甘蔗△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（P5CS）的克隆及其表达分析

△~1-吡咯琳-5-羧酸合成酶是植物脯氨酸合成过程的关键酶.应用同源性克隆结合RACE技术获得甘蔗PSCS基因cDNA全长序列2714bp,其中5'端非编码区为226bp,3'端非编码区340bp,poly(A)上游有1个聚腺苷酸五碱基AATAAA;开放读码框为2 148 bp编码715个氨基酸,含双功能域;其编码的蛋白分子量为77.7 ku,等电点为6.47.序列比对分析结果表明,P5CS基因的4个主要功能区(domain)中亮氨酸功能区(Leucine domain)相对不保守,其它功能区均较为保守.对17个物种的P5CS基因进行聚类分析,结果与公认的生物学分类及进化关系吻合.对甘蔗P5CS在根、茎、叶的表达进行实时PCR分析,结果表明,该基因在茎、叶表达量相近,但在根的表达量极低.     

香蕉MaTET基因的克隆与表达分析

采用RACE技术克隆香蕉果实采后成熟相关基因MaTET的全长cDNA,利用生物信息学方法分析MaTET基因及推导蛋白的序列,再利用RT-PCR技术对该基因的组织器官表达特性和在果实采后成熟过程中的表达特性进行分析。结果表明,MaTET的cDNA序列全长为1 234 bp,包含一个852 bp的完整开放阅读框,编码283个氨基酸残基,5′端非编码区222 bp,3′端非编码区160 bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TAG。MaTET蛋白具4个跨膜区域,属于四跨膜蛋白（Tetraspanins）,拥有多个与信号传导有关的修饰位点,在系统发生上更接近鹰嘴豆、野草莓和番茄等双子叶植物。MaTET可在香蕉根、茎、叶、花以及果实中表达,在根和叶中的表达量高于其它器官;MaTET在自然成熟香蕉果实中的微黄(TY)阶段开始上调表达,在黄多于绿(MY)阶段表达量急遽升高,随后降低,乙烯可增强MaTET表达且表达高峰提前至绿多于黄(MG)阶段,1-MCP抑制MaTET的表达。     

秋石斛‘三亚阳光’Actin 的克隆与表达模式分析

本研究克隆了秋石斛‘三亚阳光’（Dendrobium ‘Sonia Hiasakul’）肌动蛋白基因（DenActin）cDNA 全长序列, 并进行了 DenActin 进化地位和表达模式的分析。通过克隆获得的 DenActin cDNA 序列的全长为 1 596 bp,其中开放阅 读框为 1 134 bp,编码 377 个氨基酸,同时通过 gDNA 克隆获得了 DenActin 3′端的一段包含一个内含子的 403 bp 的片 段。序列同源性分析发现该基因序列与 GenBank 中注册的其他植物 Actin 核苷酸序列的同源性均在 85%以上,氨基酸 序列的同源性高达 97%以上。通过最大似然法构建其系统进化树,分析发现 DenActin 与黄石斛 Actin 的亲缘关系最为 密切,并与其他兰科植物归为一大类。半定量 PCR 分析表明,DenActin 在幼苗叶片和中苗茎尖、根、叶片以及成熟植 株的茎、根、叶片、花柄、1 mm 花苞、3 mm 花苞、5 mm 花苞、9 mm 花苞中均稳定表达。秋石斛 DenActin 的克隆和 表达模式分析为秋石斛功能基因的表达分析提供了候选的内参基因,而 3′端包含内含子的 gDNA 片段的克隆为避免实 时定量分析中的 gDNA 污染提供了引物设计的便利。     

