橡胶树叶片转化酶提取方法的比较

比较液氮研磨样品与蛋白抽提液研磨样品对6种提取橡胶树叶片转化酶方法的效果。结果表明：液氮研磨法对转化酶活性影响很大，特别是中性/碱性转化酶和细胞壁结合的酸性转化酶已基本失活，而可溶性酸性转化酶活性丧失也比较严重。利用蛋白抽提液研磨样品，用Hepes-NaOH法提取的可溶性转化酶的酶活性最高，达472.44 μmol（glucose）/[g（FW）·h]； 虽然磷酸-柠檬酸法获得的粗酶液的蛋白含量较低， 但其酶活性高达441.61 μmol（glucose）/[g（FW）·h]； Tris-HCl法提取的细胞壁结合酸性转化酶的酶活性最高， 达35.83 μmol（glucose）/[g（FW）·h]。从转化酶的比活力看，磷酸-柠檬酸法最佳，所提取的可溶性转化酶比活力约为Hepes-NaOH法的4倍。本研究结果为进一步完善橡胶树叶片转化酶的提取方法提供重要的指导意义。     

橡胶树PGAM基因的克隆及表达特性分析

从橡胶树中克隆并获得磷酸甘油酸变位酶基因（HbPGAM），该基因的cDNA序列全长1 559 bp，包含长度为1 260 bp的完整开放阅读框，编码一个由419个氨基酸残基组成的蛋白，氨基酸同源性分析发现，该蛋白含有保守的磷酸变构酶组氨酸磷酸酶结构域，属于磷酸甘油酸变位酶。生物信息学分析显示，HbPGAM蛋白无导肽酶切位点，不具有跨膜结构域且为亲水蛋白，该蛋白可能在细胞质中发挥作用。实时荧光定量PCR分析表明，HbPGAM基因在分析的7种组织中均表达，但在胶乳（产胶细胞乳管的细胞质）中的表达水平最高，且该基因在胶乳中的表达受割胶影响，推测其参与橡胶树胶乳再生过程。此外，HbPGAM基因表达受部分植物激素如乙烯利ET、植物生长素2,4-D及水杨酸SA调控，但调控不明显。结果说明，胶乳再生过程中HbPGAM对胶乳糖酵解起到一定的调控作用，为全面了解橡胶树PGAM家族奠定理论基础。     

木霉菌对橡胶树褐根病菌的拮抗作用

探讨9个木霉菌株的生长与产孢特性,并通过对峙培养法,测定了9个木霉菌菌株对橡胶树褐根病菌的拮抗作用。结果表明,HCS、DJ1和ACCC31757生长速度最快,平均生长速度在4.5cm·d-1以上,ACCC30536平均生长速度最慢,只有1.5cm·d-1;9株木霉菌对橡胶树褐根病菌的拮抗作用差异较大,其中有3株木霉菌对橡胶树褐根病病原菌具有显著的拮抗作用,在第8d,ACCC31642和HCS对褐根病病原菌的抑制率达到100%,ACCC31639对褐根病病原菌的抑制率达到93.33%。     

巴西橡胶树中碱性转化酶HbNINa基因的克隆和表达模式分析

检索橡胶树EST和基因组数据库,发现了1个在叶片中高丰度表达的中碱性转化酶基因.采用RT-PCR和RACE技术获得了该基因的cDNA和基因组序列,命名为Hb NINa.序列分析结果显示,HbNINa基因cDNA序列的编码区(CDS)序列长度为1 719 bp,对应的基因组序列为3 696 bp.序列分析表明,该基因编码571个氨基酸多肽,推测其分子量大小为65.7 ku,等电点为6.36.HbNINa蛋白包含植物中碱性转化酶的全部保守结构域.基因组结构分析显示Hb NINa基因包含4个外显子和3个内含子.QPCR分析结果表明,HbNINa基因在在胶乳中表达水平极低,而在其他组织如树皮、树叶和雌花中的表达丰度相对较高.在叶片发育过程中,Hb NINa在叶片发育的初期高丰度表达,推测HbNINa可能参与叶片蔗糖利用,进而在橡胶树叶片发育过程中起重要作用.     

橡胶树3个品系产排胶特性季节变化的比较

以S/2 d3割制,对3个品系(热研8-79、热研7-33-97、PR107)的幼龄开割树割胶,分析和比较株次产量、胶乳转化酶活性、pH值、蔗糖和总固形物含量的季节变化.结果表明:几乎所有割胶季节,热研8-79的株次产量、胶乳转化酶活性、pH值都明显高于热研7-33-97和PR107,蔗糖含量依次为热研8-79＜热研7-33-97＜PR107,总固形物含量3个品系差异很小,显示热研8-79乳管蔗糖利用率较高,胶乳再生能力较强的品系特性,而PR107则相反.3个品系均分别在5月、7～8月、10～11月形成产量高峰,但不同品系同次产量高峰的时间跨度有很大差异.3个品系在4月中旬至5月上旬株次产量、转化酶活性、pH值、蔗糖含量均呈递增趋势变化,总固形物含量呈递减趋势变化,显示胶树胶乳再生作用逐渐增强,排胶越来越顺畅的变化过程.在其它季节,株次产量、胶乳转化酶活性和生理参数的变化比较复杂,并且经常不同步,显示株次产量受多种因素的综合影响,该结果可为适宜割胶制度的制定提供参考.     

