抗TMV、CMV转基因烟草的初步选育

将烟草花叶病毒复制酶54 KD蛋白基因构建到质粒pSSZ32.54K,导入根癌农杆菌EHA105株系,用农杆菌介导的叶盘法转化含CMV CP基因的纯合系烟草,获得了含CMV CP基因和TMV RepE基因的转基因烟草,以及只含TMV RepE基因的转基因烟草.以繁殖于新鲜普通烟叶片上的TMV为毒源,机械摩擦接种含双基因的烟草和只含CMV CP基因的烟草.接种15 d后,观察植株发病情况,发现转双基因的烟草无花叶症状出现,而对照植株(只含CMV CP基因)出现花叶症状.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测病毒含量,发现转基因植株体内无病毒积累,而对照植株体内有病毒积累.因此,含RepE基因的烟草对TMV有一定抗性.     

烟草种质资源TI203对烟草花叶病的抗性特点

[目的]系统了解烟草种质资源TI203抗烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的特点,为烟草抗病育种的亲本选择提供更丰富信息.[方法]以烟草种质资源TI203为材料,采用TMV病毒接种、病情调查、病毒外壳蛋白累计量检测、TMV复制水平测定及日灼现象观察等方法,研究TI203对TMV的抗性特异性、TI203接种TMV普通株系(TMV-U1株系)后的症状、病毒复制水平等.[结果]TI203只对TMV表现无症状的抗病特点,接种马铃薯Y病毒(PVY)和黄瓜花叶病毒(CMV)则表现出典型症状.接种TMV-U1株系后14 d,Western blotting检测结果显示,TI203叶片病毒复制水平明显低于对照品种;用表达GFP的TMV侵染性克隆浸润接种发现,TI203对TMV的抗性发生在病毒复制水平.在高温和强日照条件下,TI203生长迅速的中上部叶片会发生日灼现象,且难以恢复.[结论]TI203只对TMV表现无症状,其对TMV的抗性发生在病毒复制水平.     

苋色藜NDR1基因抗病毒特性初步研究

以抗病毒植物苋色藜为材料,克隆拟南芥NDR1的同源基因,确定其亚细胞定位及该基因表达和抗病毒特性分析,为转基因抗病育种奠定技术基础。根据苋色藜转录组测序分析结果,采用RT\|PCR克隆获得两个与拟南芥同源的NDR1基因,分别命名为CaNDR1a和CaNDR1b,并通过实时定量PCR分析病毒侵染后基因的表达情况;构建植物瞬时表达载体,发现CaNDR1a和CaNDR1b定位于细胞膜;构建CaNDR1a和CaNDR1b植物表达载体,遗传转化获得转基因烟草,经酶联免疫吸附测定（ELISA）分析T1代植株对烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）的抗性。生物信息学分析揭示CaNDR1a和CaNDR1b是NDR1的同源基因。CaNDR1a和CaNDR1b在苋色藜接种TMV和CMV后显著上调表达。CaNDR1a和CaNDR1b定位于细胞膜上,并且病毒对CaNDR1a和CaNDR1b的胞内定位没有影响。ELISA结果显示部分转基因株系对TMV和CMV的抗性增加。初步表明CaNDR1a和CaNDR1b是拟南芥NDR1的功能性同源基因,参与植物对病毒的内源免疫反应。     

毛白杨TIR-NBS-LRR基因转化烟草的研究

该文采用农杆菌介导法将从毛白杨中克隆得到的TIR-NBS-LRR抗病基因（PtDRG01）导入烟草中,经抗生素筛选和PCR分子检测,获得了一批阳性转化植株。进而对这些阳性转化植株进行烟草花叶病毒接种实验,从表型观察结果发现,在接种病毒1周和6周后,转基因烟草株系TG-11的发病程度明显低于非转基因烟草。荧光定量分析结果显示,转基因烟草株系TG-11叶片中的烟草花叶病毒(TMV)数量显著低于非转基因植株,且该转基因株系中的PtDRG01基因转录水平显著高于非转基因植株。这些结果表明,毛白杨PtDRG01基因具有明显的抗病功能,其高效表达能够显著提高烟草的抗TMV能力。该文通过对烟草的遗传转化与病毒接种实验,鉴定了PtDRG01基因的功能,可为其他TIR-NBS-LRR基因的功能鉴定提供参考。      

转烟草花叶病毒复制酶基因烟草的病毒抗性研究

对用根瘤农杆菌双质粒法导入烟草花叶病毒复制酶基因的转基因烟草后代的研究表明：转基因烟草抗烟草花叶病毒和马铃薯Ｘ病毒,但感染马铃薯Ｙ病毒,抗病毒的转基因烟草存在某种机制限制着病毒在植株内的转移,转烟草花叶病毒复制酶基因烟草植株内不产生该复制酶,其抗病毒的确切机制有等进一步研究。     

毕节市烟草3种主要病毒检测及株系分析

利用RT-PCR检测体系对贵州毕节烟区的烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus, CMV)和马铃薯Y病毒(potato virus Y, PVY) 3种病毒进行病害检测和株系鉴定,样品检测结果显示, TMV发生最严重,检出率为64.13%,其次是PVY,检出率为40.22%, CMV发生较轻,检出率为31.52%.通过同源性比较和构建系统进化树,结果表明,毕节烟区CMV均属于ⅠB亚组, TMV均属于种群Ⅰ, PVY均属于PVY~(N∶O)株系,各株系间没有明显的地域差异,烟田周边马铃薯上分离物MQG1和MQG2,与烤烟上CMV,TMV和PVY 3种病毒的分离物亲缘关系较近,由此可以推测,烟田周边的马铃薯可能是烟田这3种病毒的主要毒源.     

