利用流式细胞术分析活化T淋巴细胞特性

用多克隆刺激剂PMA和离子霉素体外刺激小鼠脾脏细胞4 h后,检测T淋巴细胞膜表面CD 69分子的表达;用P I标记分析细胞内DNA含量的变化;阻断细胞因子分泌后,检测不同亚群T淋巴细胞内细胞因子的表达。利用CFSE标记细胞,刺激44 h后,检测T淋巴细胞的分裂情况。结果表明：刺激4 h后,绝大多数T淋巴细胞表面表达CD 69抗原。细胞周期分析结果也表明,S＋G2/M期细胞数量明显增多,G1期细胞数量减少。通过固定、破膜、标记等处理后,分别表达IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-12的T淋巴细胞均有不同程度的提高。另外,刺激44 h后,明显检测到T淋巴细胞的分裂。以上结果说明,利用流式细胞术可以从不同的角度检测活化T淋巴细胞的活性。     

猪外周血单核细胞来源的树突状细胞体外诱导培养

为建立猪外周血单核细胞来源的树突状细胞(Mo DC)体外培养模型,从猪外周新鲜血液中分离外周血单核细胞(PBMC),通过贴壁法获得树突状细胞前体细胞,采用重组猪的集落共刺激因子(rp GM-CSF)和白细胞介素4(rp IL-4)双因子诱导及脂多糖(LPS)刺激成熟法,收集不同时间段的细胞,利用扫描电子显微镜观察其形态,流式细胞分析仪检测表面分子表达率及其对FITC-dextran的吞噬能力,混合淋巴细胞反应检测细胞对同种异体T细胞的刺激能力。结果表明,经体外诱导的细胞具有典型的树突状形态;经脂多糖刺激的树突状细胞表型分子CD1a、CD80、CD86、SLAII、CD172a与未经刺激的树突状细胞有明显增高,其吞噬能力有所下降,刺激同种异体T淋巴细胞的能力增强。本研究成功建立了猪Mo DC的体外诱导培养方法,为进一步研究其在机体免疫调节和抗病毒感染中的作用奠定了基础。     

猪外周血单核细胞来源的树突状细胞体外诱导培养（英文）

[目的]建立猪外周血单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)体外培养模型。[方法]从猪外周新鲜血液中分离外周血单核细胞(PBMC),通过贴壁法获得树突状细胞前体细胞,采用重组猪的集落共刺激因子(rp GM-SCF)和重组猪的白细胞介素4(rp IL-4)双因子诱导及脂多糖(LPS)刺激成熟法,收集不同时间段的细胞,利用扫描电子显微镜观察其形态,流式细胞分析仪检测表面分子表达率及其对FITC-dextran的吞噬能力,混合淋巴细胞反应检测细胞对同种异体T细胞的刺激能力。[结果]经体外诱导的DC具有典型的树突状形态;LPS刺激的DC表型分子CD1a、CD80、CD86、SLAII、CD172a与LPS未刺激的DC有明显增高,其吞噬能力有所下降,刺激同种异体T淋巴细胞的能力有所增强。[结论]该试验成功建立了猪MoDC的体外诱导培养方法,为进一步研究猪MoDC在机体免疫调节和抗病毒感染中的作用奠定了基础。     

猪外周血单核细胞来源的树突状细胞体外诱导培养

[目的]建立猪外周血单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)体外培养模型.[方法]从猪外周新鲜血液中分离外周血单核细胞(PBMC),通过贴壁法获得树突状细胞前体细胞,采用重组猪的集落共刺激因子(rpGM-SCF)和重组猪的白细胞介素4(rpIL-4)双因子诱导及脂多糖(LPS)刺激成熟法,收集不同时间段的细胞,利用扫描电子显微镜观察其形态,流式细胞分析仪检测表面分子表达率及其对FITC-dextran的吞噬能力,混合淋巴细胞反应检测细胞对同种异体T细胞的刺激能力.[结果]经体外诱导的DC具有典型的树突状形态;LPS刺激的DC表型分子CDla、CD80、CD86、SLAⅡ、CD172a与LPS未刺激的DC有明显增高,其吞噬能力有所下降,刺激同种异体T淋巴细胞的能力有所增强.[结论]该试验成功建立了猪MoDC的体外诱导培养方法,为进一步研究猪MoDC在机体免疫调节和抗病毒感染中的作用奠定了基础.     

