抗Zhangfei蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备抗Zhangfei蛋白的单克隆抗体,并鉴定其特性。【方法】用Zhangfei融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0融合,筛选出阳性克隆,应用有限稀释法筛选抗Zhangfei蛋白的单克隆杂交瘤株;采用腹水诱生法制备单抗腹水,用饱和硫酸铵法纯化腹水抗体;采用间接ELISA、单克隆抗体亚型检测试剂盒、免疫印记技术、曲线拟合方案等分别鉴定单抗效价、亚型、特异性和亲和力等特性。【结果】免疫小鼠的血清抗体效价达1∶5 000以上,细胞融合克隆率为98.96%,阳性克隆率为30.18%,筛选出2株抗Zhangfei蛋白的单克隆杂交瘤细胞,其培养上清效价均达到1∶800,腹水单抗效价分别为1∶105和1∶2×105,亲和常数分别为2.5×106和2.3×106。制备的抗Zhangfei蛋白单克隆抗体的亚型均为IgG1类型。【结论】制备的抗Zhangfei蛋白单克隆抗体具有较高的效价和较强的亲和力,可用于进一步研究Zhangfei蛋白在机体中的生理作用。     

抗Gly m Bd 28K单克隆抗体的制备及其免疫学特性

利用Gly m Bd 28K天然蛋白免疫BALB/c雌性小鼠,取小鼠脾脏细胞与杂交瘤细胞融合,筛选出2株能稳定分泌抗Gly m Bd 28K单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E3和2F4。体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体,经纯化后,得到2株均为IgG1型的单克隆抗体mAb1E3和mAb2F4。间接ELISA方法测得mAb1E3的效价达到1∶4 10×105,对Gly m Bd 28K蛋白的半数抑制率（IC50）为23.99 μg·L-1,与花生蛋白、核桃蛋白等的交叉反应率均低于0.1%。该单克隆抗体的制备为Gly m Bd 28K致敏蛋白的检测以及抗原表位的鉴定奠定了基础。     

盖塔病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备盖塔病毒(GETV) E2蛋白单克隆抗体,通过大肠埃希菌表达系统表达重组E2蛋白,经过镍柱吸附、切胶纯化,获得E2蛋白,将其作为免疫原免疫BALB/c小鼠,3次免疫后加强免疫,细胞融合,通过间接免疫荧光筛选阳性杂交瘤细胞,最终筛选出1株针对GETV E2蛋白的阳性杂交瘤细胞9E8,将该杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔内生产腹水。经间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验鉴定,该单抗可与GETV发生特异性反应。经IP试验证明,该单抗可识别天然结构的GETVE2蛋白。对E2单抗进行抗原表位鉴定,确定其所识别的多肽序列为⁶⁶KIRYIAGHD⁷⁴。与GenBank上登录的其他GETV毒株序列对比,发现该段序列高度保守。综上,E2单抗9E8免疫学反应特性良好,为研究该病毒提供了有效的免疫学检测工具。     

间接ELISA法检测羊促乳素抗体方法的建立

【目的】建立促乳素单克隆抗体制备中筛选阳性分泌细胞的间接ELISA检测方法。【方法】用促乳素纯品与Freund佐剂免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,初次免疫采用抗原与完全Freund佐剂,每2周免疫1次,从第2次开始采用抗原与不完全Freund佐剂,免疫4次后尾静脉采血,收集血清制备阳性对照抗体,以未免疫的BALB/c小鼠血清为阴性对照,筛选间接ELISA法检测促乳素抗体的最佳反应条件,并对单克隆抗体制备中的阳性细胞进行筛选。【结果】间接ELISA法的最佳反应条件:血清稀释倍数为1∶200,抗原包被质量浓度为100 ng/mL,封闭液为1%牛血清白蛋白,酶标抗体的工作浓度为1∶10 000,酶标抗体作用时间为37℃90 min,底物作用时间37℃30min。用该方法检测融合的杂交瘤细胞,最终获得OD450为0.875和0.460的阳性细胞株。【结论】建立了检测促乳素抗体的间接ELISA检测方法,该方法方便易行。     