苎麻纤维素合成酶基因BnCesA4 cDNA序列的克隆与表达分析

利用本地BLAST工具,从先期获得的苎麻转录组数据中发掘出与多种植物纤维素合成酶基因有较高同源性的序列CL6473.以苎麻（Boehmeria nivea）栽培种湘苎3号为材料,根据CL6473设计引物,先采用PCR扩增克隆了苎麻一个纤维素合成酶基因cDNA的核心片段,再运用5′及3′RACE获得该基因全长cDNA,序列分析表明该cDNA为一个新的苎麻纤维素合成酶基因cDNA,命名为BnCesA4.BnCesA4cDNA序列全长4008bp,其中编码区全长3270bp,编码一个含1090aa的多肽,具有植物纤维素酶的保守结构域及特征氨基酸序列.根据该cDNA高可变区序列设计其特异性引物,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对BnCesA4基因在几个代表性苎麻品种：湘苎3号、湘苎1号、湘潭大叶白及城步青麻的木质部和韧皮部两种组织中的表达情况进行了定量分析.qRT-PCR显示BnCesA4基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部均有表达,表达量差异不大.     

茶树类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因的克隆和表达分析

以茶树叶片为材料,结合同源克隆方法和RACE技术,克隆了1条UFGT基因,命名为CsUFGT。该基因cDNA全长为1526bp,ORF长1380bp,编码459个氨基酸,推测等电点5.96,推测分子量为49.486kDa。该基因编码的蛋白质与葡萄UFGT（P51094.2）的一致性为59%,相似性为75%,其C-端含有植物UGT家族成员特有PSPG基序。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在茶树根茎叶中均表达,在第4叶表达量最高,根和茎中表达量较低。     

油菜种子含油量相关的脂肪酶基因BnSDP1克隆与表达分析

通过电子延伸和RACE (cDNA末端快速扩增) 克隆得到一个与油菜种子含油量相关的脂肪酶基因,命名为BnSDP1,其开放阅读框为2 472bp,编码分子量为92kD的蛋白,预测等电点为6.75,具有保守的patatin结构域,跨膜域位于N端和中间,序列分析显示BnSDP1拥有GXSXG脂肪酶的基本特征序列GSSVG。利用RT-PCR技术分析发现,在种子发育的成熟期（即脱水期）,BnSDP1在低油品系种子中的转录水平高于高油品系,在根、茎、叶、花中均有表达,但在根和叶片中表达量高,在根中尤其显著,且受蔗糖诱导上调表达。     

青稞4-香豆酸辅酶A连接酶基因4CL的克隆及表达分析

为了进一步了解4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase;4CL)基因在黄酮合成中的作用,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得了青稞4CL基因(Hv4CL)的cDNA全长序列,并利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术,对该基因在青稞4个胚乳发育时间段茎、叶和花中的表达情况进行研究。结果表明,Hv4CL基因cDNA序列全长2 107bp,该序列包含一个完整的开放阅读框(ORF,1 662bp),编码553个氨基酸。Hv4CL与小麦同源性最高(96%),且该蛋白序列中包含2个保守的box,即AMP结合盒:boxⅠ(SSGTTGLPKGV)和boxⅡ(GEICIRG)。qRT-PCR分析结果表明:4CL基因在青稞不同发育时期、不同组织的表达丰度不同,在茎中表达量最高,其次是叶和籽粒。     

菜心 BclUBE2 基因的克隆与表达分析

采用同源克隆法从菜心中获得 cDNA 全长 459 bp 的 E2 基因,命名为 BclUBE2。该基因编码 153 个氨基酸,分子量为 17.24 ku,理论等电点为 5.37,为亲水性非分泌蛋白。结构分析显示,该蛋白含有一个泛素结合酶E2 活性位点、一个 WD 重复序列和一个高度保守的半胱氨酸。进化分析发现,菜心 BclUBE2 蛋白与芸薹属芜菁和油菜的亲缘关系较近。qRT-PCR 分析表明,菜心 BclUBE2 基因在根、茎、叶、叶柄中均有表达,且表达丰度和变化趋势不同。在低温胁迫下,根中的表达量呈现先降低后升高的变化趋势,且在处理 1 h 时表达量最低;在茎、叶、叶柄中均呈现先升高后降低的表达趋势,茎和叶柄处理 6 h 时的表达量最高,叶片处理 1 h 时的表达量最高。说明菜心 BclUBE2 基因在响应低温胁迫中发挥作用。     

