小地老虎2种不同类型肌动蛋白基因的克隆与序列分析

本研究以鳞翅目夜蛾科昆虫小地老虎［Agrotis ipsilon（Hüfnagel）］3龄幼虫整个虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术（RACE）,分别扩增得到2条肌动蛋白的cDNA序列Aiactin1和Aiactin2。GenBank数据库搜索及序列比对结果表明,克隆的2条肌动蛋白基因应属于2种不同类型的肌动蛋白,Aiactin1为肌肉特异型肌动蛋白,Aiactin2为细胞质特异型肌动蛋白。Aiactin1的cDNA序列含有1 469个碱基,Aiactin2的cDNA序列含有1 408个碱基。2条基因的cDNA序列均包括一个1 131个碱基的开放阅读框,编码一个含376个氨基酸的蛋白。Aiactin1肌动蛋白分子量约为41.77 ku,等电点5.22;Aiactin2肌动蛋白分子量约为41.83 ku,等电点5.47。Prosite软件分析结果表明,Aiactin1和Aiactin2肌动蛋白氨基酸序列中都存在3个肌动蛋白特征片段。2个基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号。     

降解赤霉病菌毒素Tri101基因的原核表达及抗体制备

采用RT-PCR方法克隆了编码禾谷镰刀菌单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶Tri101基因的cDNA序列,并连接到原核表达载体pGEX-4T2上,将获得的重组载体pGEX-4T2/Tri101转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,经IPTG诱导后,Tri101基因在大肠杆菌BL21中获得了高效表达,融合蛋白GST-Tri101分子量为75.45 kDa。将该融合蛋白切胶纯化后免疫家兔,制备兔抗GST-Tri101多克隆抗体。经ELISA法测定抗体效价大于1∶256 000。Western blot分析表明制备的抗体与原核细胞体外表达的Tri101蛋白可以特异性结合,表明该抗体的特异性良好。应用该抗体验证了感赤霉病小麦中Tri101基因的表达。兔抗GST-Tri101抗体的成功制备,为进一步研究Tri101的生物学功能、细胞定位以及在其它植物中的表达等奠定了基础。     

黏虫体内两种微管蛋白基因cDNA序列的克隆与序列分析

以黏虫4龄幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),分别扩增得到该虫的α和β微管蛋白基因的cDNA序列各1条。其中α微管蛋白基因的cDNA序列1 443个碱基,包括一个1 353个碱基的开放阅读框,编码一个含450个氨基酸的蛋白,分子量约为50.0ku。氨基酸的142~148位存在一个微管蛋白标志信号片段GGGTGSG,在氨基酸序列的C-端有一个酪氨酸残基,N-端存在一个对转录后调控非常重要的保守区MRECI序列,以上特点与其他昆虫α微管蛋白氨基酸序列相同。黏虫β微管蛋白基因cDNA序列含1 906个碱基,开放读码框1 344个碱基,编码氨基酸447个,分子量约为50.2ku,等电点4.75。1~4个氨基酸MREI为β微管蛋白转录后调控信号,140~146GGGTGSG位同样存在一个微管蛋白标志信号片段。序列比对表明,克隆的α和β微管蛋白基因与其他昆虫的α和β微管蛋白基因在核苷酸和氨基酸水平上都是高度同源的,黏虫与家蚕(Bombyx mori)α微管蛋白的氨基酸序列同源性达到99.3%,与其他3种夜蛾科昆虫α微管蛋白的氨基酸序列同源性更是达到100%。黏虫与家蚕β微管蛋白的氨基酸序列同源性达到98.7%,与烟草天蛾β微管蛋白的氨基酸序列同源性达到99.6%。两个基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号分别为EU100016和EU234504。     

