-LAMP)。结果表明,建立的PEDV RT-LAMP方法在65℃恒温下扩增60min,可通过琼脂糖凝胶电泳或SYBR Green I染料肉眼判断结果,灵敏性较普通RT-PCR高100倍。该方法与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)等无交叉反应,具有良好的特异性。采用该RT-LAMP对100份临床疑似发病粪便拭子、小肠组织、初乳样本进行检测,结果较RT-PCR更灵敏。因此,本研究初步建立了可用于临床PEDV检测的RT-LAMP检测方法,为PEDV的临床快速诊断和综合防控提供了一种新的手段。     

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种适用于现场快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因编码区序列,分别设计合成3组引物,通过对引物的筛选和反应条件优化,建立了PEDV RT-LAMP可视化快速检测方法。灵敏度和特异性试验结果显示,本方法在65℃45 min对PEDV的检测灵敏度为2 copies/μL,与猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应。利用该方法对30份送检的临床样品进行检测,检出阳性样品8份,与荧光定量RT-PCR检测结果一致。试验表明,所建立的RT-LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、结果可视、设备适用范围广等优点,适用于PEDV现场快速检测。     

Establishment and Application of Loop-mediated Isothermal Amplification for Rapid Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

This study was aimed to establish a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for detection of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), and provide a simple, sensitive, accurate and reliable tool for diagnosis of PEDV.The conservative PEDV N gene (GenBank accession number: KT799997) of PEDV was selected as a target to design six specific primers.The reaction system and temperature of LAMP were optimized, and the LAMP method for specific amplification of PEDV was established. Results showed that the PEDV LAMP detection method was established successfully, and it could detect PEDV specifically at 60℃ for 60 min,and the detection limit was 91 copies/μL, which was one hundred-fold higher than conventional RT-PCR method.75 clinical samples were detected by LAMP and PCR, respectively, the coincidence of LAMP and PCR was about 97.3%. All the data suggested that the LAMP assay had strong specificity, high sensitivity, simple operation, low equipment requirement, and was suitable for rapid detection of PEDV clinical samples.     

基于钙黄绿素显色的可视化LAMP检测猪流行性腹泻病毒的研究

针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的NP基因设计1套环介导等温扩增(LAMP)引物,在反应体系中添加钙黄绿素/氯化锰指示剂代替传统的反应后添加SYBR Green Ⅰ染料,建立了基于钙黄绿素的可视化LAMP检测PEDV的方法。该方法能在65 ℃ 1 h内特异性扩增PEDV,与猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)及大肠杆菌等均无交叉反应,检测下限为3.73 pg/μL,其结果可用肉眼判断,快捷方便。用该方法对龙岩学院动物医学研究所接诊的93份腹泻病例进行检测,结果表明,LAMP方法检测PEDV的阳性率为43.01%(40/93),高于普通PCR的检出率(38.7%,36/93)。本试验建立的可视化LAMP检测方法能用于PED诊断。     

肠炎沙门菌LAMP检测方法的建立

为建立一种能快速检测肠炎沙门菌(SE)的方法,本研究根据基因库中SE种特异性基因(sdfⅠ)的保守序列,设计一套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了SE的LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达100fg DNA,高于常规PCR方法100倍;全部反应可在1h内完成;可通过肉眼观察颜色直接判定结果;对其他常见病原体的检测结果均为阴性。结果表明建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于SE感染的快速检测。     

Rapid diagnosis of duck plagues virus infection by loop-mediated isothermal amplification

Duck virus enteritis is a serious disease among farmed and free-living ducks (Anatidae) and a constant threat to the commercial duck industry in China. In this study, a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay was developed to rapidly detect and diagnose duck plague virus (DPV) in both farmed and wild waterfowl, and compared with polymerase chain reaction (PCR) method and real-time PCR method in accuracy, sensitivity and specificity. A set of four specific primers was successfully designed to recognize six distinct genomic sequences of UL6 protein from DPV, including one forward inner primer, one back inner primer and two outer primers. The optimum reaction temperature and time were verified to be 61.5 °C and 60 min, respectively. Comparative experiments showed that LAMP assay was a simple, rapid, accurate, sensitive and specific method for detecting DPV, and was superior to PCR assay in sensitivity and specificity for DNA amplification. In addition, challenge tests indicated the newly developed LAMP method was more sensitive for the diagnosis of DPV infection than virus isolation and PCR. LAMP assay would be a good alternative method for on-farm disease diagnosis.     

