白鹭源禽Ⅰ型副粘病毒L基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已发表的鹅副粘病毒GPV-SF02株全基因组序列设计5对引物,采用RT-PCR扩增出白鹭源禽Ⅰ型副粘病毒(W13株)L基因的LA(1121 bp)、LB(1481 bp)、LC(1439 bp)、LD(1476 bp)、LE(1608 bp)5个片段,用DNA Star软件比铰分析后进行拼接,获得长约6760 bp包含有L基因全长的核苷酸序列,而W13株L基因的mRNA全长为6704 bp、开放阅读框(ORF)为6615个碱基、编码2204个氨基酸.氨基酸同源性分析表明:W13株L基因与鹅源SF02、ZJl、NA-1株及鸡源Guangxi7株的同源性均超过97.0%;而核苷酸同源性分析表明:W13株L基因与鹅源SF02、ZJl、NA-1株及鸡源Guangxi7株的同源性均超过93.0%.可见,W13株与鹅源SF02、ZJl、NA-1株及鸡源Guangxi7株的亲缘关系较近.     

民猪CIRP基因的克隆与冷诱导研究

采用生物信息学结合RT-PCR的方法,克隆民猪的冷诱导RNA结合蛋白(Cold inducible RNA-binding protein,CIRP)基因,获得3个变异体序列。猪CIRP变异体1基因cDNA长1 278 bp(GenBank登录号:HQ908794),编码172个氨基酸;变异体2基因cDNA长1 653 bp(GenBank登录号:HQ908795),编码182个氨基酸;变异体3基因cDNA长1 765 bp(Genbank登录号:HQ908796),编码144个氨基酸。CIRP变异体2与变异体1相比,在其编码区的第501碱基处,出现了一段375 bp的插入片段,该插入片段的第46～48个碱基为TAG,使翻译提前终止;变异体3与变异体2相比,在其编码区的第428碱基处,出现一段115 bp插入片段,该插入片段的第5～7个碱基为TGA,使翻译提前终止。3种转录变异体的核苷酸序列同源性为86.45%,氨基酸序列同源性为87%。冷诱导后,CIRP基因在肌肉中的表达水平出现显著升高(P<0.05)。     

大豆MIPS1基因的定位及其低植酸突变性状CAPS标记的开发

【目的】定位大豆肌醇-3-磷酸合成酶基因MIPS1,丰富该基因的遗传信息;开发出该基因的特异性分子标记,用于大豆突变体Gm-lpa-TW-1低植酸(LPA)突变性状的辅助选择。【方法】应用公布的大豆基因组数据库和生物信息学分析确定MIPS1候选染色体,利用分离群体中微卫星标记与LPA性状的共分离,定位突变基因MIPS1;根据MIPS1LPA突变性质和同源基因的序列,开发CAPS分子标记。【结果】大豆中有4个MIPS基因,其中MIPS1被定位在染色体18上,为注释为Glyma18g02210的大豆基因,其DNA起始序列为1364774bp,位于SSR标记Satt570(3162690 bp)和Satt115(10422881 bp)之上,遗传距离分别为5.5和15.2cM;开发了MIPS1特异性共显性CAPS标记,与LPA性状完全共分离。【结论】本文首次确定了MIPS1所在染色体及其位置,丰富了该基因的遗传信息,开发的CAPS标记可用于Gm-lpa-TW-1LPA性状的分子标记辅助选择。     

大豆赖氨酸合成关键酶基因的克隆与定位分析

为了从大豆中克隆DAPD、DAPE和DHDPR 3个大豆赖氨酸合成关键酶基因,并完成其电子定位和结构分析,借助已构建的本地化表达序列标签(expressed sequence tag,简称EST)数据库,与不同物种的对应基因序列进行比对、拼接,同时利用已构建的大豆整合图谱,完成这3个关键酶基因的电子克隆及电子定位。结果表明,RT-PCR克隆、序列分析的结果与预测序列基本一致。通过电子定位,得到这3个基因分别在J、L和N 3个连锁群上。通过对基因的结构分析,得到DAPD、DAPE、DHDPR 3个基因的c DNA长度分别为1 467、1 080、1 035 bp,g DNA长度分别为4 662、3 728、3 158 bp,外显子数量分别为8、9、8个,内含子数量分别为7、8、7个。研究结果为其他氨基酸合成关键酶基因的克隆提供了参考依据,也为后续基因功能研究以及分子辅助育种打下了良好基础。     