香蕉束顶病毒海口分离物Rep基因的克隆、原核表达、抗血清制备及检测

［目的］ 对香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)海口分离物起始蛋白(replication initiation proteins, Rep)基因进行克隆、原核表达、抗血清制备,为BBTV有效的检测及分子流行病学等研究奠定基础。［方法］ 以海口地区染病香蕉幼嫩假茎和叶片的总DNA为模板,通过PCR技术克隆BBTV海口分离物的起始蛋白基因,连接到表达载体并进行大肠杆菌原核表达,制备高效价特异性抗血清。［结果］ 应用PCR方法从染毒香蕉幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增复制rep基因,回收目的片段后经酶切,获得了含BBTV Rep基因的重组质粒pET32b Rep。将重组质粒转化E.coli BL21(DE3),经不同的时间、温度及IPTG浓度优化,12% SDS PAGE电泳分析,在20 ℃、0.1 mmol/L IPTG条件诱导4h,最终获得大量的可溶性融合蛋白。将可溶性蛋白上清液经Ni2+ NTA亲和层析柱纯化,得到高纯度的融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫家兔,获得了BBTV Rep蛋白抗血清。以融合蛋白做抗原,间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000。以田间样品做抗原时,结果表明抗血清最佳工作浓度为1∶1 000。Western blot鉴定结果表明抗血清能与融合蛋白特异性结合。［结论］ 利用Rep基因制备的特异性抗血清在BBTV病毒粒体的组装机制研究及病毒病诊断上具有重要的应用价值。     

禾谷缢管蚜RpGST1基因的克隆、序列分析及原核表达

为揭示禾谷缢管蚜耐药性的分子机理,采用RT-PCR方法克隆了禾谷缢管蚜谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)的cDNA序列,命名为RpGST1(GenBank登录号KP192850),并构建原核表达载体pET32-RpGST1,对RpGST1基因进行原核表达、SDS-PAGE和Western blotting检测。结果显示,禾谷缢管蚜RpGST1基因的编码区长651 bp,编码216个氨基酸,分子量约为24.06 kD,理论等电点为6.20;RpGST1基因在大肠杆菌中成功表达出一个分子量约为45 kD的融合蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小一致。通过克隆RpGST1基因的cDNA序列并进行序列比对分析,表明构建了GST基因的原核表达载体并成功表达。     

棉铃虫类肌钙蛋白基因的克隆、原核表达纯化及其时空表达谱分析

为探索棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)类肌钙蛋白基因HaCal的生理功能及其所编码蛋白的生物特性,采用PCR方法克隆了HaCal的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,借助在线软件对其进行生物信息学分析,通过原核表达技术诱导表达和纯化其编码的蛋白,并通过实时荧光定量PCR技术分析其在棉铃虫不同发育龄期和组织中的表达量。结果显示,HaCal的ORF序列长度为564 bp,编码187个氨基酸,理论分子量为20.52 kD,理论等电点为7.64。其保守结构域与Calponin家族一致,但不含跨膜区和信号肽,系亲水性蛋白。原核表达结果显示,融合蛋白大小与理论值一致,纯化获得了纯度较高的目的蛋白。HaCal在棉铃虫幼虫不同发育阶段和不同组织中均有表达,在6龄幼虫体内表达量最高,是1龄幼虫的2.34倍;在5龄幼虫中肠中表达量最高,是头部的257.14倍。表明棉铃虫类肌钙蛋白基因HaCal可能与棉铃虫的生长发育过程密切相关。     

温度胁迫下沙葱萤叶甲小热激蛋白基因GdHsp20.6的克隆及表达分析（英文）

为明确小热激蛋白在沙葱萤叶甲Galeruca daurica应对温度胁迫中的作用,采用PCR方法克隆沙葱萤叶甲小热激蛋白基因Hsp20(GdHsp20.6)完整的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,应用在线软件对GdHsp20.6基因进行生物信息学分析,通过原核表达技术诱导表达及纯化其编码蛋白,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技术分析不同温度胁迫下GdHsp20.6基因的表达量。结果显示,GdHsp20.6基因ORF序列长度为543 bp,编码180个氨基酸,预测分子量为20.6 kD,无跨膜区和信号肽。GdHsp20.6氨基酸序列有高度保守的α-结构域。GdHsp20.6氨基酸序列与其它鞘翅目昆虫的Hsp20氨基酸序列有较高的一致性,其中与花绒寄甲Dastarcus helophoroides的Hsp20.99氨基酸序列的一致性最高,为63%。GdHsp20.6基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)细胞系中成功表达,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导后GdHsp20.6蛋白成功表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western-blot分析表明融合蛋白大小与预测大小一致,并纯化获得了纯度较高的目的蛋白GdHsp20.6。低温(-10～5℃)和高温(35～40℃)处理1 h以及处理后25℃恢复30 min均能诱导GdHsp20.6基因表达上调,并且0℃处理30～120 min也能诱导GdHsp20.6基因表达上调。表明GdHsp20.6基因在沙葱萤叶甲应对低温和高温胁迫中可能起着重要作用。     

