VA5免疫增强剂对鸽新城疫病毒灭活疫苗的增效作用研究

试验旨在探究VA5免疫增强剂对鸽新城疫病毒（NDV）灭活疫苗（ND4416株）的免疫增效作用。选取160只健康鸽随机分为4组：ND4416株灭活疫苗组（NDV组）、ND4416株灭活疫苗与免疫增强剂（VA5）混合组（NDV+VA5组）、La Sota灭活疫苗组（La Sota组）及生理盐水空白对照组（C组）,进行免疫效力及免疫持续期试验。采用血凝抑制试验检测各组鸽免疫后不同时间点的血清抗体效价,结果显示,VA5免疫增强剂能够显著提高鸽NDV灭活疫苗血清抗体水平（P<0.05）。脾脏淋巴细胞转化试验结果显示,VA5能够有效刺激免疫鸽的淋巴细胞转化。在免疫后第30、90、180天,各组鸽子采用ND4416株进行攻毒试验,结果显示,NDV+VA5组在3个时间点的攻毒保护率均为100%,均高于La Sota组。免疫持续期试验结果显示,NDV+VA5组血清抗体水平在免疫后第21天达峰值11.20log₂,第180天仍能达到7.50log₂,攻毒保护率达100%,表明VA5免疫增强剂可延长鸽新城疫疫苗的免疫效力持续期至180 d。攻毒后体外排毒检测结果表明,VA5免疫增强剂能够缩短攻毒后鸽的体外排毒周期,减少体外排毒。综上,VA5免疫增强剂能够显著提高鸽NDV灭活疫苗的免疫效果,为研制效果更好的鸽NDV疫苗提供了基础依据,同时也为免疫增强剂的应用增加了试验数据。     

鸡IL-1β、IL-2、IFN-γ和MGF对表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒免疫效力的影响

将10日龄的SPF鸡和15、28日龄的商品鸡分别随机分组,同时免疫不同剂量的rFPV-HN（表达NDV HN基因重组鸡痘病毒）和表达不同细胞因子（IL-1β、IL-2、IFN-γ、MGF）的重组鸡痘病毒（rFPVs）。在免疫后不同时间,通过检测血液中抗NDV的HN蛋白抗体、脾脏中CD4＋和CD8＋T细胞的变化及攻毒保护率等指标。结果表明：IL-1β或IFN-γ在免疫后期能促进抗HN间接ELISA抗体的滴度上升,而且产生抗体的整齐度好;IL-1β或IL-2可以显著增加脾脏中CD4＋和CD8＋T细胞含量;IL-1β、IL-2或IFN-γ同样可以提高商品鸡攻毒后的存活率。IL-2和IFN-γ在增加脾脏中CD4＋和CD8＋T细胞的数量及攻毒保护方面表现出一定的协同增强作用。     

NDVLaSota、V4疫苗免疫鸡及免疫攻毒鸡的主要特异性血清抗体动态变化规律比较

本研究应用间接ELISA方法对新城疫LaSota和V4疫苗免疫SPF鸡及免疫后攻毒SPF鸡的血清中新城疫病毒（NDV）特异性HI抗体、IgM和IgG抗体水平的动态变化进行了检测。结果表明，V4较LaSota疫苗免疫鸡HI抗体提前3天左右出现，但除高峰期（1周左右）外，其HI抗体水平均低于LaSota免疫鸡。LaSota免疫鸡。LaSota疫羁免疫鸡血清中NDV特异性IgM和IgGr抗体高峰较V4免疫鸡提前约2周出现，攻毒后，LaSota免疫鸡血清中特异性IgG和IgG回忆应答显著，而V4免疫鸡IgM和IgG回忆应答不明显。     