基于结构类似物的交叉反应性制备高灵敏度玉米赤霉醇单克隆抗体

【目的】获取高灵敏度的玉米赤霉醇(zearalanol,ZAL)单克隆抗体,为提高玉米赤霉醇免疫学检测方法灵敏度研究奠定基础。【方法】利用ZAL的结构类似物玉米赤霉酮(zearalanone, ZAN)制备人工完全抗原。肟化改造ZAN得到ZAN-O;碳二亚胺(EDC)法把ZAN-O分别连接到牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)上制备出ZAN-O-BSA和ZAN-O-OVA。ZAN-O-BSA免疫小鼠,免疫剂量为50μg蛋白/只鼠。选取血清效价高、灵敏度好的小鼠进行细胞融合。阳性杂交瘤筛选过程中,利用ZAL替代ZAN作为阻断剂,筛选能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞。体内诱生腹水法来批量制备ZAL单抗,并对单抗的免疫学性能进行了鉴定。【结果】通过细胞融合,阳性杂交瘤筛选得到了1株能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为12B10A7,其分泌的ZAL单抗灵敏度(半数抑制浓度, IC50)为577 pg·mL~(-1),亲和力常数Ka=6.21×10~7 L·mol~(-1),与结构类似物β-玉米赤霉醇(β-zearalanol,β-ZAL)、α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol,α-ZEL)、β-玉米赤霉烯醇(β-zearalenol,β-ZEL)、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)分别有43.06%、15.51%、15.22%、77.65%及9.79%的交叉反应率,而与其他霉菌毒素及载体蛋白交叉反应率均0.06%。【结论】基于抗体交叉反应特性,利用ZAN制备人工抗原,得到了ZAL的单克隆抗体,所制备的单克隆抗体亲和力高,灵敏度好,特异性强。     

基于结构类似物的交叉反应性制备高灵敏度 玉米赤霉醇单克隆抗体

【目的】获取高灵敏度的玉米赤霉醇（zearalanol,ZAL）单克隆抗体,为提高玉米赤霉醇免疫学检测方法灵敏度研究奠定基础。【方法】利用ZAL的结构类似物玉米赤霉酮（zearalanone, ZAN）制备人工完全抗原。肟化改造ZAN得到ZAN-O;碳二亚胺（EDC）法把ZAN-O分别连接到牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）上制备出ZAN-O-BSA和ZAN-O-OVA。ZAN-O-BSA免疫小鼠,免疫剂量为50 μg蛋白/只鼠。选取血清效价高、灵敏度好的小鼠进行细胞融合。阳性杂交瘤筛选过程中,利用ZAL替代ZAN作为阻断剂,筛选能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞。体内诱生腹水法来批量制备ZAL单抗,并对单抗的免疫学性能进行了鉴定。【结果】通过细胞融合,阳性杂交瘤筛选得到了1株能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为12B10A7,其分泌的ZAL单抗灵敏度(半数抑制浓度, IC₅₀)为577 pg?mL ^-1,亲和力常数Ka=6.21×10 ⁷L?mol ^-1,与结构类似物β-玉米赤霉醇（β-zearalanol, β-ZAL）、α-玉米赤霉烯醇（α-zearalenol, α-ZEL）、β-玉米赤霉烯醇（β-zearalenol, β-ZEL）、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）分别有43.06%、15.51%、15.22%、77.65%及9.79%的交叉反应率,而与其他霉菌毒素及载体蛋白交叉反应率均<0.06%。【结论】基于抗体交叉反应特性,利用ZAN制备人工抗原,得到了ZAL的单克隆抗体,所制备的单克隆抗体亲和力高,灵敏度好,特异性强。     