多抗PVY、TMV和CMV转基因烟草的培育

 【目的】利用RNA介导抗性培育抗多种植物病毒的转基因烟草。【方法】分别以马铃薯Y病毒（PVY）、烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）全长衣壳蛋白（CP）基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得PVY CP 3′端长度100 bp、TMV CP 3′端长度100 bp和CMV CP 3′端长度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因,并以此为模板构建反向重复结构嵌合基因的植物表达载体pRHPTC。将pRHPTC通过冻融法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89,然后测定转基因烟草对3种病毒的抗性。【结果】经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得276株转基因烟草。Southern和Northern blot分析表明,外源基因以不同拷贝数整合于烟草基因组中;不同转基因植株中病毒RNA的积累量存在显著差异。抗病性检测显示：23%左右的转基因植株表现出对3种病毒侵染的抗性。对转基因植株扩繁后代和T1代的抗性分析表明：多病毒抗性表现稳定。【结论】利用RNA介导的抗病毒基因工程可获得同时抗多种病毒的转基因烟草,其抗病性在T0代扩繁植株和T1代植株中得到稳定遗传。     

转CP基因线辣椒对CMV的抗病性组分研究

以转化 CMV外壳蛋白基因 ( CP基因 )的线辣椒 ( Capsicum annuum var. longunt)为试材 ,系统研究了 CP基因介导抗病性的组分和表达特点。摩擦接种黄瓜花叶病毒 ( CMV,浓度 2 0μg/ ml)后 ,转基因线辣椒显症延迟 4～ 1 0 d,显症率和严重度大幅减低 ,仅部分植株表现轻度花叶。接种叶片上 CMV侵入位点数目比未转化对照品种减少 6 7.0 %～ 86 .4 %。接种后第 9天 ,转基因株系接种叶中 CMV含量仅为未转化对照的32 .4 %～ 37.3%。病毒由接种叶向邻叶转出始期 ,比未转化对照晚 9～ 1 5h。接种后 3d,转基因株系 1 6— 1 3的未接种叶中未能检出 CMV,而同期未转化对照已有 4片邻叶检出了 CMV。接种后 6 d,1 6— 1 3仅上下位相邻叶检出了 CMV,此时对照已全株带毒。转基因株系接种后 6 d,整株 CMV含量为未转化对照的 4 2 .5%。这表明线辣椒 CP基因介导的抗病性是多组分的 ,包括对病毒的抗侵入、抗扩展和抗增殖     

陕西省咸阳市、商州市烟草病毒病毒原鉴定初报

2001年在咸阳市，商州市采集了101个毒株，经过生物学测定，血清学反应（琼脂双扩散法和酶联免疫吸附法），电镜观察鉴定出5种为害烟草的病毒，它们是烟草普通花叶病毒（TMV），黄瓜花叶病毒（CMV），烟草蚀纹病毒（TEV），马铃薯Y病毒（PVY），烟草环斑病毒（TRSV），其中烟草普通花叶病毒病，黄瓜花叶病毒病和烟草蚀纹病毒病是当前生产上发病率较高，造成损失较大的3种病毒；同时，烟草普通花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV），烟草普通花叶病毒（TMV）和马铃薯Y病毒（PVY）的复合侵染也是当前生产上亟待解决的主要问题。     

PtWRKY14 基因转化烟草及对 TMV 的抗性影响研究

PtWRKY14 是从毛白杨中获得的WRKY 基因,为研究PtWRKY14 基因对植物抗病性的影响,构建了毛 白杨PtWRKY14 基因的植物表达载体pBI121-W14,通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草,PCR 与Southern 杂交 进行转基因烟草鉴定。对获得的转基因烟草植株进行烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV）的接种试验,结果表 明PtWRKY14 基因的转化使烟草对TMV 的抗性增强。荧光定量PCR 检测结果表明,TMV 接种后,转基因烟草中 PtWRKY14 的表达量显著上调,同时转基因烟草中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD）、过氧化物酶(Peroxidase,POD）、过氧化氢酶(Catalase,CAT）的表达量均高于对照组。因此,PtWRKY14 可能通过上调SOD、POD、 CAT 的表达从而增强植物抗病性。     

Risk Assessment of Synergism and Recombination on the Transgenic Plants Containing Viral Movement Protein and Replicase Genes

