CpG-ODN对猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞免疫刺激作用的初步研究

为了筛选出对猪体有免疫刺激活性的CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN),设计了9种未甲基化CpG-ODN不同序列,通过人工合成,分别作用于猪外周血淋巴细胞和脾细胞,进行健康猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞体外转化试验。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测外周血淋巴细胞转化效果和脾细胞的增殖能力和代谢能力,通过测得的OD490值,计算出淋巴细胞增殖指数(SI),筛选CpG-ODN的免疫刺激作用。结果显示:9种不同序列的CpG-ODN对猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞均具有不同程度的刺激效果,其中CpG-ODN6、CpG-ODN7刺激强度极显著。为研制DNA疫苗有效的CpG-ODN免疫佐剂奠定基础。     

不同序列的CpG-ODN对猪体外免疫细胞免疫刺激作用的研究

为了筛选出对猪体有免疫刺激活性的CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG-ODN），人工设计合成了9种未甲基化CpCr-ODN不同序列，分别作用于健康猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞，进行体外转化试验。用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测外周血淋巴细胞转化效果和脾细胞的增殖能力和代谢能力，通过测得的OD490值，计算出淋巴细胞增殖指数（SI），筛选CpG-ODN的免疫刺激作用。结果显示：9种不同序列的CpG-ODN对猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞均具有不同程度的刺激作用，其中CpG-ODN7对淋巴细胞增殖能力的增强效果最为明显（sI=3．5），CpG-ODN6对猪脾脏免疫细胞的刺激指数最大（SI=2．7）。为研制猪DNA疫苗有效的CpG-ODN免疫佐剂奠定了基础。     

雏鸡免疫柔嫩艾美耳球虫早熟株和毒株的细胞免疫反应

AA肉鸡雏鸡分别经口免疫柔嫩艾美耳球虫毒株早熟株，用免疫组化ABC法染色检测小肠、盲肠扁桃体、脾脏中CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞动态变化；用淋巴细胞转化实验MTT法检测T淋巴细胞活性。结果表明：球虫免疫鸡后，CD4^ T淋巴细胞在一次免疫后迅速增殖，第6天达到第一峰，免疫柔嫩艾美耳球虫毒株的鸡盲肠与脾脏中CD4^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到38％和44％，免疫早熟株的鸡盲肠与脾脏中CD4^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到36％和43％，而二次免疫后和对照相比很少有显著差异。CD8^ T淋巴细胞在一次免疫后比CD4^ T增殖速度慢，第9天达到第一峰。免疫柔嫩艾美耳球虫毒株的鸡在此日盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到37％和47％，免疫早熟株的鸡在此日盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到36％和48％，二次免疫后迅速大量增殖，免疫柔嫩艾美耳球虫毒株的鸡在二免后第2天盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到39％和50％．免疫柔嫩艾美耳球虫早熟株的鸡在二免后第2天盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到37％和50％。且CD8^ T淋巴细胞总体水平比CD4^ T淋巴细胞多。盲肠扁桃体中T细胞的增殖速度比其他组织更快。免疫早熟株的鸡与免疫毒株的鸡肠道黏膜中的CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞变化基本一致。一次免疫鸡比未免疫对照T淋巴细胞活性显著升高；进行二免的鸡免疫后第一、二、三周T淋巴细胞活性均比未进行二免的鸡显著升高；毒株免疫鸡T淋巴细胞活性大多与早熟株免疫鸡无8显著差异。     

TLR9激动剂CpG ODN对B细胞分泌细胞因子的影响

利用免疫磁珠法分选小鼠脾脏CD19+B细胞,体外用CpG寡脱氧核苷酸(ODN)刺激24h后,流式细胞术(FCM)检测B细胞表面共刺激分子的表达;CBA法检测培养上清中IL-6、IL-10、IL-12p70、IFN-γ和TNF浓度;利用相关的信号转导抑制剂检测参与B细胞内细胞因子分泌的信号转导通路,探讨TLR9激动剂CpG ODN刺激小鼠B细胞后,对B细胞表面共刺激分子表达和细胞因子分泌的影响。结果表明:CpG ODN可以上调B细胞表面CD40、CD80、CD86和MHC II类分子的表达,促进IL-6、IL-10和TNF的高分泌。JNK、p38和NF-κB信号转导通路调控B细胞IL-6、IL-10和TNF的分泌。说明CpG ODN可以通过上调B细胞共刺激分子表达和促进细胞因子分泌等多方面调节B细胞功能。     