香蕉苞片花叶病毒CP基因的原核表达及抗血清制备

本试验成功构建了香蕉苞片花叶病毒(Banana bract mosaic virus,BBrMV)外壳蛋白(coat pro-tein,CP)基因的原核表达载体,并诱导表达了34 kDa的融合蛋白His.CP。对该原核表达蛋白的可溶性分析表明,该融合蛋白以包涵体形式存在。利用组氨酸标签纯化试剂盒对目的蛋白进行了纯化,获得了高纯度的融合蛋白。以纯化的蛋白为抗原免疫健康家兔,成功制备了抗BBrMV CP基因编码蛋白的兔抗血清。Western-blotting结果表明这种抗血清有很强的特异性。血清效价测定的效价在51 200倍以上,对植物材料的合适检测浓度为1:800～1:3 200。     

芽胞杆菌CQBS03抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表达

为了探讨柑桔溃疡病生防菌芽胞杆菌Bacillus CQBS03菌株TasA基因的功能,采用PCR方法从CQBS03基因组DNA中扩增出编码TasA基因的全长DNA序列,并构建pEASY-E1/TasA原核表达载体,经大肠杆菌Escherichia coli表达获得TasA基因的融合表达蛋白,纸碟法检验融合蛋白对柑桔溃疡病菌Xanthomonas citri citri的抑制作用。结果显示,CQBS03菌株的TasA基因包含1个786 bp的完整开放阅读框（GenBank登录号为JQ309841）,编码261个氨基酸残基;该序列与来源于解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens的1个已知同源TasA基因序列FJ713580的相似性达99.75%。原核表达产物经SDS-PAGE分析,检测到约31 kD的融合蛋白;纯化后的融合蛋白对柑桔溃疡病菌有明显的抑制作用,72 h后抑菌圈直径达11.5 mm。研究表明TasA基因是生防菌芽胞杆菌CQBS03抑制柑桔溃疡病菌的功能基因之一,并且该基因对原核表达宿主没有抑制作用,具有较好的开发利用前景。     

苹果茎沟病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗血清制备

利用原核系统表达病毒编码的结构蛋白为抗原制备多克隆抗体是提高检测灵敏度和降低检测成本的重要途径。根据已报道的苹果茎沟病毒Apple stem grooving virus(ASGV)外壳蛋白(coatprotein,CP)基因的核苷酸序列设计合成引物,利用RT-PCR方法克隆了ASGV的cp基因(命名为ASGV cp BJ),该基因由714个核苷酸组成,与GenBank中已报道的ASGV的cp基因核苷酸相似性为86%~96%。将ASGV的cp基因克隆到原核表达载体pET-28a上,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选得到阳性克隆pET-ASGVcp。SDS-PAGE电泳分析发现,经IPTG诱导,ASGVcp在大肠杆菌中得到高效表达,获得的融合蛋白的分子量约为33kD。利用Ni珠吸附法纯化原核表达的目的蛋白,并以此蛋白为抗原制备了抗血清,ACP-ELISA检测结果显示,此抗血清效价为1∶4 096。Western blot分析结果显示,该抗血清具有高度特异性,能够用于ASGV的快速检测。     

番茄黄化曲叶病毒V 2基因原核表达及多克隆抗体制备

 通过PCR的方法,从番茄黄化曲叶病毒江苏分离物DNA中扩增到V2基因,并克隆到pMD18-T载体,序列测定结果显示其与报道的XH2分离物序列完全一致,核苷酸序列全长351 bp,编码115个氨基酸,推测分子量约13 kD。将该V2基因亚克隆到原核表达载体PET32a中获得重组表达载体PET32a-V2,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG可诱导1个分子量约为32 kDa的融合蛋白（含His标签）表达,经Ni⁺ NTA亲和柱纯化,获得纯化的重组蛋白,免疫家兔制备TYLCV-V2蛋白的多克隆抗体Anti-V2,间接ELISA测定Anti-V2的效价达1∶655 360,Western blot及DIBA分析结果表明Anti-V2可与V2蛋白发生特异血清反应,可为进一步研究V2蛋白的功能提供参考。     