Luman-端融合蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备小鼠抗Luman-N端融合蛋白单克隆抗体。【方法】将GST-Luman-N端载体转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳,用电洗脱的方法纯化融合蛋白;以纯化的融合蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性孔,采用有限稀释法进行亚克隆,筛选具有抗体分泌活性的单克隆细胞株;应用Western Blot、间接ELISA等方法进行克隆株稳定性、抗体特性的鉴定。【结果】获得1株能稳定分泌抗Luman-N端融合蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2C8),其腹水ELISA单抗效价为1∶1×107。亚型鉴定和亲和力常数分析表明,2C8产生的单克隆抗体亚型为IgG2b型,其亲和力常数约为1×107。Western Blot分析证明,该株单抗能与原核表达的Luman-N端融合蛋白特异性结合,与GST-LRF-N端融合蛋白没有特异性结合。染色体分析结果表明,2C8细胞株染色体数目为(53±2)对。【结论】获得了抗Luman-N端融合蛋白的抗体,该抗体具有良好的特异性和结合活性,可用于对Luman-N端蛋白的进一步研究。     

3α-HSD单克隆抗体的制备及其鉴定

为制备抗3α-HSD蛋白单克隆抗体(MAb),以已表达纯化的高纯度3α-HSD蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术,经过免疫和细胞融合后筛选出特异性的抗3α-HSD蛋白单克隆抗体,成功冻存35株IgG类型阳性杂交瘤细胞株。对14号和20号Anti-3α-HSD进行亲和性测试,发现其与可溶性抗原蛋白的亲和常数分别为3.7E+09和4.2E+09,二者可与抗原牢固结合,具有良好的亲和性。     

绵羊早孕因子单克隆抗体的制备及鉴定

为制备绵羊早孕因子(EPF)单克隆抗体,以纯化的EPF重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接ELISA方法筛选单克隆抗体细胞株,将筛选的细胞株注入小鼠腹腔得到腹水型抗体,用G-sepharose柱亲合层析法对小鼠腹水型抗体进行纯化,应用SDS-PAGE和Western blot分析抗体纯化后的纯度及特异性。结果显示,细胞融合后得到了1株抗绵羊EPF单克隆抗体的细胞株B4D5,纯化后的腹水型单克隆抗体纯度较高,具有较强的特异性,应用单克隆抗体检测绵羊妊娠准确率为81.3%。表明,制备的绵羊早孕因子单克隆抗体为特异性抗绵羊EPF抗体。     

抗MATSA单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备抗鸡马立克氏病肿瘤相关表面抗原(Marek’s disease tumor-associated surface antigen,MATSA)的单克隆抗体(Monoclonal antibodies,McAb),为马立克氏病的相关研究及研制以MATSA单克隆抗体为载体的抗肿瘤药物提供材料。【方法】用纯化的MATSA免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,并对其染色体进行分析。将阳性杂交瘤细胞株接种Balb/c小鼠,制备McAb腹水,采用硫酸铵盐析法粗提McAb,并鉴定其所属亚类。【结果】获得了3株能稳定分泌MATSA McAb的杂交瘤细胞株B3、H6和D6,其培养上清液抗体效价为26~27,Balb/c小鼠接种细胞制得的腹水效价为210~211。染色体分析结果显示,3株杂交瘤细胞染色体数目均为52±2对。3株杂交瘤细胞株所分泌的McAb均为IgG 2b亚类,可与MSB1细胞反应。【结论】获得了MATSA的McAb。     

抗H5N1型禽流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定

制备抗H5N1型禽流感病毒单克隆抗体并对其进行鉴定.采用纯化抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌抗AIV-H5N1的单克隆抗体细胞株,将阳性细胞株接种小鼠腹腔制备单克隆抗体腹水并对腹水抗体进行纯化,测定抗体亚类,并对其抗原结合位点进行分析.共获得了5株单克隆抗体杂交瘤细胞株,均为抗AIV-H5N1的特异性单克隆抗体,而且与H9N1型禽流感病毒,H13型禽流感病毒,鸡新城疫病毒,产蛋下降综合征病毒,鸡传染性支气管炎病毒均无交叉反应.     