鸡新城疫重组鸡痘病毒活疫苗的免疫持续期和加强免疫研究

本研究旨在评价表达新城疫病毒（NDV）血凝素-神经氨酸酶（HN）基因的重组鸡痘病毒（rFPV-12LSHN）活疫苗的免疫持续期和加强免疫对疫苗免疫效力的影响。用rFPV-12LSHN活疫苗免疫14日龄SPF鸡,103PFU/羽,7d即可检测到NDV HI抗体应答,对NDV强毒F48E8株攻毒保护率达100%。一次免疫18周后,对NDV强毒攻击依然提供完全保护。鸡痘病毒（FPV）疫苗免疫4周,再接种rFPV-12LSHN活疫苗,攻毒保护率降低至50%。相反,rFPV-12LSHN免疫4周,随后二次免疫可显著提高对NDV的体液免疫应答水平（P〈0.01）,对NDV强毒攻击的保护率仍然为100%。结果表明,表达NDV HN基因的重组鸡痘病毒（rFPV-12LSHN）活疫苗,能够快速建立坚强免疫力,免疫持续期至少可达18周,rFPV-12LSHN的二次免疫可以提高疫苗的免疫力。     

B亚群禽白血病病毒对鸡新城疫疫苗免疫效力的影响

为研究B亚群禽白血病病毒(ALV-B)对新城疫疫苗免疫效力的影响,将50只SPF鸡随机分为2组,试验组鸡接种ALV-B,对照组鸡注射等量生理盐水,7 d后2组全部滴鼻免疫新城疫病毒(NDV)LaSota疫苗,试验期8周。结果显示,与对照组相比,当试验组的鸡感染ALV-B后,再免疫LaSota疫苗时,NDV抗体水平、IFN-γ和IL-2浓度以及外周血CD4⁺和CD8⁺的T淋巴细胞百分比均显著降低(P<0.05)。试验组鸡的肝脏、脾脏、法氏囊均发生肿瘤性组织学病变,其中肝脏超微组织学病变中可同时见到ALV-B和LaSota病毒。综合上述研究证明ALV-B可显著降低LaSota疫苗的免疫应答效果,两种病毒有共感染的现象。     

Immune protection assay of Newcastle disease live vaccine （LaSota Strain） against a genotype VII NDV isolate

从山东省发病鸡群分离鉴定了一株新城疫病毒（NDV）,命名为SDLY01。经蚀斑纯化后进行毒力测定和序列分析表明分离株SDLY01属于基因VII型NDV强毒。20只7日龄SPF鸡免疫新城疫活疫苗LaSota后14d分别用NDV标准强毒F48E8和分离株SDLY01攻毒,同时设同日龄SPF鸡为对照组,未免疫任何疫苗。攻毒后观察10d,免疫组在攻毒后食欲、精神均正常;对照组在攻毒后2～4d发病死亡,并表现ND典型的临床症状和病理变化。攻毒后第3、5、7、9d对免疫组试验鸡取喉头、泄殖腔棉拭进行病毒分离,F48E8攻毒组病毒分离均为NDV阴性,SDLY01攻毒组第5d病毒分离NDV阳性,第3、7和9d病毒分离阴性。本研究结果表明LaSota活疫苗对F48E8和SDLY01均能提供100％免疫保护,但不能完全抑制基因VIINDV分离株在体内的复制和排毒。     

鸡新城疫灭活疫苗免疫攻毒试验与血清学(HI)试验的平行关系研究

对19批鸡新城疫(ND)灭活疫苗进行了效力检验,在测定PD50的同时,进行了HI抗体效价的测定,以寻找血清学与抗攻毒保护的平行关系.结果表明,免疫剂量与GMHI抗体效价和攻毒保护率呈正相关:免疫1/12.5剂量组共保护54/60(90%),GMHI抗体效价为5.6 log2;免疫1/25剂量组共保护152/191(79.6%),GMHI抗体效价为4.9 log2;免疫1/50剂量组共保护123/183(67.2%),GMHI抗体效价为4.0 log2;免疫1/100剂量组共保护46/139(33%),GMHI抗体效价为3.0 log2;对照组保护0/89(0),GMHI抗体效价≤2.0 log2.采用PD50测定的18批疫苗中,有15批合格,3批不合格;按照我国现有质量标准,即免疫1/25剂量攻毒的方法进行检验,19批疫苗中有16批合格,3批不合格;血清学方法检验19批疫苗中有17批合格,2批不合格.其中免疫攻毒效检方法与PD50测定方法的不合格疫苗批次完全相同,其中2批为免疫胚制造的疫苗,1批为进口的灭活疫苗,血清学检验不合格的2批疫苗包含在其中,三种检验方法结果基本一致.试验还发现,HI抗体效价和抗攻毒保护呈正相关:未免疫对照组鸡血清HI抗体效价≤2.0 log2,攻毒保护率为0(0/89);免疫ND灭活疫苗后如果血清HI抗体效价＜3.0 log2,攻毒保护率为3.5%(4/113);HI为3.0 log2,攻毒保护率为16.1%(14/87);HI为4.0 log2,攻毒保护率为86.7%(86/99);HI达到5.0 log2,攻毒保护率为97.2%(103/106),HI≥6.0 log2,攻毒保护率为100%(168/168).     

