草菇多酚氧化酶基因的克隆与表达分析

【目的】解析草菇多酚氧化酶基因家族序列信息,明确其特征和表达模式。【方法】通过转录组测序找出含有酪氨酸酶结构域的基因,并根据搜索得到的序列设计引物,以不同发育时期的草菇 v26 菌株,以及草菇蛋形期外菌膜、菌盖、菌柄等不同组织为材料提取 RNA,经反转录为 cDNA,扩增获得草菇多酚氧化酶基因序列。采用在线生物信息学网站预测草菇多酚氧化酶的理化性质。采用 RT-PCR 的方法,检测草菇不同发育时期和不同组织部位多酚氧化酶的表达模式。【结果】获得 4 个草菇多酚氧化酶基因家族的 CDS 序列,依次命名为 VvPPO1、VvPPO2、VvPPO3、VvPPO4,其中 VvPPO1 CDS 全长 1 596 bp、编码 531 个氨基酸,VvPPO2 CDS 全长 2 685 bp、编码 894 个氨基酸,VvPPO3 CDS 全长 1 593 bp、编码 530 个氨基酸,VvPPO4 CDS 全长2 067 bp、编码 688 个氨基酸。生物信息学分析表明,4 个基因编码的蛋白均含有 2 个铜离子结合区,为亲水性蛋白;RT-PCR 结果显示,4 个基因在草菇发育的菌丝期、原基期、蛋形期、成熟期均有表达,VvPPO1、VvPPO3 和VvPPO4 的表达量在子实体时期高于菌丝期,在蛋形期 VvPPO1 和 VvPPO4 在外菌膜的表达量比在菌柄和菌盖中的表达量高。【结论】在草菇中搜索得到 4 个多酚氧化酶基因,均含有 2 个铜离子结合区,4 个基因在各个发育时期均有表达。     

草菇钙调磷酸酶催化亚基(Vv-CNA)的序列与表达

[目的]分析草菇钙调磷酸酶催化亚基(Vv-CNA)的序列与表达,为进一步探究草菇生长发育及子实体开伞分子调控机理提供参考.[方法]通过生物信息学分析确定Vv-CNA基因的组成及保守结构,将ORF Finder预测的草菇CNA氨基酸序列与从NCBI下载的其他真菌CNA氨基酸序列进行比对,并通过荧光定量PCR检测Vv-CNA基因在草菇不同生长时期的相对表达量.[结果]Vv-CNA基因编码区为2503 bp,包含10个内含子(其中I2、I8、I9和I10存在内含子保留现象),编码610个氨基酸,GenBank登录号KX463514.将Vv-CNA氨基酸序列与动物(人、小鼠)、植物(拟南芥、水稻)和真菌(曲霉、酵母等)的CNA氨基酸序列进行同源比对分析,结果发现Vv-CNA蛋白有3个最保守的结构域,与密褐褶菌(Gloeophyllum trabeum)的亲缘关系最近.Vv-CNA基因在草菇子实体的蛋形期和伸长期高表达,以蛋形期的相对表达量最高.[结论]Vv-CNA基因编码钙调磷酸酶催化亚基,其高表达有利于草菇菌柄的伸长.     

球毛壳菌pdc基因克隆及生物信息学分析

利用BlastX将球毛壳菌（Chaetomium globosum）ESTs序列与GenBank的Nr数据库进行相似性搜索,获得含有丙酮酸脱羧酶基因（pdc）的2条ESTs（BP099214和BP113195）,以此设计引物,克隆获得球毛壳菌pdc基因的cDNA及DNA序列。cDNA和DNA序列长度分别为1725和1829bp,编码574个氨基酸的多肽,蛋白质分子质量63．38ku。蛋白质家族预测其属于焦磷酸硫胺素TPP家族。BlastP相似性分析表明,PDC氨基酸序列保守性不高,与其相似性最高的是柄孢霉的PDC（Podospora anserina,CAD60727）,相似性为79％。pdc基因的cDNA及DNA序列在GenBank上的登录号分别为EU304327,EU304326。     

草菇栽培常见的鬼伞及防治方法

鬼伞在分类上属于伞菌目 ,鬼伞科 ,鬼伞属(Coprinus)。在草菇栽培过程中 ,鬼伞是菇床中数量最多、生长最快、最为常见的竞争性真菌。鬼伞的生活条件和草菇相似 ,子实体生长极快 ,一旦成形成子实体 ,早上开伞中午即凋谢 ,老熟后菌伞开裂并产生黑色的黏液。鬼伞大量消耗菇床培养基中的养分和水分 ,直接影响草菇菌丝的正常生长发育和子实体的形成 ,往往导致草菇减产减收。1常见鬼伞的识别墨汁鬼伞 ,子实体卵形到铃形或锥形 ,3～7cm高 ,开伞后直径5～8cm ,菌盖浅褐色 ,具残缺的灰色鳞毛 ,边缘有褶纹 ,常裂开。该菌可食用、药用。菌肉薄 ,灰色。…     

