辣椒环斑病毒分子检测方法的建立及应用

辣椒环斑病毒（Chilli ringspot virus, ChiRSV）是2007年在辣椒上发现的病毒新种,是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的确定种。笔者于2009年首次在海南黄灯笼辣椒上检测发现ChiRSV。根据ChiRSV保守区域设计和筛选PCR特异引物,优化退火温度,对PCR产物进行序列测定,建立了ChiRSV的RT-PCR检测方法。通过灵敏度测定,结果表明该方法最低可检出12.5 pg病毒RNA,灵敏度高。通过对来自海南田间的疑似辣椒病样的RT-PCR检测,证实了该方法有良好的反应特异性,亦表明ChiRSV可能已在海南扩散。     

海南地区番木瓜畸形花叶病毒的发现与鉴定

利用马铃薯Y病毒属的简并引物对3个海南感病番木瓜植株的叶片进行RT-PCR检测,并将其克隆到T载体上进行测序和BLAST分析。结果表明：均获得了大小约1 700 bp的特异性条带,与预期大小基本一致;所得序列与GenBank中收录的番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV）基因序列相似性达到88％～96％,序列包含部分NIb蛋白基因、外壳蛋白（CP）基因和3′端非编码区。这是首次报道在中国海南地区发现番木瓜感染了PLDMV。但是仅基于PLDMV外壳蛋白基因的系统进化分析结果还不足以证明在海南发现的PLDMV与其他地区的某一PLDMV株系为同一进化簇。     

海南岛长蒴母草和金腰箭上存在粉虱传双生病毒的侵染

从海南儋州的长蒴母草（Lindernia anagallis）上采集了呈现叶脉黄化、叶背叶脉突起的3个病样,从金腰箭（Synedrella nodiflora）上采集到叶片不均匀褪绿、叶背叶脉突起的3个病样.利用根据粉虱传双生病毒基因组DNA基因间隔区及外壳蛋白基因保守序列设计的简并引物,对这6个样品进行了PCR检测,结果发现所有样品均能扩增到预期大小的DNA片段.PCR产物经克隆后进行序列测定,BLAST结果表明,该序列为双生病毒基因组DNA序列,该2种杂草上均存在双生病毒的侵染.     

利用PCR方法从苎麻中检测出粉虱传双生病毒

从苎麻植株上采集了叶片呈现花叶和黄绿斑驳并扭曲的2个病样.用粉虱传双生病毒简并引物对2个样品进行了PCR检测,结果发现2个样品都能扩增到预期大小的DNA片段.PCR产物经克隆后进行序列测定,BLAST比对结果表明,此样品的DNA扩增片断序列与Hsinchu番茄曲叶病毒福建分离物(EF125190,EF125191)和台湾分离物(DQ866131)的同源性都为95%,推测侵染苎麻的双生病毒可能是Hsinchu番茄曲叶病毒.     

芝麻黄花叶病病原的分子鉴定

从芝麻黄花叶病株上分离得到花生条纹病毒2个分离物（Peanut stripe virus sesame isolate, PStV-se1和PStV-se2）,提取感病叶片的总RNA,RT-PCR扩增外壳蛋白基因（cp）片段。序列测定结果显示,cp基因含有861个核苷酸,编码分子量为32.4kDa的蛋白。2个株系cp基因与PStV其它株系核苷酸序列同源性为94.4%～99.9%,氨基酸序列同源性为93.7%～100%。株系间CP氨基酸序列系统进化树结果表明,芝麻分离物与中国其它寄主来源的PStV株系处于同一进化分支。     

南方番茄病毒在海南省的发生分布及全基因组序列分析

病毒病是海南番茄生产中危害最严重的病害之一,在利用小RNA深度测序技术鉴定海南番茄病毒病病原时发现,南方番茄病毒（Southern tomato virus, STV）在海南省多个市（县）的样品中存在,而且发现1株STV单独侵染的样品。为了解STV在海南省的发生分布情况,利用RT-PCR技术,对2015—2021年采自海南省的987份疑似病毒侵染的番茄叶片样品进行检测,结果表明：在9个市（县）的142份样品中检测到STV,早在2015年STV就已经在海南番茄上存在,检出率从2015年（8.82%）到2021年（22.45%）呈逐年上升趋势。同时结合RACE和RT-PCR技术扩增到4个STV海南分离物的全长基因组,长度均为3446 nt,包含2个部分重叠的ORFs,ORF1(147～1280 nt)和ORF2(1048～3336 nt)分别编码p42蛋白（377 aa）和RdRp蛋白（762 aa）,5′UTR和3′UTR的长度分别为146 nt和110 nt。序列一致性分析表明,4个STV海南分离物间基因组序列一致性为99.86%～100.00%,与目前GenBank公布的所有STV分...     