1日龄中国黄羽肉鸡新城疫与传染性支气管炎二联弱毒活疫苗免疫保护试验

对1日龄黄羽肉鸡免疫新城疫与传染性支气管炎二联弱毒活疫苗——威支灵(即新威灵+H120),在21日龄进行新城疫强毒攻毒,与a疫苗(Mass株+La Sota克隆株)(保护率为86.7%)及c疫苗(LaSota+H120)(保护率为90%)免疫组相比,威支灵免疫组表现出了较高的保护力(保护率为96.7%),未免疫攻毒组的死亡率为40%。新城疫病毒HI检测结果表明强毒攻毒后的鸡群的新城疫HI抗体升高,同样证明了攻毒的有效性。     

鸡新城疫基因Ⅶ型灭活标记疫苗（MG7株）最小有效免疫剂量的研究

为科学指导鸡新城疫基因Ⅶ型灭活标记疫苗（MG7株）的临床免疫剂量,通过测定免疫鸡HI抗体滴度和攻毒保护试验,进行了10日龄和30日龄SPF鸡最小有效免疫剂量的研究。动物实验使用10 μL、20 μL和40 μL三种不同免疫剂量,免疫疫苗后21 d检测HI抗体效价,10日龄SPF鸡001批次疫苗HI抗体平均效价依次为：4.8、6.2和6.5,攻毒保护率依次为80%、100%和100%,30日龄SPF鸡HI抗体平均效价依次为：5.0、6.3和6.5,攻毒保护率依次为70%、100%和100%,结果表明,新城疫灭活标记疫苗（MG7株）HI 抗体效价和保护效力呈正相关, 免疫剂量与HI 抗体效价和保护效力也呈正相关。用NDV基因Ⅶ型强毒G7株进行攻毒保护试验,两种日龄鸡在20 μL的免疫剂量下,疫苗仍能达到良好的免疫保护效果。     

副猪格拉瑟菌6个候选抗原对小鼠的免疫特性分析

旨在获得具有良好免疫效果的候选抗原,本研究原核表达了副猪格拉瑟菌6个具有潜在保护力的蛋白,对小鼠免疫后进行攻毒,以期筛选获得具有免疫保护效果较好的候选抗原,从而为开发具有交叉保护作用的副猪格拉瑟菌亚单位疫苗奠定基础。63只BALB/c小鼠随机平均分为9组：HPSNAG-1330、CyaY、HPSNAG-0978、HPSNAG-0140、AfuA以及Fe³⁺ABC-tbp 6个亚单位疫苗组、G.parasuis-5灭活苗组、攻毒对照组和空白组;亚单位疫苗组每种对应蛋白各免疫50μg·只^-1,灭活苗组免疫4×10⁹CFU,一免与二免间隔14 d,二免14 d后攻毒,副猪格拉瑟菌Nakasaki菌株攻毒剂量为1.26×10⁹CFU。在二免14 d后检测特异性抗体水平、淋巴细胞增殖和IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的表达,攻毒后观察小鼠的临床症状并观察肺、脾的组织病理变化。免疫组小鼠均能产生体液免疫反应;淋巴细胞增殖试验显示：除rAfuA外,其它重组蛋白均能刺激灭活苗组中小鼠淋巴细胞显...     