柔嫩艾美耳球虫孢子化7小时卵囊中的Etmic-2基因克隆及测序

作者根据子孢子微线基因(Etmic-2)的 cDNA 序列,利用计算机设计出一对引物,从孢子化7h 卵囊中用 RT-PCR 技术扩增出1个片段(mic2～7h).把这个片段克隆到 pGEM-T-Easy Vector 中后,我们得到一个阳性克隆 pmic2～7h.酶切分析证明 pmic2～7h 含有 mic2～7h,并且外源片段以反方向插入 T 载体中.核苷酸序列测定结果表明 mic2～7h 比 Etmic-2基因至少长111bp.但这多出的111bp 并没有造成基因读框错位,也没有造成基因读框终止.这111bp 由2部分组成,一部分长42bp,另一部分长69bp.虽然这二个片段的3′端均有典型的真核生物 mRNA 内含子剪切信号,但5′端却没有内含子的剪切信号点.这说明多出来的111bp不是内含子序列,mic2～7h 基因也不是 Etmic-2基因的前体,而可能是 EtMIC-2的一种蛋白异形体基因.     

桑树光合系统ⅡMPsbR基因的克隆及在不同部位表达分析

根据桑树表达序列标签(ESTs),采取RT-PCR方法克隆了一个编码桑树光合系统ⅡPsbR基因的全长cDNA序列,以期为从分子水平上揭示桑树高效光合作用的机制奠定基础.序列分析表明,该基因全长623bp,存在56 bp的5'-UTR和306bp的3'-UTR,其开放阅读框(ORF)长261bp,编码86个氨基酸,预测蛋白质分子质量为8.95 kD,等电点为11.09.同源分析表明,桑树光合系统ⅡMPsbR基因与花生、大豆编码氨基酸具有较高的同源性;根据MPsbR基因的氨基酸序列与其他20个物种的氨基酸同源序列构建的系统进化树表明,桑树与花生、海桑、梨、大豆的亲缘关系较近.半定量RT-PCR研究表明,桑树光合系统MPsbR基因在桑树不同部位的表达水平有一定差异,在幼叶(刚展开第一张叶)和顶芽表达量最高,其作用机理有特于进一步研究之中.     

水稻γ-生育酚甲基转移酶基因全长cDNA的克隆与分析

γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是植物维生素E生物合成途径中的关键酶.通过RACE-PCR得到了水稻γ-TMT基因的cDNA序列,该基因的cDNA全长1 432 bp,包含一个长为1 089 bp的完整开放读码框,推导的氨基酸序列与小麦、玉米、向日葵、番茄、大豆、拟南芥的γ-生育酚甲基转移酶基因的同源性分别为90%、87%、76%、75%、74%、70%.     

大珠母贝组织蛋白酶D的cDNA克隆、序列特征分析及应激表达研究

通过同源克隆方法和cDNA末端快速扩增技术(RACE),获得了大珠母贝(Pinctada maxima)组织蛋白酶D基因(命名为pmCTSD)的cDNA全长序列1 742 bp,其中5'非翻译区(UTR)38 bp,3'UTR 534 bp,开放阅读框1 170 bp,编码390个氨基酸,分子量约为41.9 ku,等电...     

大豆再生相关基因GmLEC的克隆及生物信息学分析

利用同源克隆技术,对拟南芥再生相关基因LEC进行同源序列比对,从大豆中克隆LEC基因两个成员的全长CDS序列,得到大豆再生相关基因Gm LEC1-a,Gm LEC1-b及Gm LEC2-a,Gm LEC2-b,用生物信息学方法对大豆Gm LEC1及Gm LEC2基因核苷酸序列以及蛋白质结构、亲水性和疏水性及进化树等进行分析。结果表明,大豆再生相关基因Gm LEC1-a编码区长度为672 bp,编码223个氨基酸,Gm LEC1-b编码区长度为681 bp,编码226个氨基酸,Gm LEC2-a编码区长度为2 205 bp,编码734个氨基酸,Gm LEC2-b编码区长度为2 196 bp,编码731个氨基酸,Gm LEC蛋白为亲水性不稳定蛋白;通过对LEC蛋白功能结构域进行分析发现,Gm LEC1为H4超家族成员,Gm LEC2为B3超家族成员,并均与拟南芥属植物亲缘较近。     

