IBDV VP2/VP243基因DNA疫苗表达质粒的构建与表达

将传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）ＶＰ２／ＶＰ２４３插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ中,置于ＣＭＶ启动子的调控之下,构建成ＤＮＡ疫苗表达质粒ｐｃＤＮＡ ＶＰ２和ｐｃＤＮＡ ＶＰ０。分别转染ＣＥＦ细胞后,于２４、４８、７２ｈ取细胞裂解液进行ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测,ｐｃＤＮＡ ＶＰ２于转染后２４ｈ呈阳性反应,４８ｈ表达量高于２４ｈ;ｐｃＤＮＡ ＶＰ０于转染后４８ｈ呈阳性反应     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA在BHK21细胞中的表达

将组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）基因ｃＤＮＡ经多次亚克隆插入到真核表达载体ｐＳＶＬ的ＳＶ４０启动子和ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,构建了重组表达质粒ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ。分别将这２种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞,ＥＬＩＳＡ检测结果表明,ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ在哺乳动物细胞中能够表达,７２ｈ表达量分别是５２．８μｇ／Ｌ和７０．４μｇ／Ｌ。     

抗牛IgGFc受体单克隆抗体的生产与鉴定

利用阳性表达细胞和荧光激发流式细胞分类器建立了一个单克隆抗体的制备与快速鉴定系统。用克隆于表达性质粒载体ｐＣＤＭ８的牛ＩｇＧ＿１Ｆｃ受体（ｂｏＦｃγＲⅡ）ｃＤＮＡ转染ＣＯＳ７细胞并用被转染细胞作抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取免疫鼠脾细胞与ＮＳＯ浆细胞瘤细胞株融合，筛选克隆出３株分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤，即ＣＣ－Ｇ３６、ＣＣ－Ｇ３７和ＣＣ－Ｇ３９。经使用荧光激发流式细胞分类器检测，３个单克隆抗体均识别经ｂｏＦｃγＲⅡ转染的ＣＯＳ７细胞而不识别未经转染的ＣＯＳ７细胞和经牛ＩｇＧ＿２Ｆｃ受体（ｂｏＦｃγ２Ｒ）转染的ＣＯＳ７细胞。３个单克隆抗体分别为ＩｇＧ＿１（ＣＣ－Ｇ３６）、ＩｇＧ＿２ａ（ＣＣ－Ｇ３７）和ＩｇＧ＿３（ＣＣ－Ｇ３９）。本研究还用同样方法验证了单克隆抗体ＣＣ－Ｇ２４抗ｂｏＦｃγ２Ｒ的特异性。     

绿色荧光蛋白表达载体的改造和表达

为获得增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的真核表达载体pEFP-N1-MSC,并观察其在猪成纤维细胞中的表达情况,用Nhe Ⅰ和Age Ⅰ消除pEGFP-N1质粒上的多克隆位点(MSC),然后补平连接,获得增强型绿色荧光蛋白编码基因的真核表达载体pEGFP-N1-MSC质粒,将pEGFP-N1-MSC质粒转化DH5α感受态细胞,于Kanr LB平板上筛选阳性克隆.重组子经Nhe Ⅰ和Age Ⅰ双酶切鉴定,将该载体转染猪成纤维细胞,24 h后观察EGFP表达情况,48 h后添加G418进行筛选.结果表明:改造的pEGFP-N1-MSC真核表达载体,成功转染猪成纤维细胞,在倒置荧光显微镜下呈现绿色光,获得可产生绿色荧光的pEGFP-N1-MSC载体,为构建猪双正选择同源重组载体奠定了基础.     

IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建

利用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒（ｖｖＩＢＤＶ）ＨＺ株ＶＰ２基因,并对ＶＰ２基因全序列测定,序列分析和聚类分析,同时将 ＶＰ２基因与真核表达载体 ｐｃＤＮＡ３相连接。结果克隆到 ＶＰ２基因全序列共 １３５６ｂｐ,分析表明ＨＺ株与欧洲超强毒株ＵＫ６６１高度相似,同时将ＶＰ２基因正向插入ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,得到了ＶＰ２基因的真核表达质粒。为ＩＢＤＶ分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础。     

应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GPS基因

将猪繁殖与呼吸综合征症病毒ＣＨ－ａｌ株囊膜糖蛋白（ＧＰ５）一向克隆到杆状病毒转移载体ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＢ中,与太毒线性ＤＮＡ（Ｂａｃ－Ｎ－Ｂｌｕｅ＾ＴＭＤＮＡ）共转染昆虫细胞ｓｆ９,经过三轮蚀斑纯化后,获得重组杆状病毒ｒＢａｃ＝ＧＰ５。用该重组病毒感染ｓｆ９细胞后,应用间接免疫荧光试验、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表明,ＧＰ５基因在杆癍病毒系统中获得了高效表达,表达产物因糖基     

pCMV－TNFα的构建及其在动物细胞中的表达

以ＸｂａⅠ和ＥｃｏＲＶ双酶消化ｐＢＴ１获得肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）ｃＤＮＡ基因片段，以ＸｂａⅠ和ＳｍａⅠ酶切点定向克隆入质粒载体ｐＣＭＶ４，构建了人ＴＮＦα重组质粒ｐＣＭＶ－ＴＮＦα。采用ＤＮＡ—磷酸钙共沉淀法转染ＣＯＳ７和ＮＩＨ３Ｔ３细胞，收集转染后不同时间的细胞培养上清，检测ＴＮＦα的表达水平和生物学活性。ＥＬＩＳＡ检测表明，两种细胞转染后，其培养上清中均有ＴＮＦα抗原存在，而载体等对照则测不出ＴＮＦα。以Ｌ９２９细胞检测其细胞毒活性，发现ＣＯＳ７细胞于转染后４８ｈ表达水平最高，活性高达１６Ｕ／ｍＬ以上，但７ｄ时测不出ＴＮＦα活性；ＮＩＨ３Ｔ３细胞于转染后２４ｈ活性最高（８Ｕ／ｍＬ），９ｄ时尚有表达，但不足１Ｕ／ｍＬ。     

组织型纤溶酶原激活剂基因在小鼠体内的表达

将组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）基因ｃＤＮＡ经多次亚克隆插入到真核表达载体ｐＳＶＬ的ＳＶ４０启动子和ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,构建了重组质粒ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ。分别将这２种重组质粒直接注射于小鼠骨骼肌,观察了ｔ－ＰＡ基因在小鼠体内的表达情况。体外凝血试验结果显示,注射重组质粒ＤＮＡ后,第５天凝血时间有所延长,第１５～２０天达到高峰,小鼠体外凝血时间平均延长７ｍｉｎ左右,延长时间与基因注射量呈明显的正相关。     

奶牛MC4R基因真核表达载体的构建及其表达定位

奶牛黑素皮质素受体-4(MC4R)基因作为G蛋白偶联受体,是关系经济性状的重要候选基因。本研究从牛基因组中克隆得到MC4R基因的编码序列,将克隆片段与pc DNA3.1真核表达载体进行KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切,连接形成重组表达载体,将载体瞬时转染到L02肝脏细胞,采用免疫荧光对细胞进行标记,通过激光共聚焦显微镜观察荧光活性,结果发现克隆的MC4R基因序列长度大约1 000 bp,成功构建真核表达载体MC4R-3.1,将载体转染肝脏细胞后Western blot检测蛋白表达,经过激光共聚焦观察荧光后发现MC4R蛋白的绿色荧光在细胞膜上有正常表达,可为进一步研究MC4R受体基因功能提供参考。     

分子伴侣Jiv90基因的克隆及其在猪脐静脉血管内皮细胞中的表达

为研究分子伴侣Jiv90对猪瘟病毒复制的影响,克隆了分子伴侣Jiv90基因,构建了真核表达载体并在猪脐静脉血管内皮细胞中表达。根据牛的Jiv90基因序列和真核表达载体pEGFP-C1设计引物,经PCR扩增,成功克隆到猪Jiv90基因,回收后与pEGFP-C1载体连接,构建重组表达载体pEGFP-C1-Jiv90,提取质粒并采用脂质体法转染猪脐静脉血管内皮细胞。转染24 h后,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,经G418抗性筛选得到阳性克隆。本研究成功构建了pEGFP-C1-Jiv90真核表达载体,得到稳定表达Jiv90的细胞株,为今后开展分子伴侣对猪瘟病毒复制影响的研究奠定了基础。     