鸡新城疫病毒LaSota株在BHK-21细胞上增殖条件的优化

本研究旨在对鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株在BHK-21细胞上的增殖条件进行优化,为实现应用细胞系生产NDV提供参考。在确定BHK-21细胞TPCK-胰酶耐受浓度的基础上,在培养基中添加不同浓度的TPCK-胰酶、新生牛血清及调节不同pH,通过对细胞培养液细胞半数感染量(TCID₅₀)的测定,确定最适胰酶浓度、血清浓度及pH;通过固定接毒量而添加不同数量细胞或固定细胞数量而接种不同量的病毒,确定最适细胞量及接毒量;将BHK-21细胞接种NDV LaSota株后,通过测定不同时间细胞上清液TCID₅₀绘制增殖曲线,确定最佳收毒时间;应用转瓶对该病毒进行扩大培养,并进行TCID₅₀、鸡胚半数感染量(EID₅₀)与血清凝集价(HA)的测定。结果显示,NDV LaSota株在BHK-21细胞上增殖的最适TPCK-胰酶浓度为3μg/mL,最适接毒量为10^6.375 EID₅₀,细胞数量为1×10~6个,培养基pH为7.2,且可用无血清培养基进行培养,BHK-21细胞接种NDV LaSota株后最佳收毒时间为34～36 h。应用BHK-21细胞采用转瓶培养的方式对NDV LaSota株进行增殖,结果显示,细胞培养液TCID₅₀值为10^7.0/0.1 mL,EID₅₀为10^7.5/0.1 mL,HA效价为1∶256。因此,应用以上条件增殖培养NDV LaSota株,完全适用于该病毒的规模化生产,且符合现行的兽医生物制品与检验制造规程。     

4株NDV流行株的分离鉴定、生物学特性及遗传学特性的研究

为研究近年国内的新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）流行株与传统疫苗株（Mukteswar、La Sota及Clone 30）的亲缘关系和遗传演化情况,试验从广东、广西和海南地区患病的免疫鸡群病料中分离鉴定得到4株NDV流行株。通过RT-PCR技术对各毒株的F和HN基因进行扩增、克隆与序列分析,然后与GenBank上发表的NDV序列进行同源性比对、遗传进化树分析,并测定各毒株致病指数。结果显示,本试验中HN-08株的鸡胚半数感染量（EID₅₀）、平均死亡时间（MDT）、脑内致病指数（ICPI）和静脉致病指数（IVPI）分别为10^-8.37/0.2 mL、58.5 h、1.78和2.45,XX-08株分别为10^-6.50/0.2 mL、75.0 h、1.61和2.41,YS-09株分别为10^-7.75/0.2 mL、64.5 h、1.71和2.38,LF-09株分别为10^-7.60/0.2 mL、63.8 h、1.84和2.38。4株鸡源NDV流行株彼此间F和HN基因推导的氨基酸序列同源性在95.8%以上,与鸡源流行株GX11/03、GM株的同源性为96.8%~98.6%,而疫苗株Mukteswar、La Sota及Clone 30株的同源性为86.7%~90.6%,与标准强毒株F₄₈E₉的同源性为88.4%~91.3%。表明4株NDV流行株均为强毒株,与近年来国内流行的GX11/03、GM株有较近的亲缘关系,而与传统疫苗株的关系相对较远。     

Isolation,Identification of Four Newcastle Disease Virus Strains and Study on Their Biological Characteristics and Genetic Characteristics

In order to study the relationship and evolution between the latest Newcastle disease virus (NDV) epidemic strain and the vaccine strain (Mukteswar,La Sota and Clone 30 strains),four NDV epidemic strains were initially isolated and identified from immunized chicken groups in Guangdong,Guangxi and Hainan provinces. Fusion (F) gene and hemaglutinin neuraminidase (HN) gene of four isolated stains were amplified,cloned and sequenced by RT-PCR method,and the homology analysis of amino acid sequences deduced by F and HN genes of NDV and other strains published in GenBank were studied, the phylogenetic tree were build,and the pathogenicity index of each strain (EID₅₀,MDT, ICPI and IVPI) were determined. The results showed that the EID₅₀,MDT,ICPI and IVPI of the HN-08 strain were 10^-8.37/0.2 mL,58.5 h,1.78 and 2.45,that of the XX-08 strain were 10^-6.50/0.2 mL,75.0 h,1.61 and 2.41,that of the YS-09 strain were 10^-7.75/0.2 mL,64.5 h,1.71 and 2.38,and of the LF-09 strain were 10^-7.60/0.2 mL,63.8 h,1.84 and 2.38.In this experiment,the similarity of amino acid sequences of F and HN genes was over 95.8% among four strains of NDV isolated from chicken,the similarity of four NDV strains with chicken epidemic strains (GX11/03 and GM strains),vaccine strains (Mukteswar,La Sota and Clone 30 strains) and standard virulent strain (F₄₈E₉ strain) were from 96.8% to 98.6%,86.7% to 90.6% and 88.4% to 91.3%,respectively. The results showed that four NDV epidemic strains were virulent strains,which were closely related to the GX11/03 and GM strains that were popular in China in recent years,but relatively far from the traditional vaccine strains.     