大豆天冬氨酸蛋白酶基因启动子的克隆及其表达活性分析

【目的】克隆大豆天冬氨酸蛋白酶基因(soyAP1)启动子,并对其表达方式及活性进行分析。【方法】利用TAIL-PCR方法从大豆基因组DNA中克隆soyAP1基因启动子片段。利用启动子在线预测工具分析soyAP1基因启动子片段的启动子元件,并用克隆得到的SAP片段替换pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子,构建表达载体pCAM-SAP。通过农杆菌介导法,使其在大豆各组织中进行瞬时表达,用GUS组织化学染色法分析SAP在各组织中的表达活性。【结果】克隆获得了大豆soyAP1基因的启动子片段,长1 650bp,并将之命名为SAP,其转录起始位点可能是553bp处的A;PLACE分析表明,SAP序列中含有多种典型的种子特异性表达元件;GUS组织化学染色显示,SAP驱动的GUS基因在大豆根、茎、叶中基本不表达,但在种子中有较高的表达活性,且表达强度与CaMV35S启动子相近。【结论】大豆SAP启动子可能具有种子特异表达特性。     

芸薹属栽培种ALS1-3的克隆及序列分析

【目的】揭示6种芸薹属植物乙酰乳酸合成酶(ALS)基因的结构特征,为ALS酶的遗传操作和抗除草剂种质创制奠定基础。【方法】利用特异PCR方法,对甘蓝型油菜(Brassica napus L.)、甘蓝(B.oleracea)、芥菜型油菜(B.juncea)、白菜型油菜(B.rapa)、埃塞俄比亚芥(B.carinata)、黑芥(B.nigra)等6个芸薹属16份材料的ALS基因进行扩增、克隆测序及生物信息学分析。【结果】除1个B.nigra材料未扩增出任何产物外,其余参试材料中均有PCR扩增产物,共成功克隆了30个ALS基因(GenBank登录号为KM816807~KM816836),且克隆的基因ALS1、ALS2、ALS3均不含内含子,只有一个开放阅读框。ALS1基因开放阅读框长为1 968bp,编码655个氨基酸;ALS2基因开放阅读框长为1 914bp,编码637个氨基酸;ALS3基因开放阅读框长为1 959bp,编码652个氨基酸。参试材料中,在ALS1基因中检测到7个SNP,其中4个导致氨基酸突变;在ALS2基因中检测到3个SNP,其中2个导致氨基酸突变;在ALS3基因中检测到25个SNP,其中2个导致氨基酸突变。在3类ALS蛋白中,ALS1和ALS3遗传距离较近,与ALS2的遗传距离相对较远。ALS1基因定位于C01染色体上,ALS2和ALS3基因定位于A01染色体上。【结论】参试的6个芸薹属不同材料间ALS1、ALS2、ALS3基因序列及其编码的蛋白序列均存在差异。     

龙眼胚性愈伤组织ACC氧化酶基因的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

【目的】分离克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织乙烯合成关键酶ACO(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase)基因,并分析该基因在龙眼体细胞胚胎(以下简称龙眼体胚)发生过程中的表达情况。【方法】采用RT-PCR结合RACE法,获得龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA全长序列和DNA序列,运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR(q-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达【。结果】克隆得到龙眼胚性愈伤组织ACO基因1315bp的cDNA全长序列(GenBank登录号为FJ534854),该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列(含315个氨基酸)与其它植物ACO具有86%-47%同源性,包含了5'非编码区为86bp,3'非编码区为281bp,3'poly(A)尾长13bp;该基因的DNA序列(GenBank登录号为GU123929)长为1660bp,包含3个内含子,内含子的剪切位点均符合真核生物"GT-AG"规则;该基因在龙眼体胚各阶段均有表达,整个变化趋势呈字母"M"状。【结论】确定所获得的序列是龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA序列和DNA全长序列;该基因在不完全胚性紧实结构和心形胚的表达量为两个峰值。     

