固氮施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501同化硝酸盐代谢基因簇分布及调控研究

固氮施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501在有氧条件下能够利用硝酸盐/亚硝酸盐为唯一氮源生长,表明该菌除了具有固氮和反硝化等氮循环系统外还有同化硝酸盐/亚硝酸盐系统。为进一步阐明该菌同化硝酸盐的代谢机制,利用生物信息学手段分析了硝酸盐同化相关基因的组成及分布情况,并初步研究了同化硝酸盐途径特异性调控关系。结果表明, P. stutzeri A1501中存在两个硝酸盐同化基因簇nasST-nasA-nirBDnasBcobA和nasR-nasFED,分布于基因组不同部位。第一个基因簇中nasS-nasT编码二元抗转录终止因子,nasA编码NarK/NasA家族硝酸盐转运蛋白,nirBD编码亚硝酸盐还原酶,nasB编码同化硝酸盐还原酶,cobA编码参与西罗血红素合成的尿卟啉-Ⅲ C-甲基转移酶;第二个基因簇中nasR编码单一组分抗转录终止因子,nasFED编码ABC型（ATP依赖）硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白。NasS-NasT双组分蛋白调控硝酸盐/亚硝酸盐还原酶基因的转录,NasR调控硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白基因的转录。     

溶藻弧菌TolB蛋白的生物信息学分析

对溶藻弧菌转运蛋白(TolB)进行结构和功能进行分析,设计其表位多肽重组疫苗,以提高溶藻弧菌TolB蛋白的免疫效果,运用生物信息学方法对溶藻弧菌TolB蛋白的系统进化关系、理化性质、高级结构和细胞抗原表位进行分析。进化关系结果显示,溶藻弧菌的TolB蛋白与副溶血性弧菌、霍乱弧菌和费氏弧菌的TolB蛋白具有较高同源性,溶藻弧菌TolB蛋白可能对这4种菌株的感染起到交叉免疫保护作用。溶藻弧菌TolB蛋白为亲水性蛋白,1—22位氨基酸为其信号肽位置,无跨膜结构并定位于细胞膜外;溶藻弧菌TolB蛋白二级结构中以无规则卷曲(40.00%)、α-螺旋(18.67%)和β-转角(11.33%)为主。溶藻弧菌TolB蛋白可能存在4个优势B细胞抗原表位,1个细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗原表位,1个辅助T细胞(Th)抗原表位,并重组拼接获得抗原性较好的TolB蛋白表位多肽。     

水生动物病原菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)及其溶血素共调节蛋白研究进展

Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system, T6SS)是多种革兰氏阴性菌编码的蛋白分泌装置,在毒力因子释放、生物被膜形成、铁离子摄取、囊泡运输、环境压力适应性及细菌胞内存活等方面发挥着重要功能,在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)等水生动物病原菌的致病过程中发挥着关键作用。然而,有关水生动物病原菌T6SS组分及其功能的报道还比较匮乏。本文对几种水生动物病原菌T6SS的生物学功能与调控机理,以及T6SS关键调控因子溶血素共调节蛋白Hcp的系统进化关系与功能等最新研究情况进行了综述,并在水生动物病原菌T6SS的生物学功能、T6SS活性调控与环境因素的关联性、T6SS与致病菌代谢之间的调控关系等方面提出未来研究建议,以期为进一步开展水生动物致病机制研究及水产养殖细菌病的防控提供新思路。     

一种新型抗菌肽基因决定簇的克隆与序列结构特征

侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)S62-9菌株产生的抗菌肽BBL属于非核糖体合成肽,其生物合成涉及到一系列相关基因。为了获得完整的抗菌肽BBL基因决定簇,本研究基于部分已知的NRPS-A结构域基因序列,以S62-9菌株质粒DNA为模板,采用TAIL-PCR技术对NRPS-A结构域的上游进行扩增,得到一个大小为2.74kb的序列,该序列包含NRPS-A的5′末端序列、pp-binding序列以及1个ABC转运蛋白基因。该序列进一步与已知序列进行序列拼接及软件分析比对,最终获得一个大小为22.2kb的基因簇,该基因簇包含13个Bbl功能结构域,根据功能该基因簇分为3类功能相关基因:一类是编码转运相关蛋白,BblE包含3个ABC转运蛋白,负责抗菌肽向胞外渗透运输;二是催化短肽合成基因,Bbl F包含了pp-binding结构域和NRPS-A结构域,与氨基酸的装载和缩合有关,负责短肽的合成;三是肽链修饰相关基因,Bbl D、Bbl E、Bbl M、Bbl K等基因负责肽的修饰。     

