奶牛原代乳腺上皮细胞的培养及β酪蛋白mRNA的表达

本试验旨在建立原代乳腺上皮细胞系的体外培养方法,并进行β酪蛋白mRNA的表达验证。取新鲜泌乳期的乳腺组织,采用组织块法培养纯化原代乳腺上皮细胞,利用显微镜观察细胞形态并进行细胞生长计数,采用实时荧光定量PCR技术检测β酪蛋白mRNA表达。结果显示,纯化培养的原代乳腺上皮细胞集聚成岛屿状生长,具有典型的铺路石和鹅卵石形状,细胞生长曲线呈"S"形,符合一般细胞的生长规律,并成功表达β酪蛋白mRNA。综上所述,本研究采用组织块法成功培养出具有正常生理功能的奶牛原代乳腺上皮细胞,为后续的乳腺上皮细胞功能研究提供了良好的细胞试验模型。     

奶牛乳腺上皮细胞的不同培养方法比较及激素和细胞因子对β-酪蛋白mRNA表达的诱导

本试验旨在建立一种高效的奶牛乳腺上皮细胞培养方法,并研究不同激素和细胞因子对其表达β-酪蛋白mRNA的诱导作用.分别采用组织块培养法和机械破碎法培养奶牛乳腺上皮细胞,利用成纤维细胞和乳腺上皮细胞对胰酶的敏感性不同,对获得的细胞进行纯化.通过细胞计数法测定纯化细胞的生长曲线,通过免疫荧光组织化学染色法检测角蛋白18的表达,通过实时定量PCR法检测8种不同激素和细胞因子组合培养液诱导细胞表达β-酪蛋白mRNA的效果.结果表明:通过机械破碎法可以分离得到增殖旺盛的奶牛乳腺上皮细胞,与组织块培养法相比,具有细胞迁出速度快等优点.细胞生长曲线呈典型的“S”型.在纯化的乳腺上皮细胞及第20代乳腺上皮细胞中都检测到角蛋白18的表达.100 ng/mL类胰岛素生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)显著提高了乳腺上皮细胞中β-酪蛋白mRNA的表达(P＜0.05).由结果可知,本试验采用的机械破碎法是一种高效的奶牛乳腺上皮细胞培养方法,100 ng/mL IGF-Ⅰ对细胞中β-酪蛋白mRNA表达的诱导效果最好.     

奶牛乳腺上皮细胞的体外培养及蛋白含量测定

为建立稳定的奶牛乳腺上皮细胞系(BMEC),进一步研究乳腺上皮细胞体外蛋白的分泌情况,本试验首先采用组织块贴壁法获得奶牛乳腺上皮细胞,用胰蛋白酶纯化细胞,并运用SDS-PAGE进行鉴定。采用MTT分析细胞活力,瑞氏-吉姆萨染色法对细胞核进行分析,并测定细胞上清液中β-酪蛋白(β-CN)含量。结果显示:本试验成功培养出较纯化的奶牛乳腺上皮细胞;细胞生长曲线呈明显"S"型,用瑞氏-吉姆萨法染色细胞,细胞核形态多为卵圆形且呈现明显蓝紫色。原代乳腺上皮细胞可连续多次传代且未出现永生化,细胞呈单层贴壁生长,证明细胞活力良好;测定其β-CN含量为3.3 mg/L。     

奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定

本试验通过组织块培养法获得了奶牛乳腺上皮细胞,联合运用刮除法、相差消化和相差贴壁法、单克隆法对细胞进行纯化,应用倒置显微镜和β-酪蛋白表达检测了体外培养的奶牛乳腺上皮细胞的形态特征和乳蛋白表达,鉴定该细胞为上皮型细胞。     