左旋咪唑刺激猪内皮细胞抑制单核源树突状细胞的抗原递呈功能

【目的】研究左旋咪唑(LMS)刺激的猪内皮细胞(VEC)对单核源树突状细胞(MoDC)的抗原递呈功能的影响。【方法】通过LMS刺激猪血管内皮细胞后,筛选出能够使内皮源IL-8表达量上调的低质量浓度LMS(10~(-6) mg/mL),将经LMS处理的内皮细胞与MoDC共培养,收集共培养的MoDC。流式细胞术检测MoDC的CD80/86和MHC-II的表达;丝裂霉素C处理后的MoDC与淋巴细胞混合,MTS法和流式细胞术分析MoDC抗原递呈和对淋巴细胞转化的影响。共培养分为诱导后共培养和诱导共培养。【结果】LMS处理VEC后,两种共培养方式所得MoDC的MHC-II与CD80/86阳性率、淋巴细胞刺激指数、Tc和Treg细胞阳性率均显著下调,而Th细胞阳性率和CD4~+/CD8~+比值显著上调。【结论】低浓度LMS处理的VEC可抑制MoDC的抗原递呈能力。     

CpG-ODN对猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞免疫刺激作用的初步研究

为了筛选出对猪体有免疫刺激活性的CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN),设计了9种未甲基化CpG-ODN不同序列,通过人工合成,分别作用于猪外周血淋巴细胞和脾细胞,进行健康猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞体外转化试验。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测外周血淋巴细胞转化效果和脾细胞的增殖能力和代谢能力,通过测得的OD490值,计算出淋巴细胞增殖指数(SI),筛选CpG-ODN的免疫刺激作用。结果显示:9种不同序列的CpG-ODN对猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞均具有不同程度的刺激效果,其中CpG-ODN6、CpG-ODN7刺激强度极显著。为研制DNA疫苗有效的CpG-ODN免疫佐剂奠定基础。     

体外筛选对鸡具有免疫刺激活性的CpG寡脱氧核苷酸

分别用有丝分裂原和CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)对SPF鸡全血，经低速离心分离的外周血单个核细胞(PBMC)和脾脏细胞，用淋巴细胞分离液分离的PBMC和脾脏细胞进行刺激，用^3H-TdR掺入法测定并比较上述鸡免疫细胞在不同培养温度和细胞浓度下的转化效果，从而建立了适用于大批量筛选对鸡具有免疫刺激活性CpG ODN的淋巴细胞转化方法。进一步用该方法筛选自行设计合成的38条ODN.结果表明，用低速离心法分离的鸡PBMC，在细胞含量为10^7mL^-1、37℃、5％CO2条件下，经CpG ODN刺激64～66h后，可以得到稳定的高效转化；不含CpG模体的ODN不具有免疫刺激活性；CpG ODN 10、11和14具有最佳的免疫刺激活性，刺激指数大于10。     

不同序列的CpG-ODN对猪体外免疫细胞免疫刺激作用的研究

为了筛选出对猪体有免疫刺激活性的CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG-ODN），人工设计合成了9种未甲基化CpCr-ODN不同序列，分别作用于健康猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞，进行体外转化试验。用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测外周血淋巴细胞转化效果和脾细胞的增殖能力和代谢能力，通过测得的OD490值，计算出淋巴细胞增殖指数（SI），筛选CpG-ODN的免疫刺激作用。结果显示：9种不同序列的CpG-ODN对猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞均具有不同程度的刺激作用，其中CpG-ODN7对淋巴细胞增殖能力的增强效果最为明显（sI=3．5），CpG-ODN6对猪脾脏免疫细胞的刺激指数最大（SI=2．7）。为研制猪DNA疫苗有效的CpG-ODN免疫佐剂奠定了基础。     