牦牛DAZL基因编码区的克隆和序列特征与进化分析

根据黄牛DAZL基因序列设计引物,通过PCR扩增和克隆测序获得牦牛睾丸组织DAZL基因编码区序列,利用生物信息学软件分析牦牛DAZL基因编码区序列结构以及与其他物种的系统发育关系.结果表明:牦牛DAZL基因cDNA序列长度为1782 bp,编码区全长885 bp,编码295个氨基酸,与黄牛的氨基酸序列同源性为98.31%;牦牛DAZL蛋白含有DAZ基因家族所具有的典型的RNA结合域和DAZ重复基序.系统发育分析显示:牦牛与黄牛首先聚为一类,然后与哺乳纲的其他物种相聚,而与鱼纲、爬行纲动物的亲缘关系最远.     

山核桃APETALA1同源基因的克隆与序列分析

根据植物花分生组织及花器官形成过程中起重要作用的APETALA1（AP1）基因的高度保守区序列,设计合成一对长度为23bp的聚合酶链式反应（PCR）引物,以山核桃Carya cathayensis因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长为486bp的DNA片段,克隆到pMD18-T载体。测序和序列分析结果表明,获得了山核桃AP1同源基因中的1个片段,该片段序列包含2个内含子,长度分别为86bp和291bp,编码区共编码36个氨基酸。其序列已在Gen荷Bank中注册（注册号为EU155118）,在Gen Bank中进行同源性检索结果表明,其氨基酸序列与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性高达69％～88％,推测它们在功能上也是相似的。     

毛叶枣APETALA1同源基因的克隆

分析在植物花分子生组织及花器密形成过程中起重要作用的APETALA1（AP1）基因的保守区序列，设计1对长度为23pb的PCR引物，以毛叶枣基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增出长为648bp的DNA片段，克隆人pUCm-T载体，测序和序列分析结果 表明获得了毛叶枣AP1同源基因中部的1个片段，该片段有2个内含子，长度分别为152bp和386pb，编码区共编码36个氨基酸，其序列已在GenBank中登记（登记号为AF356541）,在GenBank中进行同源性检索，结果表明其氨基酸序列与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性高达66％－88％，推测它们在功能上也是相似的。     

海南伞菌资源及区系地理成分初步分析

对海南伞菌19科60属的区系地理成分进行了初步分析。中期，种类较多的科是口蘑科、红菇科、牛肝菌科、粉褶菌科、鹅膏菌科、鬼伞科、蘑菇科、多孔菌科、丝膜菌科和球盖菇科，以上10科所含种类占总种数的91.8%。主要的属有红菇属、粉褶菌属、小皮伞属、鹅膏菌属、微皮伞属、牛肝菌属、脆柄菇属、蘑菇属、香菇属、红盖牛肝菌属、乳属、粉孢牛肝菌属、鬼伞属、裸伞属、侧耳属、褶孔菌属和小牛肝菌属，从 的区系地理成分上可分为广布成分（60％）、泛热带成分（18.3%）、热带亚洲－－热带非洲成分（1.7%）和北温带成分（20％），其中以广布成分为主。     

猪乳脂肪球表面因子8的克隆与表达分布

基于电子延伸序列,本试验成功克隆了猪乳脂肪球表面因子8（MFGE8）基因（GenBank登录号：EU559724）并进行了序列分析,同时利用RT-PCR方法分析了MFGE8基因的组织分布规律。序列分析结果表明MFGE8开放读码框全长为1296bp,编码431个氨基酸残基的多肽链,克隆的MFGE8基因与人、大鼠、小鼠、牛的同源性分别为71．9％、78．7％、79．1％、87．7％,推测的氨基酸序列的同源性分别为65．7％、74．0％、74．0％、84．5％。氨基酸序列N端含有Notch样“EGF”结构,C端含有FA58C结构域。构建的系统发育树显示猪与牛的亲缘关系最近。组织表达分析结果表明MFGE8在乳腺中表达最高,在大脑中表达量最低。     

