非洲猪瘟病毒实时荧光LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种快速简便、灵敏度高、准确性好的非洲猪瘟病毒恒温快速检测方法,根据ASFV P72基因保守区域设计特异性引物,优化引物浓度、反应温度、反应时间,建立了一种基于SYTO9荧光染料的非洲猪瘟病毒实时荧光LAMP快速检测方法。结果表明,该方法在63℃条件下扩增40 min,该方法灵敏度高,最低可检测限为10 copies/μL;特异性良好,与猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒无交叉反应;重复性好,变异系数低于5%。对70份临床样本检测,4份血液样品和9份脾脏样品检测阳性,与荧光定量PCR检测结果符合率为100%。该方法灵敏度高、特异性强、重复性好、符合率高,适用于非洲猪瘟现场快速诊断。     

非洲猪瘟病毒MGF-505R基因缺失株双重荧光RPA检测方法的建立及应用

旨在建立一种快速现场筛查非洲猪瘟病毒(ASFV)基因缺失株的方法，以便鉴别我国复杂的ASFV感染情况。通过分析国内ASFV流行态势，选择MGF-505R基因及B646L基因，设计特异性引物及exo探针，对其进行敏感性、特异性分析，并进行临床应用。利用双重-重组酶聚合酶扩增(RPA)方法检测ASFV MGF-505R及B646L基因，结果显示：检测时间在15 min内，最低检测限均为10 copies/反应，且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型等均无交叉反应；利用所建立方法对266份临床样品进行检测，结果与世界动物卫生组织(WOAH)推荐荧光PCR检测方法的符合率为100%。建立的ASFV MGF-505R基因缺失株的荧光RPA检测方法适配可移动式荧光RPA检测仪，具有快速、灵敏度高、特异性强的优点，适用于ASFV现场快速临床检测，为非洲猪瘟疫情防控提供一种新的筛查手段。     

非洲猪瘟病毒K196R基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒定量检测方法,本研究根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)早期表达基因K196R的基因序列,设计了TaqMan荧光定量PCR引物及探针,通过优化退火温度、引物及探针浓度,建立了快速检测ASFV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法选择的引物具有高度灵敏性和特异性,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系(R~2=0.998),对ASFV核酸最低检测下限为1.3拷贝,且与猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应。本研究建立的K196R基因实时荧光定量PCR检测方法为非洲猪瘟疫情提供了一种新型、灵敏和特异的早期检测方法。     

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种适用于现场快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因编码区序列,分别设计合成3组引物,通过对引物的筛选和反应条件优化,建立了PEDV RT-LAMP可视化快速检测方法。灵敏度和特异性试验结果显示,本方法在65℃45 min对PEDV的检测灵敏度为2 copies/μL,与猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应。利用该方法对30份送检的临床样品进行检测,检出阳性样品8份,与荧光定量RT-PCR检测结果一致。试验表明,所建立的RT-LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、结果可视、设备适用范围广等优点,适用于PEDV现场快速检测。     

基于E184L基因的非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种高度接触性传染病。由于ASFV的感染机制极为复杂,基因型多,至今尚无有效疫苗用于防控,防止该病暴发主要依赖于早期快速诊断和控制。为建立一种高效快速、特异的ASFV检测方法,根据ASFV的E184L基因序列,设计了TaqMan荧光定量PCR引物及探针,建立了检测ASFV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,该方法设计的引物具有高度特异性,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数为0.992,对ASFV核酸最低检测限为1.51拷贝,且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等不存在交叉反应。建立的基于ASFV E184L基因实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异地对ASFV核酸进行定量分析,丰富了ASFV的检测方法。     

非洲猪瘟病毒锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因核苷酸序列设计特异性引物和锁核酸(locked nucleic acid,LNA)-TaqMan探针,建立了基于P72基因的LNA-TaqMan探针的ASFV荧光定量PCR方法。结果显示,所建立的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度,最低检测限为3.9拷贝/μL,且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应;该方法的重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%;56份临床样品的检测结果与OIE推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100%。结果表明,本试验所建立的ASFV LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法敏感性、特异性和重复性良好,为ASFV检测提供了一种新的技术选择。     