猪CD127流式单克隆抗体的研制

[目的]研制出猪CD127(调节因子IL-7受体α链)流式单克隆抗体,为研究分析猪淋巴细胞亚群,尤其是猪Treg细胞亚群提供流式细胞分析抗体,也为进一步探究猪抗病性状与免疫机制间的关系打下基础.[方法]克隆猪CD127基因片段,通过原核载体诱导表达出相应的融合蛋白,以纯化后的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,然后取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,综合ELISA和流式细胞仪检测筛选出亚克隆抗体,并采用Western blotting验证所得亚克隆抗体能否与猪淋巴细胞上的CD127特异性结合.[结果]猪CD127基因cDNA全长1999 bp,第49~1428 bp为开放阅读框(ORF),编码459个氨基酸,其中前21位氨基酸为信号肽,成熟肽N端第1~219位氨基酸为胞外蛋白,第220~242位氨基酸为跨膜蛋白,第243~459位氨基酸为胞内蛋白.以pET28a和pET32a原核载体诱导表达CD127胞外片段可获得大小介于34~43 kD的融合蛋白,经Ni亲和层析柱纯化后用于免疫Balb/c小鼠,6只免疫小鼠血清中的多克隆抗体均能对猪淋巴细胞中的CD3阳性细胞(CD3+)进行共标记,其中以M2和M4两只免疫小鼠抗血清对CD3+的共标记效果较优,分群清晰;但流式细胞仪检测发现,仅2.3%的CD3+能与M2混合池培养基上清液中的分泌抗体共标记,而67.0%的CD3+能与M4混合池培养基上清液中的分泌抗体共标记,且分群清晰.从M4混合池中筛选出6株效价稳定的亚克隆细胞株(1E2、1D8、2F3、2F8、3C6和4E1),且以1D8、2F3、2F8和3C6亚克隆抗体标记的CD3+较多,其培养基上清液中的分泌抗体在猪胸腺和肌肉样品中均能检测出大小约50 kD的单一目的条带.[结论]制备获得的猪CD127流式单克隆抗体可与T淋巴细胞表面的IL-7受体特异性结合,同时在流式细胞仪检测过程中可用于猪Treg细胞亚群检测.     

外泌体及其miR-155参与免疫细胞之间的通讯

外泌体是一种细胞分泌的囊泡，里面含有丰富的核酸和蛋白质等物质，对于信息的传递、免疫功能的调节具有重要作用.本研究通过培养巨噬细胞、树突状细胞，收集上清液，分别采用外泌体提取试剂盒法和超速离心法提取外泌体，使用透射电镜法和Western blot法进行外泌体鉴定. 将提取的外泌体转染荧光标记，与淋巴细胞共同孵育24 h.采用含荧光标记的miR-155，分别转染到巨噬细胞和树突细胞中，提取细胞上清的外泌体，与淋巴细胞共孵育24 h.结果显示：超速离心法提取的外泌体更纯，但是SBI试剂盒提取的外泌体更多，适用于下一步试验；巨噬细胞及树突状细胞分泌的外泌体加荧光标记与淋巴细胞共培养后，可使淋巴细胞荧光增加；荧光标记miR-155的外泌体与淋巴细胞共培养，可使淋巴细胞荧光增加. 本研究证实了树突细胞、巨噬细胞分泌的外泌体及其包含的miR-155可作用于淋巴细胞，参与免疫细胞间的通讯，为进一步阐明外泌体的作用机制奠定了理论基础.     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库构建及EST初步分析