橡胶树AtCAB1同源基因的克隆及其在稳定与衰老期叶片中的差异分析

以一编码蛋白与拟南芥的CAB1高度相似的EST序列作为探针,通过同源搜索从橡胶树的转录组数据中电子克隆到一条长1 415 bp的cDNA,该序列包含一798 bp的ORF及47 bp的5′UTR和570 bp的3′UTR,命名为HbCAB1;在此基础上,采用PCR技术成功扩增了包括该ORF在内的915 bp的cDNA序列。序列分析表明,该基因预测编码265个氨基酸,理论分子量为28.15 ku,等电点为5.25;蛋白含有1个保守的捕光叶绿素a/b结合蛋白结构域,3个跨膜螺旋和1个C端螺旋,1个三聚化基序,     

花生中UDP-glucosyltransferase基因的克隆及在非生物胁迫下的表达研究

通过RACE技术从花生叶片cDNA中克隆到了UDP-glucosyltransferase基因,命名为AhUGT83A1-like （Genbank注册号为KF411463）。该基因全长为1 530bp,ORF为1 380bp,编码460个氨基酸。序列比对与进化分析结果表明,该序列有保守的UDPGT结构域,并且与其它植物的UGT蛋白同源性较高。荧光定量PCR结果表明,AhUGT83A1-like基因在高盐和低温处理的花生根和叶片中均上调表达;在干旱处理时,根中表达也受到显著上调,但叶片中表达量则有明显下降。以上结果表明AhUGT83A1-like可能参与了花生对干旱、低温和高盐的抗性调控。ABA处理结果表明,AhUGT83A1-like在花生根中对ABA响应明显,但在叶片中对ABA没有明显响应,表明该基因在花生根中对非生物胁迫的调控可能是以依赖ABA的方式发挥作用的。?     

番木瓜果肉果胶裂解酶基因克隆及反义植物表达载体的构建

采用cDNA末端快速扩增方法.获得了番木瓜果肉果胶裂解酶(Pectate lyase,PL)基因的完整3′端和部分5′端序列.然后,根据本实验室已经获得的PL基因5′端DNA序列及笔者得到的3′端序列设计上、下游引物,以番木瓜基因组DNA为模板扩增得到PL基因的开放性阅读框.该序列编码385个氨基酸,与草莓、桃、芒果、拟南芥氨基酸序列的同源性分别为83.38%、75.76%、73.68%、65.96%.根据PL基因设计特异引物,扩增其保守区片段,将其反向插入pBI 121的CaMV 35 S启动子和Nos终止子之间,成功构建反义植物表达载体pBP,并导入到根癌农杆菌EHA 105中.     

茶树八氢番茄红素脱氢酶cDNA全长克隆与表达分析

八氢番茄红素脱氢酶是类胡萝卜素生物合成途径的关键酶之一。本实验采用3’/5’RACE和RTPCR技术成功扩增出茶树八氢番茄红素脱氢酶基因（PDS）的3’端和5’端序列,序列拼接获得全长cDNA序列,命名为CsPDS,并将其登录至GenBank,登录号KF646537。经生物信息学分析,所得基因cDNA序列全长为2295 bp,开放阅读框（ORF）1749 bp,编码582个氨基酸,预测分子量约为64.86 kDa,理论等电点（PI）为6.77,属于亲水性蛋白。该基因编码的氨基酸序列与柿树PDS序列的同源性达到87%,多序列比对表明茶树PDS具有高度保守区域,基于邻接法的进化树显示与柿树、葡萄的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果显示,CsPDS在‘黄金芽’体内表达没有受抑制,表明‘黄金芽’黄色白化可能不是在CsPDS基因转录水平异常而引起。     

