AGPase基因植物过表达载体的构建及对甘蓝型油菜的转化

ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)是淀粉合成途径的关键酶。本研究克隆了大肠杆菌AGPase基因glg C,并通过双定点突变降低其对无机磷酸盐敏感性所致抑制作用以提高其酶活。而后将甘蓝型油菜AGPase导肽编码序列与glgc融合,构建成植物表达载体p MB-TG,并导入根癌农杆菌LB4404。利用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜,获得转基因植株。PCR及半定量RT-PCR检测结果显示,该融合基因已导入油菜再生植株基因组并获得表达。增加淀粉积累为油脂合成提供更多碳源,被认为是一条潜在的提高油菜种子含油量的有效途径。本研究为利用遗传改良技术实现上述途径在油菜育种中的应用奠定前期基础。     

披碱草焦磷酸化酶基因EdHP1的功能分析

氢离子焦磷酸化酶(H~+-PPase)是一类H~+转运蛋白,它以焦磷酸(PPi)水解底物,水解PPi产生的自由能与H~+跨膜转运相藕联,将细胞质中的H~+泵入液泡中,建立跨液泡膜电化学梯度,形成质子驱动力,为无机离子及其他溶质进出液泡提供动力,有利于植物维持细胞离子平衡和渗透平衡,增强植物的抗逆性。基于前期对披碱草(Elymus dahuricus)H~+-PPase基因Ed HP1克隆的基础,对其表达谱及基因功能进行了进一步研究。结果表明,通过Northern blot分析发现,该基因在披碱草中受干旱、低温非生物胁迫诱导表达。通过对转Ed HP1基因烟草在干旱、低温环境下的功能分析发现,过表达Ed HP1基因可以提高转基因烟草对干旱、冷胁迫的抗性。     

白及GMP基因cDNA全长克隆及生物信息学分析

【目的】克隆白及GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase)基因(Bs GMP)cDNA全长序列,分析该基因生物学信息,为该基因功能的进一步鉴定提供依据。【方法】基于同源序列克隆GMP基因中间片段,并采用RACE技术扩增GMP基因cDNA全长,用DNAMAN、Tmpred及Softberry等软件进行编码多肽序列、理化性质及亚细胞定位等分析。【结果】从白及叶片中克隆到的GMP基因全长1523 bp,其中包含1086 bp的开放阅读框(ORF),编码361个氨基酸,理论蛋白分子量为39.35 k Da,理论等电点为6.03。进一步分析发现该基因具有跨膜结构,亚细胞定位分析发现该基因主要分布于细胞质和线粒体。蛋白三级结构预测显示,Bs GMP蛋白有11个α螺旋,33个β折叠,46个β转角;该蛋白第1~24个氨基酸含有醛酮还原酶的保守结构域,第256~335个氨基酸含有Lbeta H家族保守区。BLAST多重序列分析表明,Bs GMP氨基酸序列与铁皮石斛、蝴蝶兰的亲缘性最高,分别达到95%和92%。【结论】成功克隆到白及GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因(Bs GMP),并进行相关生物信息学分析,为该基因的进一步功能研究奠定了基础。     

GmVP1基因克隆与转GmVP1/GmNHX1双价基因的大豆发状根耐盐性分析

将Na~+外排和区隔化作用的Na~+/H~+逆向转运蛋白(NHX)的基因和能够为其提供跨液泡膜H~+梯度驱动力的液泡膜H~+-焦磷酸酶(VP)的基因共转化能够提高植物耐盐性。本研究从抗盐大豆品种‘冀豆7号’中克隆得到液泡膜H~+-焦磷酸酶基因GmVP1,构建了GmVP1单价以及GmVP1与GmNHX1双价转化载体,利用发根农杆菌介导的大豆子叶转化体系验证其功能。结果表明,GmVP1在转录水平响应盐胁迫,GmVP1基因在一定条件下可以提高转基因大豆发状根对NaCl的耐受性,GmVP1/GmNHX1双价基因过表达比GmVP1单基因过表达更能提高大豆发状根相对生长量及其耐盐性。     