崂山奶山羊乳腺上皮细胞系的建立及鉴定

实验采用组织块培养法、高密度培养和连续传代法等对崂山奶山羊乳腺上皮细胞进行培养、传代及鉴定。在对纯化的乳腺上皮细胞进行形态观察和生长动力学分析的基础上,进行染色体核型分析、免疫组化、质粒转染等方面的研究。结果表明:利用组织块培养法能够有效地进行崂山奶山羊乳腺上皮细胞的培养,并已传至40代,核型分析其染色体众数为60条,证明得到具有正常形态的崂山奶山羊乳腺细胞;进一步免疫组化显示培养细胞的波形蛋白、细胞上皮膜抗原、角蛋白和β-酪蛋白等上皮细胞标记蛋白呈阳性,证明该细胞为崂山奶山羊乳腺上皮细胞;最后油红染色可见到明显的脂肪滴,外源质粒PEGFP-N1-H-FABP能够稳定地在培养细胞中表达,表明所获得的细胞具有分泌功能。由此可见,利用组织块培养法能够成功建立崂山奶山羊乳腺上皮细胞系,并且所培养的乳腺上皮细胞具备一定的泌乳潜能。     

奶牛乳腺上皮细胞的克隆与特性分析

用组织块接种法分离培养奶牛乳腺上皮细胞,进行形态学观察、生长曲线的绘制和核型分析等生物学性状的检测,并进行酪蛋白基因的RT-PCR鉴定。结果显示,体外培养的奶牛乳腺上皮细胞生长旺盛,具有典型的上皮细胞形态特征;染色体数目为60;能够正常表达奶牛乳腺上皮细胞的2种特异性酪蛋白基因,即as1-酪蛋白基因和β-酪蛋白基因。表明成功获得了奶牛乳腺上皮细胞克隆。     

奶牛乳腺上皮细胞系的培养与鉴定

本试验旨在培养功能性奶牛乳腺上皮细胞系,为奶牛泌乳调控和奶牛乳房炎发病机制研究提供功能性的细胞模型。采用组织块细胞培养法来分离纯化并鉴定奶牛乳腺上皮细胞;采用有限稀释法单克隆奶牛乳腺上皮细胞;采用噻唑蓝(MTT)法来分析奶牛乳腺上皮细胞的生长曲线是否为正常的"S"形;观察细胞角蛋白18免疫荧光来证明所培养的细胞为上皮型;选择培养至10和20代的奶牛乳腺上皮细胞进行染色体核型分析。结果表明:1)利用组织块细胞分离法能够成功获得奶牛乳腺上皮细胞并传至20代。2)培养5~6 d成纤维细胞迅速增殖且周围分裂出少量的上皮细胞。培养8 d奶牛乳腺上皮细胞迅速增殖,形成岛屿状集落,呈单层"鹅卵石"和"铺路石"形态生长。3)奶牛乳腺上皮细胞角蛋白18鉴定为阳性。4)培养至10和20代的奶牛乳腺上皮细胞染色体数为60条,具有正常的细胞二倍体核型。综上所述,采用组织块培养细胞能够获得具有稳定性、功能性的奶牛乳腺上皮细胞,但不是永生化细胞。     

牦牛乳腺上皮细胞体外培养及鉴定

本研究旨在建立牦牛乳腺上皮细胞系,并对建立的细胞系生物学特性进行鉴定,采用组织块种植法,分离培养乳腺上皮细胞;通过胰酶消化法纯化细胞;利用免疫荧光及Western blot技术对其进行鉴定;脂质体介导法将绿色荧光蛋白基因转染进乳腺上皮细胞中,荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白基因表达;金黄色葡萄球菌侵染牦牛乳腺上皮细胞,流式细胞仪(AnnexinV/PI双染法)检测乳腺上皮细胞的凋亡,RT-PCR检测感染细胞中抗菌肽以及凋亡因子表达。结果表明,分离纯化获得牦牛乳腺上皮细胞,细胞角蛋白18表达呈阳性,波形蛋白表达呈阴性,证明培养的细胞是上皮细胞并且没有成纤维细胞污染;β-酪蛋白表达呈阳性,说明建立的乳腺上皮细胞具有一定的泌乳功能;荧光显微镜能够检测到绿色荧光蛋白表达,表明EGFP基因成功导入了乳腺上皮细胞;金黄色葡萄球菌感染牦牛乳腺上皮细胞3h后,Annexin V/PI双染法检测发现感染组细胞凋亡率明显升高,差异显著(P0.05);感染细胞中TAP(P0.01)、BNBD5(P0.01)及BAX(P0.01)表达量明显增高,BCL-2(P0.05)表达量降低。综上表明,本研究成功建立了一株稳定的牦牛乳腺上皮细胞系,该细胞系能够作为研究牦牛乳腺发育及分化的体外研究模型。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养及其生物学特性分析