表达禽腺病毒血清4型Fiber2蛋白的重组耐热新城疫病毒的构建及免疫效果评估

【目的】 研究针对新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)和禽腺病毒(Fowl adenovirus, FAdV)的耐热基因工程疫苗。【方法】 利用反向遗传学操作技术将NDV耐热株的HN基因替换到LaSota疫苗株上, 再将禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4)的Fiber2基因插入到其基因组上, 构建表达Fiber2蛋白的重组耐热NDV质粒pTS-HN-Fiber2。通过病毒拯救技术拯救重组NDV rTS-HN-Fiber2, 并测定其生物学特性和作为疫苗候选株的免疫原性和攻毒保护性。【结果】 rTS-HN-Fiber2的鸡胚平均致死时间>168 h, 且脑内接种致病指数为0, 属于弱毒的范畴; 在细胞上的生长曲线结果表明, rTS-HN-Fiber2与亲本LaSota株有相似的生长曲线, 但最终的生长滴度略低于LaSota株; rTS-HN-Fiber2在56 ℃处理15 min后, 病毒滴度下降约10³ TCID₅₀/mL, 而LaSota株56 ℃处理5 min几乎无感染性; 间接免疫荧光试验结果表明, rTS-HN-Fiber2能表达Fiber2蛋白。免疫和攻毒试验结果显示, rTS-HN-Fiber2能产生NDV抗体, 且能显著提高雏鸡在FAdV-4强毒下的存活率, 减轻FAdV-4强毒引起的组织病变, 降低组织中的病毒载量。【结论】 本研究成功构建了表达FAdV-4 Fiber2蛋白的重组耐热NDV, 该病毒保持了亲本LaSota株的弱毒生物学特性, 但热稳定性有显著提升; 重组NDV免疫雏鸡可产生针对NDV和FAdV-4强毒的保护, 该重组NDV可作为开发针对FAdV-4和NDV二联基因工程疫苗的候选病毒株。     

一株蛋鸡新城疫病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

为研究云南新城疫病毒（NDV）分子流行特性和致病性,对云南省1个蛋鸡场的组织样品进行病原分离,通过血凝、血凝抑制试验和RT-PCR检测分离毒株,证明为NDV。通过病毒最小致死量（MLD）、鸡胚半数感染量（EID₅₀）、鸡胚平均死亡时间（MDT）、脑内接种致病指数（ICPI）和静脉接种致病指数（IVPI）测定病毒毒力,结果EID₅₀为10^-4.4,MLD为10^-4,MDT为97.5 h,ICPI为0,IVPI为0,显示分离株为弱毒株。高通量测序及遗传进化分析发现,分离毒株基因组全长为15 198 bp,从3'端到5'端有6个结构基因依次为NP-P-M-F-HN-L,各基因之间有1~48个核苷酸间隔。全基因组、F和HN基因遗传进化分析证明分离毒株属于Class Ⅰ分支,F基因ORF全长为1 662 bp,编码553个氨基酸,F蛋白裂解位点氨基酸序列为112-ERQERL-117,符合NDV弱毒裂解位点特征,HN基因ORF全长为1 851 bp,编码616个氨基酸,在HN基因保守区域234-NRKSCS-239位氨基酸序列没有发生变异。F蛋白有6个糖基化位点比较保守,HN蛋白有6个潜在的糖基化位点,但与LaSota相比存在缺失的和多出的糖基化位点。F蛋白半胱氨酸残基分布在76、199、338、347、362、370、394、399、401、424、514、523位氨基酸,F蛋白中性抗原位点在72、75、79和170位氨基酸发生了变异,HN蛋白受体结合部位和NA活性位点氨基酸为174R、401E、416R、526Y,未发生变异。本研究首次报道了云南省蛋鸡新城疫ClassⅠ毒株的全基因序列特征,为新城疫病毒ClassⅠ毒株研究奠定了基础。     