生防细菌K2-1抗菌蛋白纯化及其拮抗水产病原菌分析（英文）

[目的]纯化源自生防细菌K2-1的抗菌蛋白并进行抗菌蛋白于体外对主要水产病原菌的拮抗分析。[方法]利用硫酸铵沉淀,而后透析,获得抗菌蛋白粗品,应用凝胶色谱结合水浴,进一步对抗菌蛋白粗品进行纯化;采用琼脂扩散法,进行抗菌蛋白体外拮抗溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌及鳗弧菌实验,分析其抗菌活性。[结果]应用上述分离纯化方法,获得色谱纯的抗菌蛋白APK2,过程回收率为0.08%,拮抗实验表明,该抗菌蛋白对多数应试病原菌具有较强的抑制作用。[结论]抗菌蛋白APK2有可能作为化学抗生素的替代品,用于水产细菌病的绿色防治。     

产胞外多糖乳酸菌的选育

为了筛选高产胞外多糖的乳酸菌,从酸奶、奶酪中通过富集和分离得到7株乳酸菌,以菌落拉丝实验为初筛指标和苯酚-硫酸法测胞外多糖产量的复筛方法得到1株高产胞外多糖乳酸菌的优良菌株YL2。并且对YL2菌株进行培养特征、个体形态特征和生理生化鉴定试验,初步确定YL2为乳杆菌属(Lactobacillus),其胞外多糖的产量为430.0mg/L。     

水稻白叶枯病菌rpfC基因DNA序列的测定分析

ｒｐｆｃ是甘蓝黑腐病菌中全局性调控胞外酶和胞外多糖合成以及致病性的一个基因簇中的一个基因。已从水稻白叶枯病菌中鉴定和克隆量个在功能上能互补甘蓝黑腐病菌的ｒｐｆＣ突变体的基因，并通过构建突变体证实了这一基因在水稻白叶枯病菌致病性中起重要作用。     

瘤胃微生物多糖利用位点研究进展

多糖利用位点(polysaccharide utilization loci, PULs)是一组编排特定多糖降解的基因簇,编码细胞表面多糖结合蛋白、外膜转运蛋白、碳水化合物活性酶和转录因子。通过多糖利用位点,拟杆菌可更好地协同多个蛋白的合作,实现对植物多糖识别、捕获和降解的一体化,具备高效利用多糖的能力。拟杆菌在瘤胃微生物中占比丰富,揭示瘤胃拟杆菌通过多糖利用位点降解纤维类物质的作用机制是改善瘤胃功能、挖掘高效酶的基础。本文主要对多糖利用位点的作用模式、调控机制及瘤胃微生物多糖利用位点的研究进展进行了综述,旨在为加强多糖利用位点的研究,并将其应用于微生物调控和生物能源开发提供理论依据。     

云南富源泡菜中一株高产胞外多糖乳酸菌的分离及鉴定

以富源泡菜为原料,利用平板涂布、划线分离及菌落拉丝等方法筛选出富源泡菜中产胞外多糖菌株。将得到的菌株进行培养,采用三氯乙酸除蛋白、减压浓缩、乙醇沉淀及冷冻干燥等方法制备胞外多糖,并对不同菌株产胞外多糖含量进行测定,筛选出产胞外多糖含量最高的菌株。将此菌株进行菌落形态特征及16S rDNA序列分析并构建系统发育树。经鉴定,该菌株与德氏乳杆菌的同源性相似度最高(99%),并且与AB911513.1 Lactobacillus delbrueckii strain:JCM 8671具有较高的亲缘关系,由此可将此菌株鉴定为德氏乳杆菌,并命名为Lactobacillus delbrueckii H-3。分离出的高产胞外多糖乳酸菌,可为研究、开发新型功能性食品提供原料以及为后续胞外多糖的工业化制备提供理论依据及数据支持。     

甘蓝黑腐病菌rpf基因簇对胞外蛋白酶I基因表达的调控

甘蓝黑腐病黄单胞菌产生的胞外蛋白酶Ｉ在致病的早期阶段起重要作用，该酶以及其它胞外酶和胞外多糖的合成受一致病因子调控基因簇（ｒｐｆ基因簇）的正向调控。本研究利用带有β－半乳糖苷酶报道基因（ｌａｃＺ）的转座子Ｔｎ５－Ｂ２０诱变蛋白酶Ｉ基因克隆，获得了ｌａｃＺ在蛋白酶Ｉ基因启动子控制下表达的Ｔｎ５－Ｂ２０插入突变质位。通过将这种突变质粒导入野生型和各ｒｐｆ基因突变体菌株后，测定ｌａｃＺ基因在细胞生长周期     