滇龙胆草7-脱氧番木鳖酸-7-羟化酶基因的克隆与表达分析

克隆滇龙胆7-脱氧番木鳖酸-7-羟化酶基因GrDL7H,并进行表达分析,为龙胆苦苷生物合成途径的解析奠定基础。根据滇龙胆转录组GrDL7H序列,使用RT-PCR(逆转录PCR)和3′RACE(cDNA末端快速扩增)技术从滇龙胆幼叶中克隆该基因及其启动子,并进行序列分析和组织特异性表达分析。结果表明,GrDL7H基因(登录号:KT306971)全长2 154 bp,包含5个外显子和4个内含子,其中GrDL7H基因(登录号:KP340980)开放阅读框长1 542 bp,编码513个氨基酸;GrDL7H蛋白质相对分子质量为59.08 ku,等电点(pI值)为8.88,属于CYP450蛋白超家族成员,可能定位于叶绿体;GrDL7H蛋白质无信号肽,为亲水稳定蛋白质,主要由α-螺旋和环构成;GrDL7H蛋白质具有CYP450蛋白质保守结构域,功能为参与氧化还原反应;滇龙胆GrDL7H蛋白质与黄金鸡纳树CcDL7H蛋白质的亲缘关系最近;GrDL7H基因启动子主要包含6个光应答元件、1个赤霉素应答元件、6个参与茉莉酸甲酯应答的顺式调控元件和1个热胁迫应答元件等;组织特异性表达分析结果表明,GrDL7H基因主要在叶片中表达。     

大豆花叶病毒侵染初期抑制消减文库构建及初步分析

大豆花叶病毒病是危害大豆产量和品质的重要病害之一,通过分子手段研究SMV抗性相关基因可以辅助抗病育种工作.本研究以感病品系Sowonkong和它的抗病近等基因系(Near-isogenic line,NIL) Suwon 243为材料,利用抑制差减杂交技术构建了一个大豆花叶病毒接种初期的cDNA文库.随机挑取50个阳性克隆测序,获得高质量的EST 37个.所得EST核苷酸长度分布在126～1 003 bp.功能已知基因的EST涉及抗病与防御、能量和初级代谢、蛋白质合成和加工转录修饰、信号转导相关基因,其中:过氧化氢酶片段长度最长达1 003 bp.     

大豆GmeR基因启动子的克隆及序列分析

GmeR是一种植物酶学抗病基因,编码的蛋白质具有丝氨酸乙醛酸转氨酶(SGT)活性,受水杨酸诱导.与大豆霜霉病抗性密切相关.为了进一步研究GmeR基因的抗病机理,我们利用染色体步移技术克隆得到长为1 036 bp的GmeR基因5'上游片段.序列分析显示此片段舍有典型的TATA-box、CAAT-box、G-box和as-...     

松材线虫乙酰胆碱酯酶基因Bx-ace-2的克隆和序列分析

利用RT-PCR和RACE技术克隆了一个松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)乙酰胆碱酯酶基因Bx-ace-2,该基因cDNA全长为2 010 bp,有1 878 bp的开放阅读框(ORF),推测其编码的蛋白有625个氨基酸;Bx-ace-2基因组克隆长为2 192 bp,含有7个内含子.氨基酸序列比对和同源性分析显示:松材线虫Bx-ace-2编码的乙酰胆碱酯酶与已报道的秀丽小杆线虫ACE-1、ACE-3和ACE-4型乙酰胆碱酯酶的相似性为28%～31%,而与秀丽小杆线虫ACE-2及甘薯茎线虫、南方根结线虫、大豆胞囊线虫、马铃薯白线虫和胎生网尾线虫的ACE-2型乙酰胆碱酯酶的氨基酸序列相似性为44%～52%.构建的系统进化树也显示:松材线虫乙酰胆碱酯酶与其他线虫的ACE-2型乙酰胆碱酯酶具有相对更近的遗传距离,因此推测该松材线虫乙酰胆碱酯酶也属于ACE-2型.     

虹鳟冷休克蛋白Y-box基因的cDNA全长克隆与序列分析

采用逆转录PCR(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术从虹鳟(Oncorhynchus mykiss)脑组织中克隆了Y-box基因cDNA全长序列(GenBank登录号:FJ492962)。该基因cDNA全长为1 452 bp,其中5'端非翻译区(5'UTR)长137 bp,3'端非翻译区(3'UTR)长409 bp,开放阅读框(ORF)长906 bp,编码301个氨基酸。蛋白质相对分子质量为33.1×103。PSORTⅡ亚细胞定位显示该蛋白位于细胞核,富含两类核定位信号,分别为pat4与pat7。虹鳟的Y-box蛋白序列与大西洋鲑、斑马鱼和大菱鲆的同源性分别为99%、80%和79%。同源建模显示虹鳟与人的Y-box蛋白具有十分相似的三级结构。系统发育树显示不同物种的Y-box蛋白分为3个亚群:亚群Ⅰ为鱼类;亚群Ⅱ为两栖类、鸟类及哺乳类;亚群Ⅲ为节肢动物类,这与物种间的进化历程基本一致。     