鸡毒支原体F弱毒疫苗株感染SPF鸡对IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10产生的影响

为了解鸡毒支原体（Mycoplasma Gallisepticum,MG）F弱毒疫苗株感染SPF鸡对IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10共4种细胞因子产生的影响,本研究分别以活菌浓度为109（A组）、106（B组）CCU/mL的MG F株及生理盐水（C组）点眼接种SPF鸡,采用ELISA方法对免疫前后外周血4种细胞因子的动态变化规律进行研究。结果显示免疫后A、B组的4种细胞因子浓度明显升高;其中IFN-γ质量浓度A组于第7、14天显著高于其他组（P〈0.05）,B组于第7天显著高于C组（P〈0.05）;IL-2质量浓度各组于第3、5、7天差异显著（P〈0.05）,由高至低以此为：A、B和C组;A组与B组IL-4和IL-10质量浓度差异不显著（P〉0.05）,但两组IL-4质量浓度于第5、7、14天显著高于C组（P〈0.05）;且2组IL-10质量浓度于第5、7、14、21天显著高于C组（P〈0.05）。免疫MG F株可较好的提高IFN-γ、IL-2介导的细胞免疫作用和IL-4、IL-10介导的体液免疫作用,且MG F株活菌浓度与接种鸡的细胞免疫作用呈正相关性。     

中药牛皮消多糖体外抗新城疫病毒作用的研究

为探讨牛皮消多糖（CAP）对体外抗新城疫病毒（NDV）能力的影响，本试验用水提醇沉法提取牛皮消多糖，通过苯酚硫酸法和红外光谱对牛皮消多糖进行检测，采用MTT法测定牛皮消多糖对鸡胚成纤维细胞（CEF）的安全浓度，多糖的安全浓度统一为625 μg/mL，选择安全浓度范围内的（39.06~625 μg/mL）5种浓度的各级多糖，用3种加药方式（先加多糖后接种病毒、先接种病毒后加多糖、多糖和病毒感作后加药）检测牛皮消多糖对NDV的阻断、抑制及直接杀灭作用。结果显示，先接病毒后加多糖组和多糖与病毒感作后加药组CAP₅₀、CAP₃₀、CAP_t、CAP₈₀和CAP₇₀均能显著抑制NDV感染CEF的能力，两组各级多糖抑制率分别为131.23%、110.12%、108.15%、100.24%、93.07%和61.76%、43.73%、44.51%、29.02%、37.45%；先加多糖后接病毒组CAP₅₀、CAP₃₀能显著抑制NDV感染CEF的作用（P<0.05），阻断作用下对NDV的抑制率可达到15.82%、8.33%，其余各组在安全浓度范围内对NDV无抑制作用。各组中药牛皮消多糖均有较好的抗NDV活性，其中对NDV的抑制作用和直接杀灭作用强于对其阻断作用。CAP₅₀及CAP₃₀的抗NDV活性较强，可作为进一步研究材料并具备一定的研究价值。     

重组鸡白细胞介素-6/2融合蛋白对新城疫(LaSota株)活疫苗免疫增强作用研究

为探究重组鸡白细胞介素-6/2融合蛋白(rChIL-6-Linker-ChIL-2,重组融合蛋白)对新城疫病毒(NDV)活疫苗(LaSota株)的免疫增强作用,本研究将90只SPF鸡随机分为6组,分别为PBS对照组、NDV弱毒苗对照组、rChIL-6-Linker-ChIL-2免疫增强组、rChIL-6蛋白免疫增强组、rChIL-2蛋白免疫增强组及rChIL-6+rChIL-2混合蛋白免疫增强组,将鸡白细胞介素重组融合蛋白水剂与LaSota株联合接种于SPF鸡,分别采用MTS法、流式细胞术、ELISA和HA/HI法检测接种前后不同时间各组鸡外周血及脾淋巴细胞增殖活性、鸡外周血中CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞的百分含量、血清中Th1/Th2型细胞因子表达水平及免疫抗体水平等指标。结果显示,接种后7～21d时,与NDV弱毒苗对照组相比,同时接种重组融合蛋白组鸡淋巴细胞增殖活性、外周血CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞的百分含量比值及血清中重组鸡IL-4蛋白(rChIL-4)、ChIL-6、ChIL-2、重组鸡IFN-α蛋白(ChIFN-α)、ChIFN-γTh1/Th2型细胞因子表达水平明显提升;HI免疫抗体较NDV弱毒苗对照组提高了1.0～1.9个滴度,较单一rChIL-6、rChIL-2对照组分别提高了0.2～0.7、0.2～1.1个抗体滴度。综上所述,rChIL-6-Lin-ker-ChIL-2融合蛋白对NDV(LaSota株)活疫苗在鸡体内具有明显的免疫增强效果。     