CpG—DNA特征结构与其免疫刺激特性的关系

CpG-DNA是一些具有免疫激活功能的以未甲基化的CpG基序为核心的DNA序列,它包括含CpG基序的人工合成的寡聚脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)和自然界中细菌、病毒、无脊椎动物等低等生物的基因组DNA。CpG基序(CpG motifs)是指一类以非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸为核心的寡聚脱氧核糖核苷酸,其碱基排列大多遵循以下规律:5’端为2个嘌呤,3’端为2个嘧啶。研究表明,这种序列可激活多种免疫效应细胞,其特征结构如CpG核心、侧翼序列、骨架长度等都对其免疫刺激特性有重要影响。本文就其特征结构与免疫刺激特性的关系作一介绍。     

小鼠子宫内膜细胞对小鼠脾脏淋巴细胞和山羊PBMC转化与分泌活性的影响

【目的】探索小鼠子宫内膜细胞培养上清液对小鼠脾脏淋巴细胞和山羊外周血单个核细胞(Peripheral Blood Monouclear Cells,PBMC)的转化及分泌活性的影响。【方法】采用噻唑蓝(MTT)比色法和酶联免疫吸附测定法(ELISA),分别研究小鼠子宫内膜上皮细胞(Endometrial Epithelial Cells,EECs)和基质细胞(Endometrial Stro-mal Cells,ESCs)培养上清液,对离体培养的小鼠脾脏淋巴细胞、山羊外周血单个核细胞(Peripheral Blood MonouclearCells,PBMC)的增殖转化及白细胞介素2(Interleukin-2,IL-2)和白细胞介素4(Interleukin-4,IL-4)分泌活性的影响。【结果】小鼠子宫内膜基质细胞和上皮细胞培养上清液,均可无种属差异地刺激小鼠脾脏淋巴细胞和山羊PBMC的增殖转化,同时抑制植物血球凝素(Plant hemaggluti min PHA-P)诱导的小鼠淋巴细胞和山羊PBMC分泌IL-2的活性,但对PHA-P诱导的IL-4分泌有促进或协同作用。【结论】EECs和ESCs通过影响小鼠脾脏淋巴细胞和山羊PB-MC的增殖转化与分泌活性,优势活化Th2型淋巴细胞,在子宫局部免疫调节中发挥重要作用。     

CpG ODN纳米佐剂的免疫效应及应用进展

CpG ODN是人工合成的具有非特异性免疫刺激的DNA序列,模拟细菌DNA在体内的应答过程,诱发细胞和体液免疫。CpG ODN作为新型免疫增强剂在兽医临床上的应用展现出了巨大的潜力,并在免疫学、药物学和药效学等领域备受关注。然而CpG ODN并不稳定且易被核酸酶酶解,其自身带负电荷,不易结合到细胞表面。因此,CpG ODN如何高效传递并能有效摄取成了新的挑战。纳米传递系统的研究使CpG ODN单独或协同疫苗免疫取得显著疗效,为改善CpG ODN在疫苗研究中的应用拓宽了思路。从CpG ODN纳米佐剂的作用机制、免疫活性、安全性及临床应用等方面进行综述,并对该领域未来的研究方向进行展望,为后续工作提供有益参考。     

山羊ESC培养上清液对PBMC和PBL转化及分泌活性的影响

【目的】探索山羊子宫内膜基质细胞(ESC)培养上清,对山羊外周血单核细胞(PBMC)和外周血淋巴细胞(PBL)的转化与分泌活性的影响。【方法】分离山羊PBMC和PBL,制备原代ESC(ESC0)及永生化传至30代的ESC(ESC30)培养上清,将不同培养上清与PHA组合刺激PBMC与PBL转化,应用MTT法检测ESC0及ESC30培养上清对PBMC和PBL转化的作用,ELISA检测PBMC和PBL分泌IL-2I、L-4的相对含量。【结果】ESC0及ESC30上清可刺激PBMC/PBL转化并分泌IL-2和IL-4,抑制PHA-P诱导的PBMC/PBL增殖及IL-2的分泌,但对PHA-P引起的PBMC/PBL分泌IL-4有促进或协同作用。【结论】ESC能通过旁分泌作用影响PBMC和PBL的转化与分泌活性,优势活化Th2型淋巴细胞,在子宫局部免疫调节中发挥重要作用。     