宿主域扩大的重组救活昆虫杆状病毒表达载体的构建及外源基因的表达

通过克隆的家蚕核多角体病毒解旋酶基因DNA与重组救活可线性化的苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒 (BacPAK6 )DNA在昆虫细胞中发生重组 ,经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf 2 1的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体 (HyBacPAK6 )。HyBacPAK6DNA经Bsu36Ⅰ酶切后与含植酸酶基因的转移载体pVL1393 phy在家蚕细胞中重组后 ,通过蓝白斑筛选发现重组率可达 90 %以上。然而以杂交病毒为载体的外源基因表达量仅为以BmNPV为载体病毒的表达量的 2 0 %左右。分析认为HyBacPAK6可用于表达一些对蚕体有害的外源基因。     

人工合成Cecropin AD基因在酵母中表达

Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 是由Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ的Ｎ 端１ １１ 位氨基酸残基和Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｄ 的Ｃ 端１２ ３７ 位氨基酸残基构成的一个杂合肽,抗菌活性高于天然抗菌肽。根据Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 的氨基酸序列,以酵母偏爱密码设计了Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因,全长１４０ｂｐ 。采用基因片段化学合成结合ＰＣＲ 法合成Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因。合成的Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因克隆到ｐＣＲＴＭ２１ 上,进行ＤＮＡ 序列测定,证实合成的Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因的ＤＮＡ 序列与设计序列完全一致。将Ｃｅｃｒｏｐｉｎ 基因定向克隆到大肠杆菌 酵母穿梭质粒ｐＣＬＷＡ２ 的Ｂａｍ ＨＩ和Ｓａｌ Ⅰ位点上,构建成含Ｃｅｃｒｏｐｉｎ 基因的重组质粒ｐＣＡＤ,将重组质粒转化入宿主酵母ＡＢ１０３ ,以大肠杆菌Ｋ１２Ｄ３１ 为指示菌,用活性蛋白酸性ＰＡＧＥ 法测定,具有抑菌活性,表明Ｃｅｃｒｏｐｉｎ 基因在酵母中获得表达。     

昆虫杆状病毒表达系统研究进展及其应用展望

昆虫杆状病毒表达系统作为四大表达系统之一,已广泛应用于重组蛋白的合成。该系统具有如多角体启动子控制下的高效表达,比较完善的转译后加工修饰,容易从无血清培养上清中纯化,无内毒素污染等特点。杆状病毒表达载体系统研究的最新进展:高强度早期启动子群杆状病毒转移载体的成功合成,以扩大寄主范围和增进重组蛋白稳定性为目的的亲本病毒的改造;通用的昆虫细胞培养基配方的不断优化,特定昆虫细胞株培养基的研制和适用于大规模悬浮培养的无血清培养基的商品化;旨在进行复杂糖基化及提供相对稳定细胞环境的宿主细胞工程;以新标记物(tag)载体和相关亲和层析方法为代表的蛋白质高效纯化方法的进步。昆虫杆状病毒表达载体系统在基础研究、医药卫生和农业上具有广阔的应用前景。     

动物转基因的整合、表达及其调控方法

本文综述了转基因在动物体内整合表达机制的研究进展,以及基因构件、调控序列、转基因拷贝数和载体序列等对转基因整合表达的调控,并对转基因技术的现状与前景做了小结和展望。     

人血小板因子Ⅳ在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达

将人血小板因子Ⅳ (HumanPlateletFactorⅣ ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK PF4,并与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,在细胞内发生同源重组 ,获得重组病毒BacPAK PF4。Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有hPF4基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕培养细胞 (2× 10 6个细胞 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的血管内皮细胞测定其生物活性 ,测得表达量在家蚕培养细胞中第 3天达到最高值为 6 0 88μg/ 2× 10 6个细胞 ;在蚕体内表达第 5天达到最高值 ,表达量明显高于家蚕培养细胞     