球形红细菌无机焦磷酸酶的原核表达、纯化及初步分析

无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase,PPase)水解在许多生物大分子的生物合成过程中产生焦磷酸并释放能量,形成的热力学拉力可促进合成反应的进行。球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides 2.4.1)无机焦磷酸酶(RsPPase)属于II型可溶性焦磷酸酶,钴离子对于其活性的维持具有重要的功能,而其活性调控及其表达对细菌生长的影响尚未报道。研究克隆、原核表达纯化RsPPase。结果发现,钴离子会导致谷胱甘肽S-转移酶(glutathione sulfotransferase,GST)标签不能进行蛋白酶切,且融合蛋白GST-PPase水解焦磷酸的催化效率较低(Km/kcat=2.0×104mol(/L.s));在球形红细菌胞内表达大肠杆菌焦磷酸酶(Km/kcat=5.5×107mol/(L.s))没有影响细菌的生长,暗示球形红细菌胞内PPase活性足够高。通过对其结构的模拟推测,在钴离子存在的情况下为闭合构象,GST标签的存在可能影响PPase羧基端结构域的运动,而影响其结合底物和释放产物的能力;在钴离子不存在的情况下为开放构象,GST标签具有较大的自由度,可暴露蛋白酶识别位点酶切产生无标签RsPPase。     

水稻rbcS启动子的克隆及其在转基因水稻中的特异性表达

为将高效特异的启动子用于转基因水稻研究,利用PCR技术从水稻‘中花11’基因组DNA中克隆了rbcS启动子,序列分析表明,扩增片段(2 746 bp)与已报道的该基因序列相应区域的同源性达99.2%。将rbcS启动子与GUS报告基因融合构建了由rbcS启动子引导GUS基因的植物表达载体,经农杆菌介导法导入到水稻中。对转基因水稻植株中GU S活性的定性与定量测定结果表明,rbcS启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片中的特异性表达,其表达水平高于C aMV 35S组成型启动子,而在转基因水稻植株根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出明显的组织特异性。     

拟南芥AVP2基因转化烟草中吸钾相关基因的转录分析

【目的】了解无机焦磷酸酶对植物钾吸收和相关基因表达的作用。【方法】反转录克隆拟南芥无机焦磷酸酶基因(H+-PPase)AVP2,构建植物表达载体,采用根癌农杆菌介导法将其导入烟草品种K326,经分子鉴定,提取转化烟苗幼根RNA,反转录后,应用荧光定量PCR分析外源基因AVP2和烟草钾通道基因NKT1、钾离子转运体基因NtHAK1、细胞质膜H+-ATPase基因NHA1、液泡膜H+-ATPase基因VAG1和液泡膜H+-PPase基因NVP1的mRNA转录水平,并测定转化烟草叶片的内在化学成分。【结果】获得了GUS染色和AVP2序列PCR扩增呈阳性的卡那霉素抗性转化烟草11株。经Southern杂交鉴定,证实AVP2基因已成功导入烟草,在转化烟草幼根中可以检测到外源基因AVP2的mRNA,证实该基因已整合到烟草基因组并成功表达;与未转化烟草相比,烟草钾离子转运体基因NtHAK1的转录水平显著增加,钾通道基因NKT1的转录稍有增加,而烟草液泡膜H+-ATPase基因VAG1和液泡膜H+-PPase基因NVP1的转录有所降低,烟草细胞质膜H+-ATPase基因NHA1无显著变化;转化烟草材料烟叶K+含量较对照显著增加,而烟碱、还原糖等其他内在化学成分无显著变化。【结论】无机焦磷酸酶基因参与植物的K+吸收。     

野大麦盐胁迫rbcS基因的克隆及序列分析(摘要)(英文)