实验猴粪便样品中沙门氏菌LAMP检测方法的建立及应用简

A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay was developed for detection of Salmonlla in fecal samples of experimental monkeys. According to the specific sequences (fimY) of Salmonlla in GenBank, one set of primers was selected and the reaction condition was optimized. The results showed that the detection limit of LAMP method was 1.35×10¹ and 1.35×10³ CFU/mL in Salmonella pure culture and clinical samples,respectively,which was the same as routine PCR. The amplification could complete in one hour, and the result could be distinguished by naked eyes. There was non-specific amplification of other pathogens. These results suggested that this LAMP assay was a simple and specific method for rapid detection of Salmonlla in fecal samples.     

马疱疹病毒1型LAMP检测方法的建立

本试验旨在建立一种检测马疱疹病毒1型（EHV-1）的快速、灵敏、特异的环介导等温扩增技术（LAMP）,同时评价该方法的可靠性。根据马鼻肺炎糖蛋白B（gB）基因特异保守序列设计多对LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测反应进程,进行引物筛选和反应条件的优化,建立能特异性扩增EHV-1 DNA的LAMP检测方法,并加入SYBR GreenⅠ通过肉眼判断结果。该方法在65 ℃恒温下作用50 min,使EHV-1 DNA获得了高效率的特异性扩增,与其他马易感病毒如马疱疹病毒4型（EHV-4）等无交叉反应;且具有极高的灵敏性,可检测到10^-4稀释的目标病毒,比普通PCR的灵敏度高10倍;反应结束后加入SYBR GreenⅠ肉眼观察的结果与LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。通过将4份临床样品的LAMP检测结果与已得到验证的PCR结果进行比对,结果显示符合率为100%。本研究建立的LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏、简单易操作且设备要求低等特点,具有实地检测EHV-1的前景。     

贝类折光马尔太虫LAMP可视化检测方法的建立

根据折光马尔太虫的基因保守序列设计了1套特异性环介导等温扩增（LAMP）引物,建立了折光马尔太虫LAMP可视化检测方法。该方法全部反应可在1h内完成;可通过肉眼观察颜色直接判定结果;检测的灵感性可达20fg,高于常规PCR方法100倍;对其他贝类常见病原体的检测结果均为阴性。结果表明,所建立的折光马尔太虫LAMP检测方法简便、快速、灵敏、特异,可用于贝类折光马尔太虫感染的快速检测。     

鸡传染性喉气管炎病毒可视化LAMP快速诊断方法的建立和应用

试验旨在建立简易、快速、高效的鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)检测和诊断方法。根据GenBank上公布的ILTV TK基因序列,设计检测ILTV的特异性环介导的等温扩增(loop media-ted isothermal amplification,LAMP)技术反应引物,通过对LAMP反应体系和反应条件的优化,以及特异性、敏感性和临床样品的检测,建立了ILTV LAMP检测方法。结果显示,以内引物ILT9-FIP和ILT9-BIP、外引物ILT9-F3和ILT9-B3、环引物ILT9-LB和ILT9-LF为LAMP反应引物,反应温度为66℃时,所建立的LAMP检测方法反应效率最高;所建立的LAMP检测方法能够特异性地检测ILTV(匈牙利株和王岗株),不与新城疫病毒(NDV,B株)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV,H52株和H120株)、大肠杆菌、鸡副嗜血杆菌、巴氏杆菌等发生交叉反应,且能够检测到的病毒最低浓度达到0.06pg/μL,其灵敏度是普通PCR方法的100倍;采用建立LAMP方法对50个临床样本进行检测,阳性率为14%,且与PCR检测结果的符合率达96%。本研究建立了特异性强、灵敏度高、操作简单的LAMP检测方法,适用于临床上ILTV的快速检测和诊断。     

鸡传染性贫血病毒病LAMP快速可视化检测方法的建立

为建立一种能快速检测鸡传染性贫血病毒病（CIAV）的检测方法,根据基因库中鸡传染性贫血病毒病的保守序列,设计一套特异性环介导等温扩增（LAMP）引物,建立了CIAV的LAMP可视化检测方法。该法敏感性可迭10fg,高于常规PCR方法10倍;全部反应可在1h内完成;可通过肉眼观察颜色直接判定结果;对其它鸡常见病原体的检测结果均为阴性。结果表明建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于CIAV感染的快速检测。     

鸡毒支原体LAMP可视化检测方法的建立

为建立一种鸡毒支原体(MG)的快速检测方法,本研究根据GenBank中MG的基因保守序列,设计1套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,优化反应条件,建立了MG LAMP的可视化检测方法。该方法的敏感性可达10 fg/μL,高于常规PCR方法100倍;其特异性好,对其他的鸡常见病原体的检测结果均为阴性。MG LAMP反应只需一个可控温的水浴锅,在1 h内完成全部反应,通过肉眼观察颜色直接判定结果。本研究建立的LAMP方法具有灵敏度高、特异性好、操作简便的优点,可用于MG感染的快速检测。