旨在从奶牛乳腺组织中分离原代乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）并传代培养后探究其生物学特性。本研究从屠宰场采集健康泌乳奶牛乳腺并采用改进的酶消化法从乳腺中分离得到原代奶牛乳腺上皮细胞,通过形态学观察、免疫荧光以及染色体核型分析的方法对其进行鉴定。同时,研究第3、第6和第9代乳腺上皮细胞的生长曲线、群体倍增时间和冻存复苏活力,检测不同代次细胞分泌乳蛋白、乳脂、乳糖的功能及泌乳相关基因的表达。结果表明,所分离的奶牛乳腺上皮细胞纯度较好,细胞生长呈现S型,3个代次细胞的群体倍增时间依次为34.87、41.45和65.04 h,冻存复苏活力为88%~93%;在细胞分泌功能方面,诱导培养2 d后均能检测到酪蛋白、甘油三酯和乳糖,且各代次间无显著差异;此外,3个代次的细胞诱导后均能表达乳成分合成相关基因。本研究成功培养了原代奶牛乳腺上皮细胞,并证明直到第9代细胞仍然具有正常的生物学功能,为体外探究乳腺细胞增殖与分化机制提供了良好的试验材料和技术支撑。     

不同培养方法对山羊瘤胃上皮细胞生长及角蛋白18表达量的影响

本试验旨在研究不同培养方法对山羊瘤胃上皮细胞生长及角蛋白18(CK18)表达量的影响。采集42日龄山羊的瘤胃上皮组织,分别采用酶消化法和组织块法对其进行体外培养。通过光学显微镜观察原代培养和传代培养阶段的细胞形态,检测第5代山羊瘤胃上皮细胞的生长曲线,并采用细胞免疫荧光法对山羊瘤胃上皮细胞进行鉴定。结果显示:1)经0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸消化获得的原代培养山羊瘤胃上皮细胞于2 d开始贴壁生长,5 d细胞开始明显增多,10 d细胞数量达到最大。2)经组织块法获得的原代培养山羊瘤胃上皮细胞于4 d开始"爬出"组织块,8 d细胞开始明显增多,14 d细胞数量达到最大。3)经免疫荧光染色显示2种方法获得的细胞胞浆内CK18均呈阳性表达且细胞纯度后者明显高于前者。4)组织块法获得的细胞CK18表达量显著高于酶消化法(P0.05)。综合得出,与酶消化法相比,应用组织块法可成功获得纯度更高的山羊瘤胃上皮细胞。     

原代犬小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

旨在建立原代犬小肠上皮细胞分离培养及纯化的方法,为犬肠道病毒性、细菌性及寄生虫相关疾病研究提供细胞材料。采用组织块培养法分离培养原代犬小肠上皮细胞,胰酶差速消化法进行纯化,利用细胞形态学、间接免疫荧光法鉴定上皮细胞特性,脂多糖(LPS)刺激原代上皮细胞,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测炎性因子转录水平,鉴定原代犬小肠上皮细胞的功能。结果显示：组织块培养法获得的原代犬小肠上皮细胞可在24 h内贴壁,第3天细胞开始增殖,第4天时达到增殖顶峰,第5～7天细胞活性逐渐降低,在体外连续传代可培养至第10代。经胰蛋白酶差速消化纯化后,获得铺路石样原代犬小肠上皮细胞,生长曲线类似“S”形,上皮细胞特异性细胞角蛋白18 (CK18)鉴定呈阳性,LPS可诱导犬小肠原代上皮细胞炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的转录水平在12 h(P<0.05)、24 h(P<0.01)表达量呈显著和极显著差异。研究表明,利用组织块培养法可成功分离获得数量较多、纯度较高且具有典型上皮细胞形态和功能的犬小肠上皮细...     