[目的]研究野大麦盐胁迫rbcS基因的克隆及序列分析。[方法]以盐胁迫下的野大麦幼嫩叶片为试材,根据GenBank中小麦和大麦rbcS基因核酸序列的同源性设计引物,对野大麦基因组DNA进行PCR扩增、回收、连接、转化及测序。[结果]在野大麦的基因组中克隆了2个大小不同的rbcS基因序列rbcS1和rbcS2,长度分别为1252和908bp。rbcS1和rbcS2均由2个外显子和1个内含子组成,外显子长度相等,编码序列为525bp,同源性为96%,编码174个氨基酸;rbcS1和rbcS2内含子大小不同,分别为448和107bp。[结论]该研究为进一步探讨rbcS基因在野大麦耐盐机制中的分子机制奠定了基础。     

野大麦盐胁迫rbcS基因的克隆及序列分析

[目的]对野大麦盐胁迫rbcS基因进行克隆及序列分析。[方法]以盐胁迫下的野大麦幼嫩叶片为试材,根据GenBank中小麦和大麦rbcS基因核酸序列的同源性设计引物,对野大麦基因组DNA进行PCR扩增、回收、连接、转化及测序。[结果]在野大麦的基因组中克隆了2个大小不同的rbcS基因序列rbcS1和rbcS2,长度分别为1252和908bp。rbcS1和rbcS2均由2个外显子和1个内含子组成,外显子长度相等,编码序列为525bp,同源性为96%,编码174个氨基酸;rbcS1和rbcS2内含子大小不同,分别为448和107bp。[结论]为进一步探讨rbcS基因在野大麦耐盐机制中的分子机制奠定了基础。     

灵芝尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因 的电子克隆与生物信息学分析

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)是灵芝多糖合成途径的关键酶,用电子克隆方法得到灵芝UGPase基因,并利用生物信息学软件对UGPase基因编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、亲/疏水性、信号肽、蛋白结构域、蛋白高级结构以及系统进化树的构建等方面进行了预测和分析。结果表明:UGPase基因全长1691 bp,包含一个1515 bp的完整开放阅读框,编码504个氨基酸;该蛋白不存在信号肽和跨膜结构域,它是定位于细胞质内的一种亲水性稳定蛋白酶;它的高级结构主要是由α螺旋结构和无规则卷曲结构所组成;同源比对分析显示,该酶基因编码的氨基酸序列和其他动植物的UGPase酶相比在序列组成、高级结构方面具有一定的相似性。     

番茄脯氨酸脱氢酶基因的克隆与RNAi植物表达载体的构建

[目的]克隆了脯氨酸脱氢酶ProDH基因的全长cDNA,构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体,并转化到农杆菌.[方法]以“耐运2000番茄”幼苗为试材,根据GenBan中公布的番茄脯氨酸脱氢酶ProDH基因的序列信息设计了一对特异性引物,克隆了该基因的全长cDNA,分析基因序列选择正反向片段并扩增,并通过酶切、连接的方法构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体PBI121-PDHi利用冻融法将表达载体转化到农杆菌EHA105中.[结果]所克隆到的ProDH基因片段长2 001 bp,其中CDS为1 491 bp,编码380个氨基酸.测序结果与公布序列同源性100％,因此可以用来构建干扰载体;通过酶切与测序鉴定,证明表达载体构建成功.[结论]经特异性引物扩增检测,证明表达载体已转入农杆菌,为进一步的研究该基因奠定了基础.     

缺失GDD保守区的黄瓜花叶病毒复制酶基因的克隆及植物表达载体构建

以CMV亚组1株系Fny-CMV RNA2基因组为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到2.5 kb的全长复制酶基因扩增产物.对此产物进行纯化,并用NcoI和BspHI进行双酶切,得到3个片段,将不含有GDD保守区的2个片段用T4 DNA连接酶连接,并对连接产物进行PCR扩增,得到2.2kb左右缺失GDD保守区的黄瓜花叶病毒复制酶基因的扩增产物.将其克隆到pGEM-T Easy Vector上,进行序列测定,结果表明GDD保守区确已缺失.该缺失不导致开放阅读框架的移码将缺失GID保守区的基因定向克隆到植物表达载体pBI121中,并经三亲交配导入根癌农杆菌中,经PCR及酶切鉴定,证实质粒已被导入.     