非洲猪瘟病毒环介导恒温扩增快速检测技术的建立及应用

本研究基于非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）vp72基因设计引物,建立了能够快速检测非洲猪瘟病毒的环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）。将LAMP与OIE参考的PCR检测方法进行比较,并且应用LAMP对非洲猪瘟参考实验室提供的非洲猪瘟病毒17个毒株的基因组以及国内收集的50份猪的基因组、30份蜱的基因组进行检测。结果显示,本研究设计的引物具有良好的特异性和敏感性,所建立的LAMP能够成功扩增非洲猪瘟病毒17个毒株的基因组,而野外收集的猪和蜱的基因组检测均为阴性。因此,本研究所建立的方法能够用于非洲猪瘟的快速诊断以及防控。     

多重荧光PCR鉴别诊断猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒

为了建立一种快速、灵敏、特异的能够同时检测猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的多重荧光PCR方法。根据GenBank中公布的猪瘟病毒基因序列,设计一套特异性的引物和探针,对猪瘟病料提取RNA,经RT—PCR扩增后将产物回收,克隆至pMDl8-T构建pMDl8-T—CSFV阳性质粒;非洲猪瘟的目的片段序列采用化学合成,构建pMDl8-T—ASFV阳性质粒。以两种阳性质粒为模板时建立的多重荧光PCR方法做特异性、灵敏度和重复性试验,结果表明该方法可以将猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒同口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪水泡病病毒、猪圆环病毒2型区分开,灵敏度可以达到10拷贝的数量级．而且方法稳定。对2份已知猪瘟阳性血清样品和120份猪内脏、猪鼻腔拭子及血清样品检测后．发现对已知阳性样品的检测结果符合预期目标。未知样品检出猪瘟病毒3份阳性,未检出非洲猪瘟病毒阳性。     

非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测方法的建立

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)通用型高通量检测技术,利用高度保守的非结构DNA聚合酶G1211R基因,制备质粒标准品,建立实时荧光LAMP方法,出现典型的S形核酸扩增曲线,扩增产物具有特异的熔解曲线。G1211R基因质粒标准品在1.81×10~5拷贝数/μL~1.81×10~9拷贝数/μL对数值与Ct值之间的线性关系良好。以ASFV E70株病毒核酸为模板,LAMP检测灵敏度达到21pg,优于荧光定量PCR方法。重复性试验LAMP检测批内和批间变异系数均小于5%。LAMP方法检测ASFV特异性良好,与猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及昆虫核酸无交叉反应。以ASFV Arm 07株制备各种临床模拟样品,检出阳性率达到17.31%。检测方法的建立,可为非洲猪瘟防控提供新的技术手段,有利于不同基因型毒株检测和出入境快速筛查。     

鉴别非洲猪瘟病毒和猪瘟病毒野毒株二重TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

旨在建立特异、敏感的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪瘟病毒(CSFV)野毒株的快速鉴别检测。针对ASFV的P72基因和CSFV野毒株的5′UTR非编码区序列的保守区域分别设计1对特异性引物和1条探针,经优化反应条件,建立一种基于TaqMan MGB探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和稳定性,对50份临床样品进行检测,并与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法进行比较分析。结果显示:建立的鉴别ASFV和CSFV野毒株二重FQ-PCR检测方法在10~0～10~6拷贝·μL~(-1)模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和CSFV基因出现阳性扩增信号,但对猪瘟病毒疫苗株、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、副猪嗜血杆菌等病原对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在1.18%～2.08%,重复性良好;对ASFV和CSFV的最低检测模板浓度均为10拷贝·μL~(-1);利用建立的二重FQ-PCR方法对50份临床样品进行检测,检测结果与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法结果完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法,为ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。     