性别决定及SRY基因在胚胎发生中的表达

性别决定包括初级性别决定和次级性别决定。前者是由染色体决定性腺的发育方向,后者通常是指由性腺分泌的激素决定性腺以外的身体表型,即第２性征。新的研究发现,哺乳动物的雄性是由Ｙ染色体短臂上的一个被称为ＳＲＹ的基因所决定的。     

家蚕转座子表达载体pSVHK1.4的构建

研究利用PCR方法扩增黑腹果蝇 (D .melanogaster)hsp70启动子 ,然后插入到质粒pcDNA3上水母绿色荧光蛋白基因gfp的上游 ,与之顺向拼接构建成含hsp70和gfp的重组质粒pCGH。将家蚕K1 4转座子序列从pUK1 .4亚克隆到真核表达载体pSVL中PvuⅡ位点 ,获得中间载体pSK1 .4。最后将hsp70启动子和gfp报告基因的融合片段从pCGH中亚克隆到质粒pSK1 .4中K1 .4片段上的BglⅡ位点处 ,从而完成对转座子表达载体pSVHK1 .4的构建。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核蛋白基因在原核系统中的高效表达与初步应用

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH－1a株核蛋白基因克隆至原核表达载体pET30的多克隆位点中，经鉴定后得到重组质粒pET30a-N，将此重组质粒转化到受体菌BL21中，用诱导剂IPTG分别以不同浓度进行诱导，并在不同诱导时间进行采样，经处理后做SDS－PAGE、Western-blot分析，并以此为包被抗原进行ELISA检测，结果发现以终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，4小时后表达可达到高峰，其大小约为23kD，薄层扫描结果表明庐蛋白表达量约占菌体蛋白总量的32％，该蛋白不仅与PRRSV阳性血清能发生特异性反应，而且可被PRRSV抗N蛋白单抗所识别，证实此大量表达的蛋白为核蛋白。将此表达产物应用ProBond^TM纯化系统进行纯化，其纯度可达到91％，纯化后的蛋白以50μg/孔包被96孔板，检测来自不同地区送检的猪血清，同时以全病毒ELISA为对照，结果发现二者的符合率高达93．3％，而应用该蛋白进行检测其反应更为敏感，且背景低，制备过程简单，这将为今后应用该蛋白作诊断抗原检测PRRSV奠定了基础。     

伊氏锥虫HGPRT基因cDNA的克隆及其在E.coli中的表达

根据引物设计的一般原则，参照伊氏锥虫HGPRT基因的核苷酸序列设计、合成一对引物，PCR扩增伊氏锥虫HGPRT基因cDNA。低熔点琼脂糖回收：PCR产物，并将其克隆至pGEM—T Easy载体中，经酶切、PCR鉴定和序列分析，获得重组中间质粒pGEM／HGPRT。重组中间质粒pGEM／HGPRT经Nco I和Sal I双酶切，回收目的片段HGPRT，以非融合形式插入原核表达质粒pBV220构建表达质粒pBV／HGPRT，转化大肠杆菌DH5a，42℃诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳和薄层扫描分析，表达产物HGPRT的分子量约为23kD，与理论推算值相符，表达率占总菌体蛋白的19％，经间接ELISA检测，表达产物能被伊氏锥虫阳性血清所识别。     

猪传染性胃肠炎病毒核衣壳(N)蛋白基因的克隆与表达

以猪传染性胃肠炎病毒亚基因组mRNA为模板根据文献设计一对引物，通过RT－PCR技术，扩增其核衣壳（N）蛋白基因的cDNA；将其按正确的阅读框架定向克隆到表达载体pProEXHTb中特异酶切位点；将重组质粒PHN转化进大肠杆菌TG1株，在浓度为1.0mM IPTG和37℃条件下诱导，PHN基因融合蛋白获得了表达；经SDS－PAGE，Western-blot试验，确定其表达的融合蛋白产物大小为预期的47kD。试验结果证明，在大肠杆菌中表达的TGEV N基因的融合蛋白产物的确具有天然蛋白的抗原性。