伏马菌素B1单克隆抗体的制备及鉴定

 【目的】真菌毒素可导致严重的食品安全问题。本试验旨在制备可用于检测伏马菌素B1的特异性单克隆抗体。【方法】制备伏马菌素B1人工抗原,杂交瘤细胞法筛选杂交瘤细胞株制备腹水型单克隆抗体,并对其特性进行鉴定。【结果】筛选得到杂交瘤细胞株F3,分泌的单克隆抗体亚类为IgG1,轻链类型为κ链;10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单抗蛋白重链分子质量约为50 kD,轻链分子质量约为25 kD;间接酶联免疫吸附法测定杂交瘤细胞F3细胞培养上清和腹水效价分别为1:3 200和1:51 200;亲和力常数为1.60×10-8 mol•L-1;IC50值可达3.589 ng•mL-1;对其它真菌毒素不存在交叉反应;免疫转印法鉴定抗体具有高特异性。【结论】本试验制备FB1单克隆抗体具有较好亲和力和高特异性,具有良好的应用价值。     

抗链霉素单克隆抗体的制备及其初步应用

【目的】筛选抗链霉素特异性单克隆抗体,并初步建立其竞争ELISA快速检测方法。【方法】用EDC方法将链霉素(SM)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备完全抗原SM-BSA及SM-OVA,SM-OVA免疫BALB/c小鼠,经细胞融合后,SM-BSA包被酶标板,ELISA筛选阳性克隆,并经有限稀释单克隆化及亚型鉴定,所获阳性克隆注射BALB/c小鼠,制备单抗腹水,并进一步western-blot鉴定其特异性,并对其竞争ELISA检测方法进行优化。【结果】经有限稀释,获单克隆抗体7株,其中链霉素特异性单克隆抗体1株,对其竞争ELISA反应条件进行了优化。【结论】获抗链霉素单克隆抗体1株,并初步建立了其竞争ELLISA方法。     

H3N2亚型SIV血凝蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的单克隆抗体,为SIV的鉴别诊断奠定基础。【方法】将A/swine/Henan/1/2010(H3N2)猪流感病毒初步浓缩后,免疫6周龄的BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与瘤细胞NS0融合,采用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,对杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体进行Western blot检验和抗原结合活性检测。【结果】经过3次有限稀释法克隆纯化,最终得到1株能稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株,命名为1C10,经检测其腹水抗体效价为1∶51 200。单克隆抗体亚型鉴定结果表明,1C10为IgG1亚型,轻链类型为κ链。Western blot检测结果表明,这株单克隆抗体能与H3N2特异性结合,而且能特异性识别血凝素蛋白(HA),而不与H1N1亚型猪流感病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒发生交叉反应。【结论】制备获得1株抗猪流感H3N2病毒HA蛋白的单克隆抗体,可用于猪流感病毒鉴别诊断方法的建立。     

鸡蛋溶菌酶单克隆抗体的制备与鉴定

为建立一种便捷的鸡蛋溶菌酶定量测定方法,将鸡蛋溶菌酶免疫BALB∕c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2∕0骨髓瘤细胞融合,用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,制备腹水并纯化,用间接ELISA和Western blot试验方法检测纯化抗体的特异性。结果表明:通过筛选获得1株稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系3E4,其抗体亚型为Ig G2b,细胞培养上清和腹水效价分别达2 560和1.0×106;MAb的特异性鉴定结果显示,该株细胞系所产生的抗体能够特异地与鸡蛋溶菌酶蛋白反应。该抗体的制备为鸡蛋溶菌酶检测方面的研究提供了基础。     