鞭毛素蛋白FliCxcv对水稻免疫反应的诱导功能鉴定

 为揭示来源于番茄细菌性斑点病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xcv)菌株XV18鞭毛素(FliCxcv)作为一种病原相关分子模式(PAMP)诱导水稻免疫反应的功能,本研究对FliCxcv编码基因flicxcv进行了基因克隆、序列分析、原核表达、蛋白纯化和诱导活性测定。结果表明,通过PCR特异性扩增,从Xcv菌株XV18中克隆了1 200 bp的fliCxcv基因片段,其序列与GenBank中己测序菌株的完全一致。在大肠杆菌中对该基因全长、N端和C端截短序列进行了原核表达,并获得了纯化的FliCxcv全长及其截短蛋白。将纯化蛋白浸润接种到水稻品种日本晴叶片组织,发现FliCxcv全长及其截短蛋白均能诱导水稻叶片细胞死亡、H₂O₂产生以及防卫基因(OsPAL和OsPR1b)表达等免疫反应,但诱导活性存在差异。因此,本研究验证了FliCxcv具有激发水稻细胞免疫反应的PAMP功能,为水稻免疫诱导制剂的研发提供了材料。     

中华卵索线虫β-actin基因的克隆与分析

利用RACE技术克隆中华卵索线虫Ovomermis sinensisβ-actin基因,RT-PCR方法检测该基因在中华卵索线虫不同发育时期的表达情况。结果首次获得了中华卵索线虫β-actin基因全长cDNA序列。该基因cDNA全长1636bp,其中ORF长1131bp,编码376个氨基酸;5′UTR长137bp;3′UTR长367bp。由该cDNA推导的蛋白质序列与秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans、人类等物种的β-actin蛋白序列相似性均在95%以上。系统进化树显示其系统发育关系与传统的分类关系基本一致。β-actin基因在不同发育时期的线虫中持续恒量表达。由此推断中华卵索线虫β-actin基因具有高度保守性,可以作为生物物种进化的分子标志,且能较好反映物种间的系统发生关系,是量化实验的理想内标参照。     

鞭毛素蛋白FliCaaa诱导水稻免疫反应的活性测定

为阐明燕麦嗜酸菌(Acidovorax avenae subsp.avenae,Aaa)鞭毛素蛋白Fli Caaa及其结构域对水稻免疫反应的诱导作用,通过分子生物学和生物信息学方法,对Aaa菌株IPN1的鞭毛素进行基因克隆及其序列分析;在大肠杆菌中对该基因全长、N端和C端片段进行了原核表达,纯化了Fli Caaa蛋白及其截短肽段;采用水稻叶片浸润法测定了表达蛋白对水稻免疫反应的诱导活性。结果表明,通过特异性引物的PCR扩增,获得1 479 bp的鞭毛素基因fli Caaa,其编码产物含有492个氨基酸,分子量为49.4 k D,具有flagellin-N和-C两个保守结构域;原核诱导表达获得了Fli Caaa、Fli Caaa-N和Fli Caaa-C可溶性融合蛋白;3种纯化蛋白均能诱导水稻细胞死亡和H2O2产生等免疫反应,但诱导能力略有差异。     

小地老虎化学感受蛋白AipsCSP2配体结合特性分析

为了明确小地老虎化学感受蛋白基因AipsCSP2在雌、雄成虫各组织中的表达情况,解析AipsCSP2蛋白的配体结合特性并探讨其功能。本文基于小地老虎性腺转录组数据,利用PCR技术克隆AipsCSP2基因,并进行生物信息学和系统进化分析;采用qPCR技术测定该基因在小地老虎雌、雄成虫不同组织中的表达水平; 利用原核表达技术体外表达并纯化AipsCSP2蛋白;最后采用荧光竞争性结合试验测定该蛋白与小地老虎和其他鳞翅目昆虫性信息素组分以及主要寄主植物挥发物的结合能力。结果显示AipsCSP2基因开放阅读框（open reading frame,ORF）长度为360 bp,编码119个氨基酸,氨基酸序列中具有4个保守半胱氨酸位点,是典型的化学感受蛋白;组织表达谱结果显示AipsCSP2基因在雌成虫性腺和雄成虫附腺中特异高表达,在其他组织中表达量较低;荧光竞争性结合试验结果表明,AipsCSP2蛋白和小地老虎性信息素组分顺-11-十六碳乙酸酯的合成前体顺-11-十六碳醛有着极其强的结合能力,Ki值为1.48 μmol/L,此外AipsCSP2蛋白和其他鳞翅目昆虫的醇类和醛类性信息素如十四烷醇、顺-9-十六碳醛、顺-7-十六碳醛也有着极其强的结合能力,Ki值分别为1.10 μmol/L、0.63 μmol/L和1.51 μmol/L,和小地老虎性信息素组分顺-7-十二碳乙酸酯、顺-8-十二碳乙酸酯的结合能力为中等,与小地老虎主要寄主植物挥发物结合能力较弱或不结合。推测AipsCSP2蛋白可能主要参与了小地老虎性信息素的合成与识别过程,并在生殖活动中起着重要的作用。     