仿刺参及养殖环境中溶藻弧菌和灿烂弧菌的PCR快速检测

溶藻弧菌和灿烂弧菌是水产养殖中常见的致病菌,给水产动物的养殖带来巨大的损失,建立一种简便、快速、有效的检测方法十分必要。根据溶藻弧菌和灿烂弧菌gyrB基因序列的保守区序列分别设计引物,对9株溶藻弧菌和6株灿烂弧菌进行了PCR扩增。结果表明两对引物能特异地检测溶藻弧菌和灿烂弧菌,而与其他细菌没有交叉反应;检测溶藻弧菌的每个PCR反应的敏感度为0.13 pg的DNA和103 cfu/mL细菌,检测灿烂弧菌的每个PCR反应的敏感度为0.34 pg的DNA和103 cfu/mL细菌。该PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高的特点,可用于对感染溶藻弧菌和灿烂弧菌的仿刺参及其养殖水体中的细菌性病原进行快速检测。     

多重富集定量PCR(ME-qPCR)同时检测4种食源性病原弧菌

【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是4种重要的食源性病原弧菌,能够造成人类多种疾病,建立同时检测这4种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量PCR(multiplex enrichment quantitative PCR,ME-q PCR)方法,并含扩增内标用于指示PCR反应的假阴性,创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法,为这4种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌16S r RNA为扩增内标靶序列设计引物,并针对副溶血弧菌的collagenase、溶藻弧菌的gyr B、霍乱弧菌的omp W、创伤弧菌的vvh A,分别设计内、外2对特异性引物,首先将所有内、外引物混合,进行一个循环数较少(10—20 cycles)的高通量多重富集PCR将靶基因富集出来,由于循环数较少,各个基因得到均匀的扩增,每个基因均有4种可能的产物,每1种产物均能作为第二轮巢氏荧光定量PCR的模板,这增加了靶基因从模板中被富集出来的概率,然后将产物稀释后作为模板,利用内引物分别进行巢式荧光定量PCR检测各个基因,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。通过设置不同的第一轮多重富集PCR循环数(10、15和20个循环),优化ME-q PCR第一轮循环数。采用14株标准菌株的基因组DNA作为模板,评价ME-q PCR的特异性。并以4种弧菌基因组DNA混合物梯度稀释的样品(100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1)作为模板,对建立的ME-q PCR进行灵敏度和定量能力的评价。并将该方法应用于已分离到的69株疑似弧菌菌落的鉴定中,与传统生理生化鉴定结果进行对比。【结果】优化后,ME-q PCR的第一轮循环数确定为15,特异性评价结果显示该方法特异性强,灵敏度达0.001 ng,高于普通荧光定量PCR约1个数量级,并能有效指示PCR反应的假阴性,且拥有与普通荧光定量PCR相同的定量能力,扩增效率和R2符合定量的要求;将建立的ME-q PCR方法应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,24个绿色菌落为副溶血弧菌,22个黄色菌落为溶藻弧菌,1个黄色菌落为创伤弧菌,没有检出霍乱弧菌,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够定量、快速准确地检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌这4种食源性病原弧菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,结果无需凝胶电泳,适用于食品中4种常见病原弧菌的快速筛检。     

溶藻弧菌对水产动物致病性及其防治的研究进展

溶藻弧菌是一种常见的海洋伺机性病原体,是引起人类、水生动物细菌性疾病的重要病原之一。与其它病原微生物一样,弧菌的致病性与其产生的多种毒力因子息息相关,毒力基因是产生各种毒力因子的物质基础。本文对溶藻弧菌的病原学、致病机理及其防治等方面的最新研究成果进行了综述。     

地高辛标记的DNA探针制备及其应用于溶藻弧菌的检测

从基因库中获取溶藻弧菌的胶原蛋白酶基因序列和外膜蛋白基因序列,根据基因的保守性用DNAStar分别设计2对引物,分别对溶藻弧菌基因组进行PCR扩增,用地高辛标记扩增的特异DNA片段以制备探针.分别用胶原蛋白酶DNA探针和外膜蛋白DNA探针对实验室保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌进行斑点杂交检测,检测结果表明,胶原蛋白酶基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应,而与霍乱弧菌、哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA等均无反应,表明该胶原蛋白酶DNA探针的特异性较强;而外膜蛋白基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应,但与哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA也出现了较强的阳性反应,与霍乱弧菌DNA则无反应,表明该外膜蛋白DNA探针的特异性较低.说明所构建的溶藻弧菌胶原蛋白酶DNA探针斑点杂交检测方法具有特异性强、简便易行,可应用于溶藻弧菌的快速检测.     