硫代CpG ODN对CEF增殖能力的影响

为了明确硫代CpG ODN对CEF增殖能力的影响,将CpG ODN2006进行硫代修饰,与CEF共孵育,测定了不同浓度和时间条件下细胞的增殖率。结果表明:CEF对硫代CpG ODN的耐受值为80μg/m L;20μg/m L硫代CpG ODN作用24~120 h,CEF均能够增殖,且48~72 h增殖效果最为显著。该结果为进一步研究CpG ODN激发CEF免疫应答效果和体外筛选体系的建立奠定了基础。     

鸡白介素-6(ChIL-6)基因的克隆与序列分析

分别用鸡传染性法氏囊病病毒感染和用ConA免疫刺激健康鸡，无菌取处理鸡的脾脏，匀浆后用Tr-izol抽提细胞总RAN，应用随机引物反转录获得cDNA，设计引物，经PCR扩增获得鸡白介素-6（ChIL-6)基因，应用pGEM-T载体克隆该基因，经测序，表明其与Gene Bank中公布的唯一的一个ChIL-6基因为同源基因。     

CpG基序对坏死梭杆菌免疫原的免疫佐剂效应实验研究

分别用坏死梭杆菌来源CpG、弗氏完全佐剂、氢氧化铝佐剂与坏死梭杆菌免疫原配制的抗原免疫小白鼠,通过检测坏死梭杆菌免疫原抗体变化,来探讨CpG对坏死梭杆菌免疫原的佐剂效应。试验结果表明,坏死梭杆菌来源CpG有较好的免疫佐剂效应,可望进一步研制成为坏死梭杆菌疫苗佐剂成分。     

CqG基序对坏死梭杆菌免疫原的免疫佐剂效应实验研究

分别用坏死梭杆菌来源CpG、弗氏完全佐剂、氢氧化铝佐剂与坏死梭杆菌免疫原配制的抗原免疫小白鼠，通过检测坏死梭杆菌免疫原抗体变化，来探讨CpG对坏死梭杆菌免疫原的佐剂效应。试验结果表明，坏死梭杆菌来源CpG有较好的免疫佐剂效应。可望进一步研制成为坏死梭杆菌疫苗佐剂成分。     

绵羊HOXC8基因的DNA甲基化研究

本研究测定了蒙古羊和德国美利奴肉羊,道塞特肉羊,澳洲美利奴细毛羊Hoxc8全基因序列。蒙古羊与这3个外国品种的Hoxc8基因,只有内含子存在8个碱基差异。但是exon-1的甲基化模式存在极大差异。蒙古羊14枚胸椎个体的甲基化程度高于13枚胸椎个体。蒙古羊甲基化程度普遍高于外国品种。蒙古羊特有的可遗传甲基化位点共有6个(5,69,1,62,6,27),国外品种在这些位置不发生甲基化。并且,这6个位点的甲基化程度高低可能决定了第14枚胸椎的长短和骨化程度。     

A、C型CpG寡核苷酸对变应性鼻炎小鼠鼻腔炎症反应的作用

目的探讨A、C型CpG寡核苷酸(ODN)对卵清蛋白诱导小鼠鼻腔炎症反应的作用。方法 40只BALB/c小鼠随机分为正常对照组、变应性鼻炎组、A组和C组。变应性鼻炎组、A组和C组用卵清蛋白致敏及激发,A、C组在激发同时分别应用A、C型CpGODN干预,正常对照组用生理盐水做对照。观察各组小鼠鼻部症状评分、鼻黏膜病理改变及测量血清IL-4、IL-5和IFN?水平。结果 A、C组鼻部症状评分均高于正常对照组(P<0.05或0.01),但明显低于变应性鼻炎组(P<0.05或0.01)。变应性鼻炎组血清IL-4、IFN?水平最高,IL-5水平最低(P<0.01)。C组血清IL-4、IFN?水平最低,IL-5水平最高(P<0.05或0.01)。结论 A、C型CpGODN可抑制卵清蛋白诱导的小鼠鼻腔炎症,且C型CpGODN抑制作用更强。     