2种启动子驱动下的VaCBF3基因植物表达载体构建

为了探索山葡萄CBF3基因(VaCBF3)对杨树的遗传转化的影响,及组成型启动子和诱导型启动子对转基因植株生长的影响,分别构建由2种类型启动子调控的植物表达载体.根据GenBank上公布的rd29A基因序列设计特异性引物,利用PCR方法从拟南芥基因组DNA中克隆rd29A基因启动子片段,利用限制性内切酶通过酶切、连接构建由组成型启动子35S和诱导型启动子rd29A基因启动子驱动的VaCBF3基因植物表达载体,利用冻融法完成重组质粒对根癌农杆菌LBA4404的转化.试验结果表明,所克隆的rd29A基因启动子片段序列分析表明该启动子片段长度为945bp,与GenBank中基因序列同源性达99％,具有DRE、ABRE、TATAbox和CAAT box4个完整的顺式作用元件,具有启动子功能.经过酶切、连接成功地将目的基因与载体质粒连接,并将重组质粒导入至根癌农杆菌LBA4404中,为下一步利用农杆菌介导法对杨树的遗传转化及研究2种启动子的启动效率奠定了一定的基础.     

胰蛋白酶抑制剂SKTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因SKTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的SKTI3基因序列同源性达99%。将目的基因片段插入到pB I121 35S启动子下,构建重组质粒pB ISKTI3,采用冻融法将该重组质粒转入农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。     

翅碱蓬脱水素基因克隆及表达载体构建

【目的】克隆翅碱蓬脱水素蛋白基因并构建其植物表达载体,为其耐盐性研究奠定基础。【方法】提取翅碱蓬总RNA,通过同源克隆和RACE方法分离获得翅碱蓬脱水素蛋白基因,并构建该基因的植物表达载体pBI121-DHN。【结果】克隆获得翅碱蓬脱水素蛋白基因的全长cDNA为847bp（GenBank序列编号：KC013239）,命名为SsDHN。序列分析结果表明,SsDHN全长cDNA中5＇-UTR为61bp,ORF为678bp,3＇-UTR为108bp且包含29bp的poly（A）尾巴,其起始密码子ATG位于62bp处,终止密码子TAA位于737bp处,编码225个氨基酸。氨基酸比对结果表明,该基因推导的氨基酸与已知其他植物DHN基因序列有35%～48%的相似性。聚类分析结果显示,翅碱蓬（SsDHN）与拟南芥和荠菜DHN亲缘关系较近,与咖啡、杜鹃花的亲缘关系较远。【结论】成功克隆了翅碱蓬脱水素基因,并构建了其表达载体,可用于翅碱蓬抗盐的遗传改良。     

玉米淀粉分支酶sbe Ⅱ b基因启动子的克隆与特异表达

[目的]构建玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。[方法]LA-PCR扩增了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子序列,并克隆到pMD18-TVector上。再将启动子克隆到pBI121载体上,构建植物表达载体pBI121-sbeⅡb。把GUS基因连到pBI121-sbeⅡb上构建pSBE-GUS后利用农杆菌介导法转化烟草。分别进行PCR和Southern杂交检测,并对经基因枪轰击和农杆菌介导的烟草种子、根、茎及叶进行GUS组织化学分析和荧光检测。[结果]测序结果与GenBank中发表的玉米sbeⅡb基因启动子同源性达98.52%。共培养和筛选培养后获得4株转pSBE-GUS植株,叶片仅有少量蓝斑出现,而根和茎部未见蓝斑,但烟草种子有大量蓝斑显出,初步推断sbeⅡb基因启动子能启动GUS在种子中特异表达。[结论]成功构建了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。     

大豆胰蛋白酶抑制剂KSTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因KSTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的KSTI3基因序列同源性达99%。将反义 正义基因片段插入到pBI121 35S启动子下,构建重组质粒pBIKSTI3。通过冻融法将该重组质粒转入根癌农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。