马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的克隆及全序列测定

自田间采集的马铃薯病叶中提取马铃薯Y病毒 (PVY)总RNA ,人工合成引物P1、P2 ,通过RT PCR扩增合成PVY cp的cDNA ,并将其克隆到 pGEM TEasy载体上。经限制酶谱分析后进行全序列测定 ,结果表明 :该基因由 80 1个核苷酸组成 ,编码 2 67个氨基酸 ,与文献报道的 3个PVY cp基因相比同源性均在 90 %以上 ,且其编码的氨基酸同源性均在 94 4 %以上。说明PVY cp基因具有较高的保守性     

花生条纹病毒（红安分离物）cp基因的克隆和序列分析

从湖北省红安县花生种传苗中得到花生条纹病毒（Peanut stripe virus, PStV）分离物（PStV-Hongan），提取感病叶片的总RNA，RT-PCR扩增了其外壳蛋白基因（cp），克隆至pGEM-Teasy载体，转化大肠杆菌并鉴定。阳性质粒序列测定结果表明，该cp含有861个核苷酸，编码分子量为32.4kDa的蛋白。该株系cp与PStV其它株系核苷酸序列同源性为94.6%~98.8%，氨基酸序列同源性为96.2%~99.3%。株系间cp核苷酸序列系统进化树结果表明，Hongan株系与中国其它株系亲缘关系较近，而与东南亚其它株系关系较远。     

台湾甜椒种子中辣椒轻斑驳病毒检测及其致病型鉴定

利用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和基因序列分析法对一批台湾进境的辣椒种子进行病毒检测及致病型鉴定,同时使用特征序列扩增区域(SCAR)标记引物利用PCR方法对该辣椒品种进行L抗性基因检测。DAS-ELISA及RT-PCR结果表明,从该批种子中检测到辣椒轻斑驳病毒(Peppe rmild mottle virus,PM MoV)。PCR产物测序分析表明,该序列为PM MoV的外壳蛋白(CP)基因,与已报道的PM MoV序列同源性为92.4%～99.8%。CP蛋白氨基酸序列分析表明,该分离物(命名为TW分离物)属于PM MoV的P1,2,3致病型。抗性基因检测表明,该辣椒品种携带有L3抗性基因。TW分离物能够系统侵染该辣椒品种,意味着该分离物已经克服L3基因介导的抗性。本研究报道的PM MoV的P1,2,3致病型在中国大陆尚属首次,这对于抗病辣椒品种的选育具有重要的指导意义。     

河北省藁城花生病毒病的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析

采用RT-PCR技术对采自河北省农林科学研究院粮油作物研究所藁城堤上试验基地的12份花生叶片样品进行花生病毒病的检测,结果表明:从表现花叶和矮化症状的10份样品中检测到花生条纹病毒(peanut stripe virus,PStV),检出率高达90%,未检测到花生矮化病毒和黄瓜花叶病毒;对其中2个PStV分离物cp基因序列分析的结果表明,该cp全长864 bp。这两个分离物与已报道的PStV其他株系的cp核苷酸序列相似性分别为94.4%~99.2%和94.7%~99.7%,氨基酸相似性分别为95.5%~99.7%和95.8%~100.0%。PStV cp核苷酸序列构建的系统进化树中,这两个分离物与中国大陆其它分离物及美国分离物亲缘关系较近,而与中国台湾、泰国和越南分离物亲缘关系较远。     

海南长春花变叶病病原物的分子鉴定

本研究分别利用植原体16S rDNA和核糖体蛋白(ribosomal protein,rp)基因的通用引物对自然表现变叶症状的海南长春花样品总DNA进行PCR扩增,获得16S rDNA基因片段长为1 432 bp,rp基因片段长为1 211 bp。BLAST程序比较、系统进化树构建及iPhyClassifier分析表明:海南长春花变叶病是由植原体引起的,该植原体株系属于16S rⅠ-B亚组,与候选种Ca.Phytoplasma asteris相关,将其暂命名为长春花变叶病植原体海南株系(Periwinkle phyllody strain Hainan,PP-Hn)。     