HbNIN2基因在巴西橡胶树嫩皮和中脉中的RNA原位杂交分析

在橡胶树（Hevea brasiliensis）中,转化酶基因HbNIN2被证明是决定产胶细胞乳管中蔗糖代谢的关键基因,同时在叶片、树皮等多种组织中均有表达。为进一步研究HbNIN2基因的功能,利用原位杂交（in situ hybridization）技术对HbNIN2基因在橡胶树嫩皮和中脉两种组织中的表达区域与表达特点进行研究。结果显示,在橡胶树嫩皮中,HbNIN2基因主要在韧皮部中表达,而在中脉中,HbNIN2基因在除木质部外的其它部位均有表达,同时在两种组织的乳管细胞中HbNIN2基因均有明显的表达信号。比较而言,HbNIN2基因在中脉中的表达量远高于嫩皮。结合其它研究结果,推测HbNIN2基因可能参与橡胶树乳管蔗糖代谢、叶片生长发育调控等。     

8株木霉菌对橡胶树红根病的拮抗作用

木霉菌具有抑制植物病原真菌生长的能力,因而成为开发土传根部病害生防菌的首选之一。利用对峙培养法,测定8个木霉菌菌株对3个橡胶树红根病病原真菌的体外拮抗作用,并对筛选出来的木霉菌进行相互间的对峙培养分析。结果表明:有6个木霉菌对3个红根病病原菌具有显著拮抗效果;所选出的6个木霉菌之间尽管多数可以共存,但存在空间和营养竞争,尤其是棘孢木霉,很容易被其它木霉菌抑制和侵占,因此,在今后使用时不适宜混配。该实验结果可为进一步筛选和利用生防菌防治橡胶树根部病害提供理论依据。     

巴西橡胶树钙调蛋白基因的克隆和表达分析

以拟南芥和杨树的钙调蛋白氨基酸序列为探针,对橡胶树转录组数据库进行搜索,并设计引物进行PCR扩增,得到7个橡胶树钙调蛋白基因的cDNA序列,命名为HbCaM1-7。序列分析结果发现,HbCaM1-7的CDS序列均为450 bp,编码149个氨基酸,分子量为16.8 ku,等电点为3.95。其中,HbCaM1-6间氨基酸同源性为100%,HbCaM7与其他成员之间的氨基酸同源性为98%。在基因结构组织方面,HbCaM1-7均为一个内含子,且内含子的插入位置相同,但内含子的长度明显不同。从氨基酸序列同源性和进化关系分析结果可看出,钙调蛋白基因家族在进化上非常保守。在表达方面,HbCaM1-6在各组织中均有表达,除了HbCaM3在根中表达丰度相对较高,其他成员均在胶乳中表达丰度相对较高,而HbCaM7在各组织中的表达均比较低;乙烯利处理后,HbCaM2-7的表达均有一定的上升趋势,而在叶片发育过程中HbCaM1-5圴呈明显下调表达。由此可见,橡胶树钙调蛋白与橡胶树叶片发育、胶乳乙烯信号通路具有一定的相关性。     

巴西橡胶树葡萄糖/核糖醇脱氢酶基因的克隆和表达分析

割胶显著刺激新开割橡胶树胶乳产量,前期的比较蛋白质组学的研究中,已通过双向电泳的方法分离到一个随割胶下调的葡萄糖/核糖醇脱氢酶(GRDH,glucose/ribitol dehydrogenase)。通过搜索本实验室的橡胶树EST数据库和PCR扩增得到该蛋白点对应的全长c DNA序列并命名为Hb GRDH1。序列分析显示,c DNA的编码序列(CDS)为882 bp,推测编码294个aa,分子量大小为32.2 ku,等电点为5.18,基因组序列包含4个外显子和3个内含子。通过Realtime PCR和Solexa高通量转录组测序分析发现,Hb GRDH1主要在胶乳和雌花中表达,在叶片发育稳定期呈现明显的下调表达趋势;在新开割树胶乳中,前4刀该基因表达变化不明显,而第5刀开始呈现上调表达趋势;在胶乳中,乙烯利处理对该基因表达前12 h无明显影响,在24 h时呈明显的下调表达。本研究结果有助于进一步阐明橡胶树中Hb GRDH1基因的功能,特别是其参与橡胶树胶乳再生调控的分子机理。     

巴西橡胶树膜联蛋白基因家族成员的鉴定和表达分析

膜联蛋白是一个多基因家族,在植物逆境胁迫应答和生长发育等方面起重要作用。本研究以已发表的膜联蛋白氨基酸序列为探针,对橡胶树和其他5种植物的转录组和基因组进行搜索,鉴定得到14个橡胶树膜联蛋白基因家族成员,命名为Ann Hb1-Ann Hb14。基因结构分析发现,14个家族成员的内含子数目为3~6个,结构域的数目为2~4个。在进化上,橡胶树、木薯和蓖麻共3种大戟科植物的膜联蛋白具有较近的亲缘关系。表达方面,Ann Hb1在各组织中普遍表达,而Ann Hb6和Ann Hb7主要在胶乳中表达,Ann Hb10、Ann Hb8和Ann Hb13分别在树叶、树皮和雄花中特异表达,其他成员在各组织中低丰度表达或不表达;部分家族成员的表达还与叶片发育、乙烯利刺激、真菌侵染和低温胁迫等具有一定相关性。