非洲猪瘟病毒PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)结构蛋白基因vp73的序列,设计一对特异性检测引物,扩增片段251 bp,建立了检测ASFV的PCR方法。与OIE推荐使用的2组PCR引物进行比对试验,结果表明,3组引物的检测特异性相当,但本研究设计的引物灵敏度至少高出100倍。表明所建立的PCR方法能敏感、快速地检测非洲猪瘟病毒。     

非洲猪瘟病毒检测试剂盒的研制

针对非洲猪瘟病毒（ASFV）P54基因建立荧光PCR检测方法,通过优化引物、TaqMan探针浓度及反应温度,研发了ASFV检测的荧光PCR检测试剂盒。经灵敏度的重复性试验及3种不同型号荧光PCR仪使用验证,所研发的试剂盒灵敏度为101copy/μL,适用于不同型号荧光PCR仪使用,可用于对非洲猪瘟病毒的快速检测。     

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

为建立一种适用于现场快速检测的猪流行性腹泻病毒(PEDV)LAMP技术,基于羟基萘酚蓝(HNB)的可视化显色特点,根据PEDV M基因编码区序列,设计合成1套引物,通过反应物浓度和反应条件优化,建立了可闭管检测的PEDV RT-LAMP检测方法。特异性和灵敏度试验结果显示,建立的RT-LAMP检测技术快速、灵敏、特异,可于1 h内检出0.2 mL 0.1 TCID₅₀/mL的病毒RNA,与实时荧光RT-PCR检测方法灵敏度一致,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪链球菌2型核酸不发生交叉反应。利用该方法对187份送检的粪拭子及病死猪组织样品进行应用检测,检出阳性样品9份,与荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。试验结果表明,所建立的方法快速、特异,重复性满足要求,适用于送检样品的PEDV快速检测。     

恒温隔绝式荧光PCR检测非洲猪瘟病毒核酸方法的建立

恒温隔绝式荧光PCR(iiPCR)是一种简便、快速及可使用于现场检测的荧光PCR方法.本研究采用农业农村部推荐的检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)核酸的荧光定量PCR方法的引物和探针,通过对引物、探针、Taq酶等反应体系的优化,建立了基于恒温隔绝式荧光PCR的ASFV检测方...     

非洲猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

建立一种TaqMan荧光定量PCR检测方法,用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)保守结构蛋白P72基因的检测。参照GenBank登录的ASFV P72相关基因序列,设计合成1对特异性引物与1个TaqMan探针,通过对反应条件和反应体系进行优化,建立了快速检测ASFV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,对该方法的灵敏性、特异性与重复性进行了验证。结果显示,该方法能有效扩增1.0×10~0～1.0×10~9拷贝/μL ASFV-P72标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系;检测灵敏度为1.0×10~0拷贝;对猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等病原不发生交叉反应;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%。结果表明,本试验建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于临床样本中ASFV的检测,从而更好地对ASF疫情进行监测和诊断。     

一种基于CP530R序列非洲猪瘟病毒TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、敏感和特异地检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的方法,试验根据ASFV CP530R基因序列设计1对特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立了一种检测ASFV的Taq Man-MGB探针实时荧光PCR方法,并对该方法进行了特异性、定量线性范围、敏感性和重复性等试验评价。结果表明:该方法仅对ASFV发生特异性扩增反应,不与伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)、经典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪流感病毒(SIV)发生交叉反应,具有良好的特异性。用该方法检测质粒标准对照(PCR2.1-ASFV-CP530R)的线性范围为6.1×102~6.1×109copies/μL,标准曲线方程为y=-3.449x+38.10,相关系数(R2)为0.999,最低可检测到61个拷贝的质粒标准对照分子;对5个不同浓度(6.1×103~6.1×107copies/μL)的质粒标准对照进行双份样品的4次重复检测,每个浓度质粒标准对照的Ct值变异系数均小于2.0%,具有良好的重现性;用该方法对126份进口猪的血液样品和38份猪肉样品进行ASFV检测,结果均为阴性。说明本方法可用于活猪临床样品和生猪样品中ASFV的检测。     