含粘膜佐剂的鸡新城疫疫苗诱导雏鸡非特异性免疫应答的研究

为研究分析重组大肠杆菌不耐热肠毒素（labile enterotoxin,LT）作为粘膜佐剂,配伍鸡新城疫疫苗的冻干样品对免疫鸡非特异性免疫应答的影响,在前期已经构建的LTR72/G192基础上,选择2、4μg LTRG蛋白作为每羽份疫苗添加量,及降低新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）50%抗原量等配伍条件。按照生产条件制备冻干疫苗,进行雏鸡免疫试验,免疫后24、48、72 h采集脾脏、胸腺淋巴结,检测几种非特异性细胞因子表达水平。结果表明：IL-6、INF-γ水平在各疫苗免疫后24h即升高,48 h达最高值;添加2、4μg LTRG蛋白的NDV疫苗组IFN-β、TNF-α水平在48 h左右显著升高,其中含4μg LTRG疫苗组与其他组差异具有极显著统计学意义（P〈0.01）;IL-6、IFN-γ转录水平有所增强,但各组间差异不具有显著统计学意义（P〉0.05）,72 h左右几种细胞因子水平均迅速下降,与NDV疫苗接种组相近。由此可见,LTRG能辅助抗原诱导免疫雏鸡的非特异性免疫应答,有利于对感染病毒的清除。     

猪圆环病毒Ⅱ型体外诱导3D4/2细胞炎症模型的建立

【目的】通过对猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）体外感染3D4/2细胞浓度、时间与细胞炎症水平进行探讨,建立PCV2体外感染3D4/2细胞炎症反应模型,以期为后期药物调控PCV2诱发3D4/2细胞炎症反应的研究奠定基础。【方法】将3D4/2细胞分为对照组及10⁰、10^-1、10^-2和10^-3 PCV2感染组,每组3个重复。对照组用DMEM培养,各PCV2感染组用不同稀释倍数PCV2液培养,2 h后均更换为含5%胎牛血清（FBS）的DMEM维持液进行培养,培养4、8、12和24 h后分别收集细胞及细胞上清液。采用Griess法检测一氧化氮（NO）水平,DCFH-DA荧光探针法检测活性氧（ROS）水平,酶标法检测还原型谷胱甘肽（GSH）水平,分光光度法检测黄嘌呤氧化酶（XOD）和髓过氧化物酶（MPO）活性,ELISA法测定白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-10、γ干扰素（IFN-γ）、IL-8、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）以及环氧合酶1（COX-1）和COX-2的分泌水平。【结果】10⁰至10^-3 PCV2作用4、8、12和24 h均能够成功感染3D4/2细胞。与对照组相比,10⁰ PCV2在感染3D4/2细胞4、8、12、24 h后ROS水平均极显著升高（P<0.01）,10^-1至10^-3 PCV2感染3D4/2细胞8、12、24 h后ROS水平显著或极显著升高（P<0.05;P<0.01）;10⁰至10^-3 PCV2感染3D4/2细胞8、12、24 h后,细胞内NO浓度及MPO活性显著提高（P<0.05）,细胞上清液中的IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ、IL-8和MCP-1水平及COX-1活性均显著或极显著升高（P<0.05;P<0.01）,其中10⁰ PCV2感染3D4/2细胞后,各炎症因子水平上升最显著,且随着时间的延长,NO浓度逐渐升高,XOD活性逐渐降低。【结论】PCV2可诱导3D4/2细胞炎症反应,且10⁰ PCV2体外感染3D4/2细胞4~12 h是建立炎症模型的最佳条件。