红海榄脱水素基因(RsDHN1)的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术对已获得的红海榄根部其中一个差异表达基因进行克隆,通过Blast分析和序列比对可知,该基因全长cDNA序列包括146bp的5'端非编码区,43bp的3'端非编码区和一个编码241个氨基酸的开放阅读框,命名为RsDHN1基因。该cDNA编码的蛋白具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于SKn类脱水素蛋白,与其它植物的SKn类脱水素蛋白具有43%～55%的氨基酸序列同源性。半定量RT-PCR分析表明,盐胁迫对RsDHN1基因的表达有明显上调作用。     

荆州黑麦 NPR1同源基因 ScNPR1的克隆与特性分析

为了明确荆州黑麦ScNPR1基因的功能,对荆州黑麦 NPR1同源基因ScNPR1进行克隆并分析了其表达特性。利用同源序列法和RACE技术从荆州黑麦中克隆得到 NPR1同源基因的3 185 bp全长cDNA序列,该基因包含了一个编码507个氨基酸(1 524 bp)的开放阅读框、终止密码子TGA、5′端1 517 bp的非编码区和3′端144 bp的非编码区,命名为ScNPR1。利用生物信息学软件对其结构进行分析,ScNPR1编码的氨基酸序列与已知的小麦、水稻 NPR1基因编码的氨基酸序列具较高的同源性,分别达到92.4%和90.3%。荧光定量PCR发现,ScNPR1基因在小麦不同器官中均有表达,在叶、茎、根中表达较高;ScNPR1基因在植物抗病相关信号分子水杨酸、茉莉酸和乙烯处理后上调表达,在白粉病菌、纹枯病菌和赤霉病菌的诱导下,ScNPR1基因也上调表达。研究结果表明,ScNPR1基因与水杨酸和乙烯信号转导途径有关,参与寄主对病原菌侵染的防御反应。     

玳玳花瓣脂氢过氧化物裂解酶基因cDNA的克隆及原核表达

以玳玳花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术,克隆了玳玳HPL基因cDNA全长,全长为1 776 bp,其中包含52 bp的5′非编码区,224 bp的3′非编码区,1 500 bp的编码区(编码499个氨基酸,分子量为55.7 ku)。将该HPL基因cDNA编码区的核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与其他植物的HPL基因cDNA序列进行比较,推断玳玳花瓣HPL属于13-HPL类。通过PCR扩增得到了玳玳HPL基因组全长。测序结果显示玳玳HPL基因中包含1个长2 374 bp的内含子。将分离出来的玳玳HPL基因cDNA的编码区序列插入pET-15b载体上构建原核表达载体,在细菌BL21细胞中进行原核表达。结果表明:该编码区片段可在原核细胞中大量表达,其表达产物分子量大小约为55 ku,与13-HPL蛋白的分子量55.7 ku相符。本研究为下一步利用HPL基因cDNA进行遗传转化研究奠定基础,将为花卉香味的遗传改良提供一条新途径。     

巴西橡胶树一个新的法尼基焦磷酸合酶基因的克隆及表达分析

利用同源克隆的方法在橡胶树中获得一个新的法尼基焦磷酸合酶基因,命名为Hb FPS2。序列分析显示,Hb FPS2基因组序列长4 171 bp,由12个外显子和11个内含子组成,c DNA全长1 288 bp,包含1 029 bp的开放阅读框、105 bp的5′-UTR和154 bp的3′-UTR,编码342个氨基酸,推测分子量为39.6 ku,等电点为5.27。氨基酸序列比对显示,Hb FPS2具有FPS家族保守的5个结构域。进化分析结果表明,Hb FPS2和Hb FPS1亲缘关系最近,与大戟科的蓖麻、大戟、麻风树法尼基焦磷酸合酶聚为一个亚类。定量PCR结果表明,Hb FPS2在橡胶树根、树皮、叶、花和胶乳等组织中均有表达,在花和胶乳中表达量较高,在根中表达量最低;茉莉酸和乙烯处理均能提高Hb FPS2基因的表达量,处理9 h时基因表达量分别提高了36倍和8倍。结果为分析法尼基焦磷酸合酶基因表达特性及其在天然橡胶生物合成途径中的作用机制奠定基础。     