貉白介素-18(IL-18)基因的克隆及序列分析

从植物血凝素（PHA）诱导的貉外周血淋巴细胞中提取总RNA,通过反转录聚合酶链反应（RT-PCR）首次对貉IL-18的基因进行扩增。序列分析结果表明,该序列含有1个582bp的开放阅读框架,编码193个氨基酸,与已报道的北极狐和犬IL-18序列同源性高达95．9％和94．8％,氨基酸同源性为93．8％和91．2％,与其它物种的IL-18基因间具有较大种属差异性。     

一品红转化酶基因片段的克隆和序列分析

根据植物酸性转化酶基因的保守区序列,设计1对PCR引物,以一品红基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长约500 bp的DNA片段,克隆入pM D-18T载体,测序结果表明:获得1个一品红酸性转化酶基因家族的成员,该基因片段长523 bp,编码173个氨基酸,属于开放阅读框的一部分,不含内含子。在G enB ank中进行同源性检索的结果表明,该成员编码的氨基酸与其他植物细胞壁酸性转化酶编码的氨基酸同源性较高。     

互花米草中NHX基因片段的克隆与序列分析

利用同源克隆方法从盐生植物互花米草（Spartina alterniflora）中分离并克隆出Na~＋/H~＋逆向转运蛋白基因的1段cDNA片段,长度为951 bp,推测编码317个氨基酸。氨基酸序列的对位排列分析显示,该cDNA片段对应的氨基酸序列与已知的植物液泡膜型Na~＋/H~＋逆向转运蛋白的氨基酸序列有较高的相似性,且与禾本科植物中的同源物之间的关系更为密切。     

斑马鱼促性腺激素释放激素及相关肽基因的克隆与序列分析

从斑马鱼脑组织提取总RNA,应用RT-PCR方法克隆促性腺激素释放激素(GnRH) cDNA,其长度为646 bp,包括一个258 bp开放阅读框;编码的GnRH前体为86个氨基酸残基,由一个信号肽、GnRH十肽和一个由蛋白水解位点(Gly-Lys-Arg)连接的促性腺激素释放激素相关肽(GAP)组成;其中信号肽和相关肽的长度分别为24和49个氨基酸.该cDNA编码的GnRH的前体氨基酸序列与其他物种的GnRH前体基本一致.表明物种间GnRH cDNA的蛋白编码区高度保守,而非编码区的保守性程度很低.进化分析发现,斑马鱼与鲤、鲫、拟鲤、黑头软口鲦等淡水鲤科鱼类的同源性较高.     

无机焦磷酸化酶融合基因克隆分析及表达载体的构建

无机焦磷酸化酶(PPa)基因是植物糖代谢过程中的蔗糖合成调控基因,为将该基因运用于甘蔗转基因的研究,从面包酵母克隆了该基因,利用生物信息学方法对该基因进行组成成分和理化性质分析,预测分析其疏水性/亲水性,并将其核苷酸和编码氨基酸序列提交Genbank进行比对分析。利用从武运粳8号水稻中克隆得到Rub isco小亚基基因(rbcS)的5'上游调控区rbcS启动子,构建了由rbcS引导的无机焦磷酸化酶融合基因,并将其转入根癌农杆菌EHA105菌株中。     

鸭源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA基因序列测定及生物信息学分析

据GenBank中人源大肠杆菌pilA基因序列,由Oligo 6.0设计一对引物,以提取的鸭源致病性大肠杆菌基因组为模板,进行PCR扩增,获得了5株鸭源致病性大肠杆菌的pilA基因,序列测定和生物信息学分析表明:鸭源致病性大肠杆菌pilA基因核苷酸序列长度为549 bp,编码182aa,与人源、鸡源及猪源大肠杆菌pilA基因之间核苷酸同源性为87.3%~100.0%,氨基酸同源性为87.5%~100.0%。对不同宿主来源大肠杆菌pilA基因所编码蛋白的二级结构、亲水性、抗原性、抗原表位进行预测分析比较,结果显示Ⅰ型菌毛间具有一定的结构相似性,并存在一定的共同抗原位点;系统进化分析表明,各菌株之间的pilA基因遗传相关性与其宿主来源及血清型之间没有严格的相关性。     

Molecular Cloning and Characteristics Analysis of ghrelin Gene in Asian Swamp Eel(Monopterus albus)