【目的】构建猪淋巴细胞基因文库,初步绘制正常猪外周血淋巴细胞的基因表达谱,为进一步筛选免疫相关基因提供平台。【方法】以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与质粒载体连接后转化大肠杆菌,进一步扩增后,获得猪外周血淋巴细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合,并进行序列分析和注释。【结果】构建了正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库,获得库容量为1.2×106 PFU/mL、重组率为93.3%、85%插入片段处于750～2000 bp的高质量文库;随机测定1100条ESTs,经拼接和聚类,获得152条高表达的基因重叠群（Contigs）和619条低表达基因——单拷贝的EST（Singletons）;经序列比对分析,发现23.3% ESTs为与任何物种都没有匹配的新基因,75.9% ESTs为与猪没有匹配的新基因。用GO数据库对获得的EST进行基因功能分类和KEGG路径图分析,发现丝裂原活化蛋白激酶途径（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）、钙信号通路、胰岛素信号通路、脂肪细胞因子信号通路、Toll-like受体信号通路、B细胞受体信号通路和T细胞受体信号通路的基因均有较高表达。【结论】大部分的猪外周血淋巴细胞基因尚未被分离和鉴定出来,但这些基因mRNA转录和表达丰度均较高,且在猪外周血淋巴细胞中起着非常重要的作用。     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库构建及EST初步分析

【目的】构建猪淋巴细胞基因文库,初步绘制正常猪外周血淋巴细胞的基因表达谱,为进一步筛选免疫相关基因提供平台。【方法】以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与质粒载体连接后转化大肠杆菌,进一步扩增后,获得猪外周血淋巴细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合,并进行序列分析和注释。【结果】构建了正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库,获得库容量为1．2×10^6PFU／mL、重组率为93．3％、85％插入片段处于750～2000bp的高质量文库;随机测定1100条ESTs,经拼接和聚类,获得152条高表达的基因重叠群（Contigs）和619条低表达基因——单拷贝的EST（Singletons）;经序列比对分析,发现23．3％ESTs为与任何物种都没有匹配的新基因,75．9％ESTs为与猪没有匹配的新基因。用GO数据库对获得的EST进行基因功能分类和KEGG路径图分析,发现丝裂原活化蛋白激酶途径（Mitogenn—activated protein kinase,MAPK）、钙信号通路、胰岛素信号通路、脂肪细胞因子信号通路、Toll—like受体信号通路、B细胞受体信号通路和T细胞受体信号通路的基因均有较高表达。【结论】大部分的猪外周血淋巴细胞基因尚未被分离和鉴定出来,但这些基因mRNA转录和表达丰度均较高,且在猪外周血淋巴细胞中起着非常重要的作用。     

血小板对体外培养的猪PBMC增殖反应和IL—2分泌的影响

本实验通过采取１０头猪的血液，经３０次实验探讨了自体和异体血小板（ＰＬ）对体外培养的猪外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）增殖反应和ＩＬ－２分泌的影响。证明了ＰＬ对猪ＰＢＭＣ的增殖的反应和ＩＬ－２分泌均有增强作用。同时也比较了ＰＬ和红细胞（ＲＢＣ）对淋巴细胞的活化作用。并初步探讨了ＰＬ对淋巴细胞激活作用的机制。     

血小板对体外培养的猪PBMC增殖反应和IL－2分泌的影响

本实验通过采取１０头猪的血液，经３０次实验探讨了自体和异体血小板（ＰＬ）对体外培养的猪外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）增殖反应和ＩＬ一２分泌的影响。证明了ＰＬ对猪ＰＢＭＣ的增殖反应和ＩＬ一２分泌均有增强作用。同时也比较了ＰＬ和红细胞（ＲＢＣ）对淋巴细胞的活化作用。并初步探讨了ＰＬ对淋巴细胞激活作用的机制。     

高效佐剂对猪细小病毒和圆环病毒二联灭活疫苗的免疫增强效果

为评价高效佐剂VA5对猪细小病毒和猪圆环病毒二联灭活疫苗的免疫增强效果,将VA5与猪细小病毒、猪圆环病毒疫苗混合免疫BALB/c小鼠和豚鼠。结果显示,VA5佐剂能明显提高猪细小病毒血凝抑制抗体效价和血清病毒中和抗体效价,亦能提高猪圆环病毒ELISA抗体和中和抗体效价,并可降低二种抗原的使用量。VA5佐剂显著提高小鼠和豚鼠免疫后的淋巴细胞刺激指数。攻毒后,VA5佐剂处理组动物脾脏PCV2/PPV病毒载量明显低于不含高效佐剂的免疫组。VA5佐剂能提高猪细小病毒、猪圆环病毒疫苗在小鼠/豚鼠中的抗体效价,提高细胞免疫力,降低攻毒后的排毒。     