分泌抗春雷霉素单克隆杂交瘤细胞株的建立 及免疫学特性鉴定

【目的】制备高灵敏、高特异性的抗春雷霉素单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】采用EDC法将KSM分别偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫原KSM-BSA和包被原KSM-OVA,经SDS-PAGE鉴定后,免疫Balb/c小鼠,免疫间隔4周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗KSM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗KSM的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】SDS-PAGE鉴定结果显示KSM-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的6只小鼠血清效价均达1:104以上,其中3号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为73.9ng•mL-1,融合后筛选出两株杂交瘤细胞株1G7和2C8,亚型均为IgG1型,其细胞上清效价分别为1:5.12×103 和1:1.28×103,腹水效价分别为1:5.12×105和1:2.56×105,抗KSM的单克隆抗体对春雷霉素的IC50为8.902ng•mL-1,与其它竞争物的交叉率均小于0.03%。【结论】本试验成功合成了春雷霉素人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为春雷霉素免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

抗鸡CD25单克隆抗体的制备与鉴定

用纯化的鸡IL-2Rα(chCD25)重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,成功获得1E1,1G1,4H5,5E1,6A1,6C2,6C9 7株能稳定传代并分泌抗chCD25单克隆抗体的杂交瘤细胞.该7株单克隆抗体的腹水间接ELISA效价达106以上.除了1E1为IgG2b外,抗体类型均为IgG1,轻链皆为κ.经Western blot和免疫细胞化学分析表明,7株单克隆抗体皆与chCD25重组蛋白和真核表达蛋白EGFP-chCD25反应.抗chCD25单克隆抗体的获得为开展禽类分子免疫学研究提供了一种新的工具.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备与特性分析

【目的】制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体,探讨单克隆抗体临床应用的价值及病毒蛋白的结构和功能。【方法】采用差速和蔗糖不连续密度梯度离心纯化的PRRSV抗原免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞常规融合,经间接ELISA的筛选和有限稀释亚克隆,获得能稳定分泌鼠抗PRRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并通过ELISA、Western blot和免疫荧光试验等方法分析其特性。【结果】成功地获得了3株稳定分泌抗PRRSV-GP5蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为A61、B47和C65。这3株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类分别为IgG1、IgG3和IgG1,均具有ELISA、IFA和Western blot特性,细胞上清液和腹水的ELISA抗体效价分别为1×27~1×28和1×105~1×106。特异性测定结果表明,3株单克隆抗体与Marc-145细胞、猪2型圆环病毒和猪细小病毒均无交叉反应。Western blot测定结果表明,3株单克隆抗体均能特异性识别PRRSV-GP5蛋白。【结论】获得了特异性识别PRRSV-GP5蛋白的单克隆抗体,为PRRS免疫诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

抗百菌清单克隆抗体的研制与鉴定

【目的】制备高灵敏、高特异性的百菌清(CTN)单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】将CTN进行化学修饰后引入羟基活性基团,合成具有半抗原结构特征的百菌清衍生物（CTN-OH）;采用N, N-羰基二咪唑法（CDI）将CTN-OH与牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清蛋白（OVA）偶联合成人工免疫抗原CTN-BSA和包被抗原CTN-OVA,用紫外分光光度法（UV）和凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定后,免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗CTN单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗CTN的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】UV 和SDS-PAGE鉴定结果显示,CTN-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的3只小鼠效价均达1﹕104以上,其中2号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为93.593 ng•mL-1,融合后筛选出4株杂交瘤细胞株1E8、1F4、2A10和2E2,其细胞上清效价分别为1﹕1.6×103 、1﹕6×102、1﹕6×102、1﹕6×102,1E8株腹水效价为1﹕5.12×105,抗CTN单克隆抗体对CTN的IC50为21.6685 ng•mL-1,且具有较好的特异性。【结论】本试验成功合成了CTN人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为CTN免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

抗GST单克隆抗体的制备及应用

用纯化的重组GST(谷胱甘肽S-转移酶)蛋白免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经三次有限稀释法克隆,成功获得4B3和1H10共2株能稳定传代并分泌抗GST单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞.2株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-6,抗体类型均为IgG1,κ链,经Western-blot分析表明,2株单抗与GST-IBV-S1-F融合蛋白及重组GST蛋白均具有特异性反应,验证这2株单抗可用于检测GST融合蛋白的表达情况;用1H10单抗制备的亲和凝胶柱可用于GST融合蛋白的纯化.