Metabolic diversification--independent assembly of operon-like gene clusters in different plants

Operons are clusters of unrelated genes with related functions that are a feature of prokaryotic genomes. Here, we report on an operon-like gene cluster in the plant Arabidopsis thaliana that is required for triterpene synthesis (the thalianol pathway). The clustered genes are coexpressed, as in bacterial operons. However, despite the resemblance to a bacterial operon, this gene cluster has been assembled from plant genes by gene duplication, neofunctionalization, and genome reorganization, rather than by horizontal gene transfer from bacteria. Furthermore, recent assembly of operon-like gene clusters for triterpene synthesis has occurred independently in divergent plant lineages (Arabidopsis and oat). Thus, selection pressure may act during the formation of certain plant metabolic pathways to drive gene clustering.     

港口航道致病性细菌检测微阵列基因芯片的研制

[目的]制备出一套针对港口航道致病性细菌检测的基因芯片,为港口航道基因芯片检测技术的研究及应用打下基础.[方法]采用常规方法提取目标菌株基因组DNA,以16S rDNA通用引物和gyrB基因保守区引物进行PCR扩增,使用AlleleID 6.0和Array Designer 4.25对扩增获得的目的片段进行寡核苷酸探针设计,经PCR筛选验证,目标探针以氨基化修饰后通过芯片点样仪点制在醛基玻片上;优化芯片杂交固定条件,并用于港口航道的水样检测,以验证微阵列基因芯片的检测效果.[结果]优化后的芯片杂交固定条件为探针点样浓度10μmol/L、紫外交联时间2.0 h、杂交温度65℃,有效提高了基因芯片检测的灵敏度,与传统检测方法相比可实现快速、高通量、准确的目标.研制的微阵列基因芯片可特异性检测出港口航道中含有的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、阴沟肠杆菌(Emterobacter cloacae)、溶藻弧菌(V.alginolytivus)、哈氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和创伤弧菌(V.vulnificus)等7株致病性细菌,且均未出现非特异性杂交.[结论]针对港口航道致病性细菌建立的微阵列基因芯片检测技术具有特异性强、灵敏度高、快速便捷的特点,可用于港口航道及周边地区的海洋环境监测和海产品质量安全检测.     

溶藻弧菌RseB基因缺失对凡纳滨对虾致病性的影响

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一种条件性嗜盐革兰氏阴性致病菌,是水产养殖常见的病原菌。本实验利用OverlapPCR和同源重组技术,构建RseB基因敲除突变株,以研究RseB在溶藻弧菌致病性方面的作用。结果表明,与野生型溶藻弧菌(ATCC17749)相比,RseB基因的缺失提高了溶藻弧菌的生长速度,溶血性下降了约1.6倍。凡纳滨对虾侵染致病性试验结果显示,实验组凡纳滨对虾开始死亡时间推迟约为4h,LT50时间推迟20h小时,RseB基因缺失株对凡纳滨对虾肠道的侵染定殖能力下降2.2倍。这些结果表明,RseB基因对于溶藻弧菌正常的生理功能、溶血性及毒力都有重要作用。S     

乌鳢体表粘液的抑菌作用

分析了乌鳢体表粘液对爱德华氏菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌3种海洋致病菌的抑菌效果及影响因素。结果表明,同浓度的提取物对不同致病菌的抑菌活性不同,对爱德华氏菌抑制活性最大,其次是溶藻弧菌,最差的是哈维氏弧菌。此外,温度、紫外线和pH对提取物抑制活性都有不同程度的影响。     

RseB影响溶藻弧菌感染花鲈的能力

为了研究Rse基因缺失对溶藻弧菌感染花鲈能力的影响，评估了花鲈感染后的LD50、定殖能力和免疫响应，结果显示，溶藻弧菌野生株LD50为2.013×105CFU/ml，RseB缺失溶藻弧菌LD50为5.526×105CFU/ml，RseB缺失溶藻弧菌毒力下降2.75倍；溶藻弧菌主要在花鲈的鳃部、肠道、皮肤定殖，RseB缺失溶藻弧菌定殖肠空泡化程度更低，鳃组织结构的损坏程度更低；分别对野生株与RseB缺失溶藻弧菌感染的花鲈头肾组织进行转录组测序，发现与免疫相关的差异表达基因一共有236个，其中包括了122个显著上调的免疫基因和114个显著下调的免疫基因，这些基因大部分显著富集在Th1和Th2细胞分化、B细胞受体信号通路、T细胞受体信号通路等特异性免疫通路上，部分基因显著富集在与细胞凋亡相关的通路以及与炎症相关的NF-kappa B信号通路中。综上结果表明RseB缺失溶藻弧菌能引起宿主细胞的免疫反应且毒力有所降低。