组织块再移法分离培养奶山羊乳腺上皮细胞

通过比较组织块贴壁培养法、组织块再移法、胰蛋白酶消化法、胶原酶Ⅱ消化法和胶原酶消化配合组织块贴壁法分离、培养、纯化山羊乳腺上皮细胞,绘制细胞生长曲线并计算细胞群体倍增时间,研究乳腺上皮细胞培养效果。结果显示,利用胶原酶消化配合组织块贴壁法不能获得正常生长的乳腺上皮细胞;利用组织块贴壁培养法、组织块再移法和胶原酶Ⅱ消化法获得大量的乳腺上皮细胞,所得到的上皮细胞生长曲线呈典型的＂S＂型,符合细胞生长的一般规律。组织块再移法不仅可快速获得大量纯化的乳腺上皮细胞,而且所得到的细胞经传代后,细胞群体倍增时间最短、增殖能力最强,表明,该法是获得山羊乳腺上皮细胞最适宜的方法。     

牛乳腺上皮细胞的分离培养

为了对牛乳腺上皮细胞(MECs)进行分离、培养和鉴定,并研究细胞分泌功能,试验通过胶原酶消化法分离得到了牛乳腺上皮细胞,采用传代法对细胞进行纯化,对细胞标志蛋白进行免疫荧光染色鉴定,通过体外诱导和RT-PCR分析鉴定细胞的分泌功能。结果表明:分离到的牛乳腺上皮细胞具有典型乳腺上皮细胞的形态特征,表达广谱角蛋白,经诱导后可分泌β-酪蛋白。     

奶牛乳腺上皮细胞的体外分离培养及超微结构鉴定

通过组织贴块法取部分奶牛乳腺组织进行培养,并通过在培养基中添加适当浓度的营养因子以及控制消化时间将成纤维细胞去除,纯化出原代奶牛乳腺上皮细胞。通过免疫荧光鉴定,形态学观察,扫描电镜和透射电镜检测原代乳腺上皮细胞特性。观察结果显示,本试验分离培养的牛乳腺上皮细胞角蛋白18免疫荧光染色鉴定结果呈阳性。形态学观察及超微结构观察显示,试验所分离的上皮细胞呈鹅卵石样单层聚集,胞内有丰富的线粒体和内质网,细胞状态良好,传至15代以上细胞依然增殖旺盛,因此可以作为研究奶牛乳腺机能的重要工具。     

奶牛乳腺上皮细胞的二维和三维培养及培养后酪蛋白基因的表达

本试验研究了二维和三维培养对奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)形态与β-酪蛋白、κ-酪蛋白、αs1-酪蛋白基因表达的影响.试验采用内蒙古地区3头5岁泌乳期健康荷斯坦奶牛的乳腺组织,将BMEC经3代培养纯化后分别进行二维和三维培养,观察不同培养模式下细胞的生长形态,测定β-酪蛋白、A-酪蛋白、αs1-酪蛋白基因的表达量.结果表明:2种培养模式下的BMEC呈现不同的细胞形态,二维培养的BMEC呈典型铺路石样细胞形态,三维培养的BMEC则形成了类腺泡的聚集物和管腔结构.利用三维培养的BMEC的αs1-酪蛋白基因的表达量显著地高于二维培养(P＜0.05),三维培养的BMEC的β-酪蛋白和κ-酪蛋白基因的表达量极显著地高于二维培养(P＜0.01).结果提示,三维培养的BMEC3种酪蛋白基因的表达量均高于二维培养,三维培养的BMEC在形态上呈现的特点与在体内更加接近.     