虹鳟冷休克蛋白Y-box基因的cDNA全长克隆与序列分析

采用逆转录PCR(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术从虹鳟(Oncorhynchus mykiss)脑组织中克隆了Y-box基因cDNA全长序列(GenBank登录号:FJ492962)。该基因cDNA全长为1 452 bp,其中5'端非翻译区(5'UTR)长137 bp,3'端非翻译区(3'UTR)长409 bp,开放阅读框(ORF)长906 bp,编码301个氨基酸。蛋白质相对分子质量为33.1×103。PSORTⅡ亚细胞定位显示该蛋白位于细胞核,富含两类核定位信号,分别为pat4与pat7。虹鳟的Y-box蛋白序列与大西洋鲑、斑马鱼和大菱鲆的同源性分别为99%、80%和79%。同源建模显示虹鳟与人的Y-box蛋白具有十分相似的三级结构。系统发育树显示不同物种的Y-box蛋白分为3个亚群:亚群Ⅰ为鱼类;亚群Ⅱ为两栖类、鸟类及哺乳类;亚群Ⅲ为节肢动物类,这与物种间的进化历程基本一致。     

大豆rbcS基因启动子的克隆及在转基因烟草中的功能缺失分析

【目的】进一步验证栽培大豆rbcS基因启动子功能,为植物基因工程相关研究提供启动子资源。【方法】从栽培大豆中克隆了rbcS基因5′端上游1 538bp的DNA序列,根据光诱导表达调控元件及顺式作用功能元件所在的位置,设计含1 089,712和190bp 3个5′端缺失体,并将rbcS基因启动子(1 538bp)及3个5′端系列缺失体序列分别与gus基因融合,构建植物表达载体并命名为pGmrbcS、pA、pB和pC,用农杆菌介导法转化烟草,通过gus基因活性变化检测不同缺失体的表达特性。【结果】克隆了1 538bp的大豆rbcS基因启动子序列及1 089,712和190bp的5′端缺失体启动子片段。GUS活性检测表明,在pGmrbcS转基因烟草的叶中GUS活性最高,且与pCAMBIA1301转基因烟草叶片中CaMV35S启动子驱使gus基因的表达量相当,而茎、根中GUS活性较低。GUS定量分析表明,T1代转基因烟草光下培养时,3种缺失体启动子叶片中的GUS表达活性均与CaMV35S启动子相当,其中pB活性最高,是CaMV35S启动子活性的1.4倍,pA、pC活性低于pB,分别为pB活性的84%和71%;含pA的转基因烟草于黑暗中萌发的幼苗叶片gus基因不表达,光下萌发幼苗叶片有gus基因表达,而含有pB、pC的转基因烟草,在黑暗和光下萌发的幼苗叶片中均有gus基因表达,且表达量以pB最高。【结论】含有长度为1 089bp(pA)光诱导元件的rbcS基因缺失体启动子具有光诱导和组织特异表达特性,长度为712bp(pB)的缺失体启动子的启动活性最高。     

紫苏PfPDAT基因单核苷酸多态性分析

[目的]磷脂:二酰甘油脂酰转移酶(PDAT)是植物油脂合成最后一步酰基化反应的关键酶之一,研究紫苏PfPDAT基因单核苷酸多态性,旨在分析该基因多态性与紫苏种子油脂含量之间的关系。[方法]以脂肪酸含量不同的7个紫苏品种为试材,通过直接测序法分析PfPDAT基因cDNA全长序列的单核苷酸多态性及其与油脂含量的关系。[结果]在所测总长度为14 679bp的核苷酸序列中,共检测到9个SNP和2个InDel,单核苷酸多态性频率分别为1/1 631bp和1/7 340bp,其中编码区含2个SNP,非编码区为7个。编码区和非编码区发生SNP的频率分别为1/5 439bp和1/543bp。根据PfPDAT基因序列多态性将供试紫苏材料分为不同的单倍型,单倍型H1和H2中都包含有油脂含量较高和含量较低的材料。[结论]PfPDAT基因的单倍型分类与紫苏油脂含量之间没有显著相关性,同时也反映了植物种子油脂合成的复杂性。