苜蓿夜蛾hsp90基因cDNA序列的克隆与表达研究

热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)是生物体适应外界不良环境条件的关键蛋白。热休克蛋白90(HSP90)是HSP家族的重要成员。本试验以苜蓿夜蛾为材料提取虫体总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到hsp90基因全长cDNA序列,命名为Hvhsp90(GenBank登录号KF636495)。该序列含有2 472个碱基,包括一个2 154个碱基的开放阅读框,编码一个含717个氨基酸的蛋白,分子量约为82.5ku,等电点为4.97,且含有5个标签序列及胞质特征序列MEEVD,推导的氨基酸序列与鳞翅目其他昆虫HSP90相似性85%~99%之间。RTPCR结果表明,该基因在苜蓿夜蛾不同发育时期和不同组织均有mRNA水平的特异性表达。该基因在大肠杆菌表达系统中进行了诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,HvHSP90能够高效表达,并与预测的融合蛋白分子量相符。     

水稻瘤矮病毒广东分离物基因组第10组分的序列分析及原核表达

 应用RT-PCR技术克隆了水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)广东分离物基因组的第10片段,并测定了全序列。结果表明,RGDV广东分离物S10(登录号EF532325)全长1198bp,含有一个ORF,编码一条由320氨基酸组成、推测分子量约36kDa的多肽。与泰国分离物相应组分相比,基因结构基本一致,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.2%和98.8%;S10编码多肽与水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus,RDV)s9编码蛋白及伤瘤病毒(Wound tumor virus,WTV)S11编码蛋白也分别具有29%和33%的相似性。本研究还将S10cDNA克隆至原核表达载体pET28b(+)上,通过IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达,并利用His,Bind树脂纯化得到电泳纯级制品。本工作为进一步研究S10编码蛋白的结构与功能奠定了一定的基础。     

蛋白激发子基因peaT1植物表达载体的构建及其转化棉花的研究*

［目的］ 构建蛋白激发子基因 peaT1的植物表达载体并转化棉花品种‘CCRI24’。［方法］ 设计含有 PstⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,以质粒pET28a-peaT1为模板扩增得到 peaT1序列,将其通过中间载体pG4AS-cup克隆到植物表达载体pCAMBIA2300上,通过农杆菌介导法转化棉花品种‘CCRI24’,诱导并筛选抗性愈伤和胚性愈伤,通过PCR、southern杂交和RT-PCR检测筛选的棉株。［结果］ 构建了含有增强子和多联终止子的植物表达载体pCAMBIA2300-peaT1,获得了大量的胚状体和4棵再生苗并嫁接成活,验证了蛋白激发子基因 peaT1已经整合到再生苗2和4基因组当中。［结论］ 本研究为进一步开展蛋白激发子基因 peaT1转化棉花的研究提供了基础材料。     

高粱GRF基因家族鉴定及SbGRF4原核表达分析

为研究高粱生长调控因子(growth-regulating factor,GRF)在高粱生长过程中的功能,采用生物信息学分析方法对高粱GRF基因家族进行鉴定,并以高粱BTx623品种为材料,利用PCR技术扩增获得SbGRF4基因cDNA全长序列,构建pET-28a-SbGRF4重组质粒,采用原核表达技术分别对表达菌株、诱导温度以及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导浓度进行优化,最后用Western blot技术对原核表达的SbGRF4蛋白进行验证。结果表明,在高粱中共鉴定到10个GRF基因SbGRF1～SbGRF10;亚细胞定位预测结果显示均定位于细胞核中;分布于高粱的6条染色体上,所有家族成员均含有QLQ和WRC保守结构域;系统进化结果显示,高粱GRF蛋白分为Class 2、Class 3、Class 4a、Class 4b四个亚家族;相同亚家族各个成员间外显子和内含子的数量差异较小;同一亚家族的高粱GRF蛋白保守基序具有相似性;克隆到的SbGRF4基因c DNA序列全长为1 221 bp,并成功构建pET-28a-SbGRF4融合表达载体;SbGRF4蛋白的最佳表达菌株为大肠杆菌Escherichia coli JM109(DE3)菌株,最佳诱导温度为25℃,最佳IPTG诱导浓度为0.6mmol/L;Western blot验证结果显示原核表达的蛋白为SbGRF4。表明SbGRF4蛋白可在大肠杆菌原核表达系统中表达。