组织块法培养鸡胚肠黏膜上皮细胞

本试验采用组织块方法原代培养鸡胚肠黏膜上皮细胞，倒置显微镜下细胞呈圆形，透明状，成功培养原代鸡胚肠黏膜上皮细胞。试验表明，组织块法可用于鸡胚肠黏膜上皮细胞的原代培养，具有简便易行、培养周期短、纯度高等优点，是肠道疾病良好的体外研究模型。     

牛乳腺上皮细胞体外分离和培养

从健康奶牛乳房无菌采取乳腺组织,通过添加两种不同的培养液来分离、培养、纯化牛乳腺上皮细胞,研究乳腺上皮细胞的体外培养效果。结果表明,使用组织块接种可以得到大量细胞用于体外培养。在以DMEM/F12为基础的普通培养液中进行乳腺上皮细胞体外培养,原代细胞生长较慢,细胞形态不典型。而添加表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松所组成的完全培养液中,奶牛乳腺上皮细胞生长良好。并通过细胞形态学观察,细胞染色体核型分析,荧光免疫细胞染色方法鉴定了培养的细胞表达上皮细胞特异的角蛋白K14,K15。结果表明,分离培养的细胞是牛乳腺上皮细胞。     

小鼠小肠上皮细胞的分离培养研究

通过组织块培养法进行胎鼠原代细胞培养,采用刮除法和相差消化及相差贴壁法对细胞进行纯化,用0.05%的胰蛋白酶进行消化传代对小鼠小肠上皮细胞进行了原代分离培养、传代、纯化及鉴定。结果表明:组织块培养法得到了小鼠生长状况良好的细胞,经过纯化,得到了较纯的小肠上皮细胞;形态学观察和免疫组化检测显示得到的细胞为小鼠上皮细胞。用组织块培养可以分离纯化出增殖能力较强的上皮细胞,并能进行传代纯化,通过免疫组化鉴定,证明分离出的小鼠IEC为阳性,即为小肠上皮细胞。     

小鼠小肠上皮细胞的分离培养研究

通过组织块培养法进行胎鼠原代细胞培养,采用刮除法和相差消化及相差贴壁法对细胞进行纯化,用0.05%的胰蛋白酶进行消化传代对小鼠小肠上皮细胞进行了原代分离培养、传代、纯化及鉴定.结果表明:组织块培养法得到了小鼠生长状况良好的细胞,经过纯化,得到了较纯的小肠上皮细胞;形态学观察和免疫组化检测显示得到的细胞为小鼠上皮细胞.用组织块培养可以分离纯化出增殖能力较强的上皮细胞,并能进行传代纯化,通过免疫组化鉴定,证明分离出的小鼠EEC为阳性,即为小肠上皮细胞.     

褪黑素膜受体在泌乳期奶山羊乳腺的表达及褪黑素对乳腺β-酪蛋白表达的影响

此试验旨在研究褪黑素膜受体(Melatonin membrane receptors, MT)在奶山羊乳腺中的分布和表达及褪黑素对奶山羊乳腺β-酪蛋白(β-casein)表达的调节作用。以泌乳期奶山羊为研究对象,采用Real-time PCR和免疫组织化学染色方法检测MT1和MT2在泌乳期不同阶段奶山羊乳腺中的表达和分布;褪黑素处理体外培养的泌乳期乳腺组织,Real-time PCR方法检测其β-酪蛋白mRNA的表达情况。结果发现:(1)MT1和MT2 mRNA在泌乳期奶山羊乳腺都有表达,并具有相同的表达趋势,泌乳高峰期(泌乳期60 d)显著高于泌乳上升期(泌乳期30 d)和泌乳下降期(泌乳期120 d)(P0.05);(2)MT1和MT2主要定位于乳腺上皮细胞,泌乳高峰期为强阳性,泌乳上升期和下降期阳性反应较弱;(3)褪黑素处理能显著下调乳腺组织β-酪蛋白mRNA的表达(P0.05)。结果表明,褪黑素能直接作用于乳腺,调节泌乳期奶山羊泌乳活动。