不同剂量CpG序列对仔猪的免疫增强效果

以伪狂犬病毒为模式病毒，按照仔猪体质量分别将100、10、1μg/kg CpG序列同猪伪狂犬疫苗联合免疫接种仔猪，检测仔猪的体液及细胞免疫反应．试验结果表明：不同浓度的CpG序列均能显著提高仔猪的特异性抗体滴度、白细胞介素(IL)-2诱生活性以及淋巴细胞增殖反应，证明CpG序列能显著增强仔猪对常规疫苗的免疫应答能力。     

CpG DNA对鸡传染性喉气管炎病毒DNA疫苗免疫效果的影响

 将分别构建的含有鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）王岗株ｇＢｇＣ和ｇＤ基因的重组真核表达质粒及ＣＰＧＤＮＡ佐剂分组肌肉注射 ＳＰＦ鸡，检测了免疫后的抗体水平，并观测了攻毒后的免疫保护效果。实验结果显示，ＣｐＧＤＮＡ佐剂和ＤＮＡ疫苗联合免疫后的抗体水平比单一使用ＤＮＡ疫苗的要高，而佐剂组的发病率、死亡率均低于非佐剂组，保护率则高于非佐剂组。这表明 ＣｐＧ ＤＮＡ佐剂增强了 ＩＬＴＶ ＤＮＡ疫苗的免疫效果。     

小鼠胞内氯离子通道5基因启动子核心功能区域鉴定及转录调控分析

为研究胞内氯离子通道5基因(Chloride intracellular channel 5,CLIC5)广泛参与调节细胞内的各项生理活动与生化反应,并探讨该基因自身的表达调控机制,以小鼠基因组序列为模板,利用PCR技术扩增小鼠CLIC5基因5′上游调控序列,将其插入荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-Basic)中,同时采用5′侧翼区缺失的方法构建了7个缺失不同DNA片段的荧光素酶表达载体。重组质粒与海肾荧光素酶载体(phRL-TK)共同瞬时转染HEK-293细胞,经双荧光素酶报告基因活性分析后,确定CLIC5基因的核心启动子区。利用生物信息学方法预测其中转录因子结合位点及启动子区甲基化状况。结果表明,CLIC5基因启动子缺乏TATA盒,但含有典型的GC盒及其他潜在转录因子结合位点;双荧光素酶报告基因活性分析表明,CLIC5基因-329～+1、-624～+1、-917～+1和-2 230～+1区域的启动子活性较高,其中-624～+1区域的启动子活性最强。进一步分析表明,启动子区-624～-329存在负性调控元件,预测存在转录因子结合位点RXR heterodimer binding sites与GC-Box factorsSp1/GC,-420～-283范围内存在CpG岛位点。     

猪 MKRN3 基因启动子区CpG岛在胚胎心脏组织甲基化模式分析

以梅山猪-大白猪正反交为模型,以65日龄和100日龄的胚胎心脏组织为研究材料,对MKRN3基因启动子区CpG岛进行预测,根据预测的CpG岛设计引物,采用重亚硫酸盐测序法(BSP法),分析MKRN3基因启动子区CpG岛在胚胎心脏组织的甲基化程度。结果显示:对于65日龄胚胎,猪MKRN3基因启动子区CpG岛在大白×梅山和梅山×大白杂交后代的胚胎心脏组织中均表现高度甲基化(75.6%、76.4%);对于100日龄的胚胎,大白×梅山杂交后代的胚胎心脏组织表现高度甲基化(80%),而梅山×大白杂交后代的胚胎心脏组织呈现低甲基化(35.6%)。由此可见,猪MKRN3基因启动子区CpG岛的甲基化模式随着正反交、胚胎发育时期不同而呈现出一定变化,即在胚胎发育65日龄时,正反交子代均具有高度甲基化;而在胚胎发育至100日龄,正交子代呈现高度甲基化,反交子代呈现低甲基化,说明在胚胎发育晚期父本或母本等位基因可能会发生明显的去甲基化。     

DNA甲基化及其生物学功能

DNA甲基化是真核细胞基因组重要修饰方式之一。机体有建立和维持DNA甲基化的机制。DNA甲基化通过与反式因子相互作用或通过改变染色体结构而影响基因的表达,在胚胎发育、X染色体失活、基因组印记等方面起着重要作用。DNA甲基化为哺乳动物的发育、遗传性疾病和肿瘤的发生、生物进化、性状的遗传控制等的研究提供了新的途径。