海南黄灯笼辣椒顶死病病原病毒的分离鉴定

从海南省黄灯笼辣椒顶死病株上分离纯化得到一个病毒分离物.研究结果表明,该病毒分离物能通过汁液磨擦接种侵染供试植物中的4科11种植物,可由桃蚜传播;提纯病毒粒子呈球形,直径28～30 nm,外壳蛋白分子量约为28 ku;分离物与CMV抗血清在ELISA测定中呈阳性反应;提取病毒分离物RNA,应用RT-PCR方法克隆了病毒外壳蛋白（CP）基因.CP基因675 bp,编码218个氨基酸.对CP基因序列分析表明,该病毒分离物的CP基因核苷酸序列与黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ分离物的同源性均在92.1%以上,所推导的氨基酸序列同源性在96.3%以上,而与亚组Ⅱ分离物的核苷酸序列同源性均低于77.3%,所推导的氨基酸序列同源性均低于80.7%.据此将该病毒分离物鉴定为黄瓜花叶病毒,归属于亚组Ⅰ.     

应用RT-PCR技术检测马铃薯A病毒

参考GenBank中马铃薯A病毒(potato virus A,PVA)的保守序列,利用Primer6.0引物设计软件设计并合成了一对特异性引物PVAF、PVAR,以此引物利用RT-PCR方法对PVA保守序列基因进行了特异性扩增。结果表明:引物PVAF、PVAR能从已知的感染PVA病毒的植株中扩增出834bp的cDNA特异性片段;该RT-PCR的检测灵敏度为1pg的病毒核酸,特异性强,重复性好,可用于PVA病毒的快速检测。     

马铃薯卷叶病毒CP基因的RT-PCR扩增

根据马铃薯卷叶病毒CP基因的序列设计合成了两对特异性DNA引物,用RNA提取试剂RNAplant从感病的马铃薯叶片中提取总RNA,在3′引物引导下以总RNA为模板反转录合成cDNA第一链,然后进行PCR,分别扩增出了长627 bp和336 bp的特异性PCR产物,其大小与预期的CP基因及其部分序列一致,实现了马铃薯卷叶病毒CP基因及其片段的简便、有效的RT-PCR扩增。     

一步法RT-PCR扩增PRSV海南分离物全长基因组cDNA

以植物总RNA提取试剂盒提取的高纯度的总RNA为模板,使用Oligo dT-Adaptor和Random9引物合成了番木瓜环斑病病毒海南分离物(PRSV HN-2)的cDNA第一链,基于已报道的PRSV全长基因组序列,设计合成了一对引物,一步法RT-PCR扩增出PRSV海南分离物全长基因组cDNA。为了验证获得的全长基因组cDNA的正确性,并以扩增出的全长cDNA为模板,将PRSV全长基因组分成A、B 2个大片段进行扩增,应用T载体进行克隆和测序以验证所获得的全长基因组cDNA序列的正确性。测序结果显示,该cDNA序列与国内外报道的PRSV各分离物全长核苷酸序列的相似性很高,表明本文建立的一步法RT-PCR扩增PRSV全长基因组cDNA的方法正确、可行。     

马铃薯X病毒外壳蛋白基因的克隆及其原核表达载体的构建

将来源于国际马铃薯中心 (InternationalPotatoCenter ,ClP)PVX病毒毒源接种至烟草上 ,对表现明显症状的烟草叶片提取马铃薯病毒X (PVX)总RNA ,人工合成引物P1、P2 ,通过RT PCR扩增合成PVX cp的cDNA ,井将其克隆到pGEM T载体上。经限制酶谱分析后进行全序列测定 ,结果表明 :该基因由 714个核苷酸组成 ,编码 2 38个氨基酸 ,与文献 (分别来源于亚洲、非洲和欧洲 )报道的 4个 pVX cp基因相比同源性为 81%～ 95 % ,其编码的氨基酸同源性均在 90 %以上。说明PVX cp具有较高的保守性。用内切酶将PVX cp基因自克隆载体 pGEM切下 ,定向插入到表达质粒 pBV2 2 0的启动子Pr、Pl的下游 ,构建了该基因的原核表达载体pBV pvx ,为进行该基因的原核表达和抗血清的制备奠定了基础。