微流控芯片法在非洲猪瘟病毒核酸快速检测中的性能分析

为评估微流控芯片法在非洲猪瘟病毒(ASFV)核酸快速检测中的各项性能,验证该方法的敏感性、特异性、重复性和临床效果,本研究将ASFV VP72质粒标准物质、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和伪狂犬病病毒(PRV)培养物各1份以及临床样本43份进行核酸提取,用ASFV微流控芯片快速检测试剂盒进行测试研究,并与市场上某品牌ASFV荧光定量PCR检测试剂盒进行比对。结果表明:微流控芯片法可以在15～30 min内,实现2.5 copies/μL的最低检出限,与荧光定量PCR具有相同的敏感性和重复性;同时该方法对CSFV、PEDV、TGEV、PCV2和PRV病毒培养物均无交叉反应,特异性良好;通过对43份临床样本测试显示,微流控芯片法与荧光定量PCR的临床符合率为97.67%(42/43)。研究表明,微流控芯片法在ASFV核酸检测上性能良好。     

鉴别非洲猪瘟病毒和猪瘟病毒野毒株二重TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

旨在建立特异、敏感的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）方法,用于非洲猪瘟病毒（ASFV）和猪瘟病毒（CSFV）野毒株的快速鉴别检测。针对ASFV的P72基因和CSFV野毒株的5'UTR非编码区序列的保守区域分别设计1对特异性引物和1条探针,经优化反应条件,建立一种基于TaqMan MGB探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和稳定性,对50份临床样品进行检测,并与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法进行比较分析。结果显示：建立的鉴别ASFV和CSFV野毒株二重FQ-PCR检测方法在10⁰~10⁶拷贝·μL^-1模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和CSFV基因出现阳性扩增信号,但对猪瘟病毒疫苗株、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、副猪嗜血杆菌等病原对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在1.18%~2.08%,重复性良好;对ASFV和CSFV的最低检测模板浓度均为10拷贝·μL^-1;利用建立的二重FQ-PCR方法对50份临床样品进行检测,检测结果与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法结果完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法,为ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。     

非洲猪瘟病毒常规PCR及Real-time PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因的核苷酸序列,设计并合成引物以及荧光标记的TaqMan探针,以含P72基因的重组质粒作为阳性模板,用于常规PCR和Real-time PCR方法的建立,结果表明常规PCR的检测灵敏度是600个拷贝的病毒核酸分子,Real-time PCR的检测灵敏度是20个拷贝的病毒核酸分子,两种PCR检测方法均具有特异性强、简单快速的优点。可以用于出入境检验检疫部门对非洲猪瘟病毒的快速检测。     

微流控芯片环介导等温扩增技术检测3种猪圆环病毒

为建立快速区分3种猪圆环病毒（PCV2、PCV3和PCV4）的现场检测方法,采用微流控芯片环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）,收集3种猪圆环病毒临床阳性样本进行核酸提取,与市场上3种猪圆环病毒荧光探针法检测试剂盒进行灵敏度、特异性和重复性同步比对。结果显示：微流控芯片LAMP法在3种猪圆环病毒联检测试中具有非常高的灵敏度,可以在30 min内,实现不低于荧光定量PCR法的敏感性;与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒临床阳性样本均无交叉反应,特异性好;测试3种猪圆环病毒重复性Ct值变异系数（CV）均在2%以下,稳定性好。结果表明：3种猪圆环病毒微流控芯片快速联检技术特异性好、灵敏度高、重复性强,检测速度快,环境要求低,可以满足现场检测的要求,适用于养猪场等场所的猪圆环病毒现场快速检测。本方法的建立为猪相关病原体的现场快速核酸检测提供了有力工具。