Ghrelin is an important signaling molecule linking reproductive and energy metabolism. In this study, ghrelin gene of Monopterus albus was cloned. Its structure and function were analysized preliminarily. By Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE) technique, full-length cDNA and DNA sequences of ghrelin gene were obtained. The full-length ghrelin cDNA(GenBank accession no. JX122807) was 552 bp long, containing a 115 bp 5'-untranslated region, a 324 bp open reading frame and a 113 bp 3'-untranslated region. The full-length ghrelin DNA was 1 323 bp, consisting of three introns and four exons. The exon/intron junction sequences conformed to the GT/AG rule. Three introns were 594, 84 and 93 bp in length, respectively; four exons were229, 78, 112 and 133 bp in length, respectively. The results of amino acid sequence analysis showed that the deduced propreghrelin sequence of M. albus contained a signal peptide(SP) consisting of 22 amino acid residues, a mature peptide(MP)consisting of 19 amino acid residues and a C-terminal amino acid residue. Among them, the third amino acid of MP was serine(Ser~3) as the site for N-acylation and N-deacetylation reactions; the C-terminal amino acid residue sequence might contain a peptide hormone obestatin, which is a physiological antagonist of mature Ghrelin peptide. The homology and phylogenic relationships analyses of amino acid sequences suggested that propreghrelin of M. albus had high similarity to those of several Perciformes fishes; the propreghrelins of M. albus, Perciformes and Heterosomata fishes were clustered into a subgroup. The high conservatism of the gene structure and the amino acid sequences indicated that Ghrelin exerts important physiological functions and plays similar physiological mechanisms in vertebrates.     

柑桔转化酶基因家族新成员的克隆和序列分析

分析植物可溶性转化酶基因的保守区序列，设计一对PCR引物，以甜橙基因组DNA为模板。采用PCR方法扩增出长约1000bp的DNA片段。克隆入pUCm-T载体，测序结果表明获得柑桔酸性转化酶基因家族的一个新的成员。基因片段长1096bp。包括4个外显子和3个内含子，其序列已在GenBank中登记（登记号为AF433643）。在GenBank中进行同源性检索的结果表明，该成员编码的氨基酸与植物可溶性酸性转化酶的氨基酸同源性较高。与宽皮柑桔（GenBank登记号，AF312229）可溶性酸性转化酶基因编码的氨基酸具有77%的同源性，而与定位于细胞壁的（不溶性）酸性转化酶同源性较低。最高权33%（Fragaria ananassa,GenBankAF000521)。聚类分析结果表明该成员与我们已报道的2个柑桔酸性转化酶基因不同，推测我们获得的基因是转化酶基因家族的又一新成员（CS-VI1）。它与CU-AI1和CSCWI-1的核苷酸同源性分别为45.28%和44.85%。氨基酸同源性分别为27.58%和10.35%。3个成员间核苷酸和氨基酸序列较低的同源性，不会在South-ern,Northern和Western杂交中产生交叉干扰反应。     

日本囊对虾apo-14基因的全克隆及序列分析

以日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)肝胰腺组织为实验材料,提取总RNA,通过3′以及5 '-RACE基因克隆技术,首次在日本囊对虾中克隆到载脂蛋白apolipoprotein-14(apo-14)基因的全长序列,包含完整的ORF以及3′-UTR和5′-UTR.日本囊对虾apo-14 cDNA序列全长为784 bp,其中ORF长度为420 bp,编码139个氨基酸.对虾apo-14氨基酸序列与其他鱼类apo-14氨基酸序列有较高的相似性.     

矮牵牛细胞色素b5蛋白编码基因difF的克隆及序列分析

以紫红色、蓝紫色矮牵牛(Petunia hybrida)的花瓣为材料,提取总RNA,用Oligo(dT)作为引物反转录合成cDNA第一链:以此为模板,用Genebank上的矮牵牛细胞色素b5蛋白DIF-F(difF)的mRNA序列设计成的引物进行PCR扩增,扩增到一条约450 bp的片段,将此片段克隆到pGM-T载体上.对重组克隆进行序列分析,结果表明所克隆到的矮牵牛细胞色素b5蛋白的cDNA的编码区含有450个核苷酸,编码149个氨基酸残基;其核苷酸及氨基酸的序列与Genebank上的同源性分别达到99.93;和100;.     

黑豆NBS类抗病基因同源片段的克隆与分析

根据已克隆的抗病基因保守结构域设计简并引物,以湖南黑豆（HH）为试材,通过RT-PCR,从cDNA中扩增抗病基因同源序列,测序鉴定出2个含有通读阅读框的DNA片段：FNBSl、FNBS3。FNBS1大小为534bp,编码178个氨基酸;FNBS3大小为513bp,编码169个氨基酸。BLASTP分析表明,2个片段均具有NB-ARC结构域（与植物抗病有关）,并且包含p-loop、Kinase-2、HD等结构域。基因FNBSl与大豆基因RPMl-like编码的氨基酸序列的同源性为98％,基因FNBS3与大豆基因N-like 编码的氨基酸序列的同源性为99％,推测FNBS1、FNBS3可能是黑豆NBS-LRR类抗病基因的核心区域。