The transgenic tobacco plants transformed with movement protein gene of Tomato mosaic virus (ToMV) or Tobacco mosaic virus (TMV) and partial replicase gene of Cucumber mosaic virus (CMV) P1 isolate (CMV-P1), were inoculated with Potato virus X, Potato virus Y, TMV and CMV isolate RB (CMVRB), respectively. Symptom observation showed there were no symptom differences in transgenic tobacco plants as compared with those in non-transgenic tobacco plants. ELISA also illustrated that the virus concentrations in the transgenic plants were similar to those in non-transgenic plants, indicating that no synergism is found in these plants. The transgenic tobacco plants expressing movement protein gene of ToMV or partial replicase gene of CMV-P1 were inoculated with TMV and CMV-RB, respectively. The local or systemic infected leaves were then used for elucidation of the possible virus recombination in transgenic plants with biological infectivity test, ELISA and immuno-capture RT-PCR. Within 16 months, no recombination was found between transformed genes and inoculated virus genomes. The research provides fundamental data for understanding of the possible risk of the transgenic plants expressing viral sequences.     

云南省烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析

以从云南省主要烟区烟草上分离到的烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）的RNA为模板,采用RT-PCR技术,对TMV云南分离物（TMV-YN）的外壳蛋白（Coat protein,CP）基因及3’端非编码区和CMV云南分离物（CMV-YNa）的CP基因进行了cDNA克隆和序列测定。结果表明,TMV-YN的cDNA全长684个碱基（EMBL登录号为AJ239099）,通过GenBank进行同源性比较发现：其5'端的480个碱基为CP基因,编码159个氨基酸;3'端的204个氨基酸为非编码区;此CP基因与TMV-U1株系和TMV韩国普通株系核苷酸同源性均为100%。CMV-YNa的CP基因全长657个碱基（EMBL登录号为AJ239098）,编码218个氨基酸;此CP基因与CMV亚组 I 的CMV-RB株系、CMV-117F株系和CMV-Y株系的核苷酸同源性分别为96%、93%和92%。     

Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene

A chimeric gene containing a cloned cDNA of the coat protein (CP) gene of tobacco mosaic virus (TMV) was introduced into tobacco cells on a Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens from which tumor inducing genes had been removed. Plants regenerated from transformed cells expressed TMV mRNA and CP as a nuclear trait. Seedlings from self-fertilized transgenic plants were inoculated with TMV and observed for development of disease symptoms. The seedlings that expressed the CP gene were delayed in symptom development and 10 to 60 percent of the transgenic plants failed to develop symptoms for the duration of the experiments. Increasing the concentration of TMV in the inoculum shortened the delay in appearance of symptoms. The results of these experiments indicate that plants can be genetically transformed for resistance to virus disease development.     

武隆烟区烟草病毒病的病原初步鉴定

对重庆市武隆烟区田间烟草进行了病毒病病原种类的调查和鉴定。26个烟草样品经ELISA共检测到TMV,CMV,PVY及TuMV等4种病毒。所有样品均感染TMV,且病毒复合侵染严重,其中,以TMV,TuMV,CMV及PVY等4种病毒的复合侵染为主,侵染率达30．77％。ELISA结果表明,复合侵染的样品中TMV含量最高,TuMV含量最低。     

湖北省蔬菜病毒病主要毒原种类检测

采用斑点酶联免疫吸附法(Dot-ELISA)和RT-PCR法对采自湖北省7个地区的966份疑似感染病毒的蔬菜样本进行黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、蚕豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus,BBWV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)共7种病毒的检测。结果显示检出阳性样本695份,占总样本数的71.9%。其中,十字花科蔬菜上主要毒原为TuMV,检出率高达86.4%,其次为CMV,检出率为26.7%;茄科、葫芦科和豆科蔬菜上主要毒原均为CMV,检出率分别为34.3%、59.2%和56.2%。CMV几乎能侵染所有蔬菜,为湖北省蔬菜病毒病的主要毒原。在检出的6种病毒中,存在TuMV+CMV、TuMV+BBWV、TuMV+CMV+BBWV、CMV+BBWV、CMV+ToMV和CMV+BBWV+TSWV+TMV等6种复合侵染类型,其中TuMV+CMV为十字花科蔬菜上的主要复合侵染类型,复合侵染率为23.8%,其他蔬菜上主要侵染类型为CMV+BBWV,复合侵染率为28.0%。     

ChIFN-α基因在烟草中的表达及转基因烟草对TMV的抗性

动物α干扰素具有高效广谱的抗病毒作用,通过农杆菌介导法将35S驱动的干扰素基因ChIFN-α转化烟草,Southern杂交和Western杂交进行目的基因的转化、表达检测,重组蛋白的数量通过ELISA测定,对获得的转基因烟草植株进行TMV接种实验,结果表明ChIFN-α基因的转化赋予了转基因烟草对TMV的抗性,进一步的荧光定量PCR差异表达检测结果表明,该抗性可能与转基因烟草体内防卫基因PR-la、抗病N基因和信号转导MAPK基因受到上调表达有关。