茶树巯基蛋白酶抑制剂基因的cDNA克隆与序列分析

对多种已知植物巯基蛋白酶抑制剂(cystatin)基因的氨基酸序列进行比对分析,根据其高度保守的氨基酸序列设计一对简并引物,并从茶树品种龙井43鲜叶中提取总RNA,用RT-PCR法扩增出一204bp的cDNA特异片段,然后通过3’/5’RACE的方法,分别扩增出3’端和5’端的序列,从而获得茶树巯基蛋白酶抑制剂基因的cDNA全长序列,所得序列全长627bp,编码101个氨基酸,分子量约11.062KDa。该基因在推测的氨基酸序列中含有巯基蛋白酶抑制剂家族中高度保守的、与其活性有关的QXVXG结构,且经Blast分析表明,该基因序列与其他植物巯基蛋白酶抑制剂基因的氨基酸序列同源性为54%~77%。     

番茄中一个F-box/FBA基因的表达分析及载体构建

通过生物信息学分析从番茄基因数据库中筛选出一条全长cDNA序列,命名为SlFbf（GenBank登录号:AK326236.1）。通过设计特异引物克隆该基因。SlFbf全长1 464 bp,编码381个氨基酸,N端含有F-box结构域,C端含有FBA₁结构域,在基因组序列中无内含子。半定量及定量RT-PCR分析结果表明,该基因在番茄的根、茎、叶、花蕾、花、青果、黄果及红果中均有表达,且在开花当天的雄蕊中表达最强,推测该基因在雄蕊发育中起着重要作用。同时构建了番茄SlFbf基因的正、反义植物表达载体,为深入研究该基因功能奠定了基础。     

橡胶树α-维管蛋白基因HbTUA1的克隆及表达分析

利用橡胶树胶乳EST文库克隆到一个TUA基因,命名为HbTUA1（GenBank登录号：KC333454）。该基因cDNA全长1 580 bp,其中5′UTR长45 bp,3′UTR长167 bp,编码区长1 368 bp,编码449个氨基酸。HbTUA1蛋白具有TUA类蛋白保守的GTP结合域。荧光定量PCR分析显示,HbTUA1基因在橡胶树胶乳中的表达量最高,其次是树皮和芽,而在种子和叶片中的表达量最低;在胶乳中,HbTUA1基因的表达显著受割胶和伤害诱导,在不同死皮程度的橡胶树中也存在明显差异。初步表明HbTUA1基因可能参与橡胶树胶乳再生与胁迫应答调控。     

玉米ZmCPB1基因的克隆、表达及生物信息学分析

从玉米中克隆ZmCPB1基因的cDNA序列,全长1 446 bp,编码481个氨基酸,蛋白质理论分子量为54.05 KD,等电点为8.59。生物信息学分析表明,ZmCPB1蛋白N端有跨膜结构,是跨膜蛋白。蛋白质二级结构含有48.44%的α-螺旋、4.99%的β-转角、10.60%的延伸链以及35.97%的无规则卷曲,该蛋白定位于内质网中。序列比对结果显示,ZmCPB1蛋白含有与子粒发育相关的保守区VKFVHRKALK。系统进化树分析表明,该蛋白与高粱、谷子、水稻和大麦的同源蛋白亲缘关系最近,同属一个亚支。实时荧光定量PCR分析ZmCPB1基因的表达模式,结果表明,ZmCPB1基因在3叶期的根、茎、叶以及雄穗和苞叶中表达量较低,在雌穗中的表达量较高。在玉米子粒发育的不同时期,ZmCPB1基因的表达量呈现一定的规律变化,在授粉后0～10 d,表达量逐渐达到最高峰,之后开始下降,在授粉15 d后降到较低水平。初步判断ZmCPB1基因与玉米子粒早中期发育有关。