转基因猪外源hDAF基因表达产物的功能研究

应用微量淋巴细胞毒方法对转ｈＤＡＦ基因猪外源基因表达产物的功能进行了初步研究。结果表明：外源ＨＤＡＦ基因在猪淋巴细胞上的表达产物具有生物学功能，活细胞数与总细胞数之比最高者达４４．４４％，从而为转ｈＤＡＦ基因猪的检测提供了一个新方法。     

免疫应激对不同品种仔猪免疫功能的影响

[目的]探讨免疫应激对莱芜猪、鲁莱猪及大约克夏断奶仔猪免疫功能的影响。[方法]分别选用12头体重为（13．6±0．5）kg的莱芜猪、鲁莱猪和大约克夏猪,采用2x3因子设计：免疫应激（注射LPS或生理盐水）,品种类型（莱芜猪、鲁莱猪和大约克夏猪）。试验第1天,分别给每品种中的6头猪注射200μg／kg·BW的LPS,其余6头注射生理盐水作为对照,并进行猪瘟疫苗接种。注射LPS后的第2、7和14天,采血测定其淋巴细胞转化率;注射LPS前1天、注射LPS后第7天和第14天,测定其猪瘟抗体水平。【结果]猪在LPS刺激后的第2天．其淋巴细胞转化率显著高于生理盐水组（P〈0．01）,莱芜猪的淋巴细胞转化率显著高于大约克夏猪（P〈0．05）;免疫应激对不同品种仔猪的猪瘟抗体水平无差异性影响。[结论】LPS能够有效刺激不同品种猪的细胞免疫机能,并且不同品种仔猪免疫应签能力有差异,     

白僵菌多糖对肿瘤细胞及免疫细胞作用的研究

本文通过使用酶标仪检测白僵菌多糖刺激B淋巴细胞和小鼠结肠癌细胞CT26.WT后分别得到的OD值,对白僵菌多糖在机体免疫活性和抗肿瘤方面的作用进行研究。结果表明,用不同浓度的白僵局多糖刺激B淋巴细胞时,细胞数量增加,成团量变大;用不同浓度的白僵菌多糖刺激CT26.WT细胞时,细胞数量减少或有被抑制的趋势。由此说明,白僵菌多糖能够促进B细胞的增殖,抑制CT26.WT细胞的生长。     

淋巴细胞寿命的研究进展

免疫系统的一个重要特点是对初次接触抗原产生初次应答而对再次接触同一抗原则形成回忆反应。搞清这个特点的关键在于了解淋巴细胞的寿命．评估淋巴细胞寿命及其生物学意义的难点在于T和B细胞是由不同分化阶段的异质性细胞群组成。近年来．利用特异性细胞表面标记和转基因鼠，结合直接检测淋巴细胞亚群寿命的方法，大大提高了分析淋巴细胞异质性的能力。本文就淋巴细胞寿命的研究作一综述，并着重阐述不同分化阶段的T细胞和B细胞。IT细胞在门腺中的选择在胸腺，T细胞的成熟受到两个不同的选择作用的影响，即阴性选择和阳性选择”‘。主要…     

猪淋巴结组织学研究

采用组织学和酶组织化学方法对１６头猪的空肠淋巴结，腹股沟浅淋巴结和颈浅背侧淋巴结和组织结构进行了综合研究。结果表明，猪淋巴结组织结构并不完全属于皮质和髓质倒置，而是皮质可以位于外周，髓质可以位于中央，通常是皮质沿小梁分布。皮质由淋巴小结和弥散性淋巴组织构成；髓质无明显的髓索和髓窦，淋巴细胞数量少，Ｔ，Ｂ淋巴细胞的分布类似于其他哺乳动物；树突状细胞，并错镶嵌型细胞，巨噬细胞和网状细胞的形态，分布以及