马铃薯S病毒的RT-PCR检测

根据马铃薯S病毒(PVS)的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物。以感染PVS的马铃薯组织和健康的组织为材料,对提取植物总RNA的两种方法进行了比较,并对总RNA的提取方法进行改进,获得了纯度较高,完整性较好的总RNA。以此为模板,进行cDNA合成及PCR扩增,从感病组织扩增得到一段长度约642bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而健康组织无此扩增产物。从而建立了检测PVS快速灵敏简便的新方法,在基因水平上为PVS的检测提供了新手段。     

应用PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌

根据马铃薯环腐病菌16SrDNA基因片段核苷酸序列设计引物(引物1∶5-′TGTACTCGGCCAT-GACGTTGG-3′和引物2∶5-′TACTGGGTCATGTTGGT-3)′,进行马铃薯环腐病菌PCR特异性扩增试验。合成的引物能从马铃薯环腐病菌总基因组DNA和细菌纯培养,以及人工接种和自然发病的马铃薯块茎中特异性扩增环腐病菌16SrDNA基因片段1046bp。该试验结果为马铃薯环腐病的鉴定、检测及病害流行学研究提供了新的技术和方法。     

马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的克隆及全序列测定

自田间采集的马铃薯病叶中提取马铃薯Y病毒 (PVY)总RNA ,人工合成引物P1、P2 ,通过RT PCR扩增合成PVY cp的cDNA ,并将其克隆到 pGEM TEasy载体上。经限制酶谱分析后进行全序列测定 ,结果表明 :该基因由 80 1个核苷酸组成 ,编码 2 67个氨基酸 ,与文献报道的 3个PVY cp基因相比同源性均在 90 %以上 ,且其编码的氨基酸同源性均在 94 4 %以上。说明PVY cp基因具有较高的保守性     

马铃薯接骨木镰刀菌的分子检测

接骨木镰刀菌是马铃薯干腐病的主要致病菌,给黑龙江省马铃薯造成了一定的经济损失。采用马铃薯干腐病引物LDJ1对马铃薯干腐病、马铃薯晚疫病、马铃薯早疫病、马铃薯黑痣病的致病菌的ITS序列进行测定,只有马铃薯干腐病菌扩增出560 bp特异性片段。再分别对接骨木镰刀菌、燕麦镰刀菌和茄病镰孢变种的ITS序列进行BLAST比对分析,针对接骨木镰刀菌设计了特异引物L2,扩增特异性产物为278 bp,该引物所建立的PCR检测体系可检测DNA含量在50 pg/μL以上的目的基因。     

马铃薯PVY和PLRV病毒的TC-RT-PCR检测

传统的RT-PCR技术检测病毒需提取总RNA,RNA容易降解。利用试管捕捉反转录扩增(Tube cap-ture RT-PCR,TC-RT-PCR)方法检测了PVY和PLRV 2种病毒,实现了不需提取总RNA也可在同一反应中同时检测2种病毒。根据已报道的引物用TC-RT-PCR的方法对PVY和PLRV的外壳蛋白基因进行了检测。结果表明,TC-RT-PCR能够成功的检测出感染PVY或PLRV以及2种病毒共同侵染的样品,扩增产物序列长度均与设计片段的长度相符,分别为781和364 bp,2种病毒扩增产物的测序结果同Gene Bank中已知的序列比对后的同源性均高达97%以上。该技术为单独或复合感染的马铃薯病毒的检测提供了更加方便、高效的方法。同时测得试验PVY病毒样本属于PVYNW株系。     

应用RT-PCR技术检测马铃薯A病毒

参考GenBank中马铃薯A病毒(potato virus A,PVA)的保守序列,利用Primer6.0引物设计软件设计并合成了一对特异性引物PVAF、PVAR,以此引物利用RT-PCR方法对PVA保守序列基因进行了特异性扩增。结果表明:引物PVAF、PVAR能从已知的感染PVA病毒的植株中扩增出834bp的cDNA特异性片段;该RT-PCR的检测灵敏度为1pg的病毒核酸,特异性强,重复性好,可用于PVA病毒的快速检测。     

基于CHD基因利用PCR技术进行鸡早期性别鉴定

为建立鸡早期性别鉴定的快速方法,根据鸡CHD基因在性染色体Z和W上的序列长度差异,从鸡血样中提取基因组DNA,利用2550F/2718R和SF/SR引物分别对鸡CHD基因片段进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。引物2550F/2718R 的PCR扩增结果显示,公鸡为1条带,约600 bp,母鸡为2条带,分别约为600 bp和450 bp;引物SF/SR PCR扩增结果显示,公鸡为1条带,约500 bp,母鸡为2条带,分别约为500 bp和350 bp;两对引物扩增的条带清晰明亮,特异性强,鉴定的     

应用RT-PCR检测水仙潜隐病毒

根据已报道的水仙潜隐病毒(Narcissus latent virus,NLV)外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列,设计一对特异性引物,以提取的水仙样品总RNA为模板进行RT-PCR,并进行特异性和灵敏度测定。结果表明,此法能够从携带NLV的水仙样品中成功扩增出大小约829 bp的特异性目的片段,具有良好的特异性和较高的灵敏度,可有效地应用于水仙样品中NLV的检测。     

马铃薯Y病毒一步RT-PCR检测试剂盒的研制

马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)对马铃薯的危害最大,可导致马铃薯退化,降低马铃薯产量。解决这一问题的重要途径就是培养脱毒种薯,但是否完全脱毒需要经过检测才能证实。本研究依据PVY CP基因序列设计合成了一对引物PY1、PY2,以带毒样品植物总RNA为模板,在同一个反应中同时加入反转录和PCR反应所需试剂,反应程序中包括反转录和PCR反应所需条件,进行反应扩增,带毒样品扩增得到340 bp的目的条带,而健康对照无此目的条带,从而建立了PVY的一步RT-PCR检测技术,并组装成试剂盒。该试剂盒具有良好的稳定性和特异性,灵敏度可以检测到带毒植物组织下限的6.25μg,高于ELISA(100μg)和NASH(15μg)的灵敏度,虽然和常规方法的灵敏度相同,但更为快速、简便、易于操作,适合脱毒苗和脱毒种薯生产单位做大量样品的检测。     

延安地区马铃薯纺锤块茎类病毒的RT-PCR检测与序列分析

以陕西省延安地区8个乡镇种植2～3代的马铃薯叶片为材料,Trizol法提取马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）基因序列设计合成特异引物,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增目的基因片段并电泳检测,回收纯化目的片段,然后进行克隆和测序,采用DNAstar软件分析序列一致性.结果显示：在马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致的目的片段,表明这些乡镇的马铃薯均感染了PSTVd,8个采样点PSTVd的目的片段大小为247～251bp,出现少量碱基的突变或缺失,说明PSTVd在延安地区部分乡镇发生了一定程度的变异,与国内外其他14个地区之间的序列一致性为804% ～992%.     

茶树巯基蛋白酶抑制剂基因的cDNA克隆与序列分析

对多种已知植物巯基蛋白酶抑制剂(cystatin)基因的氨基酸序列进行比对分析,根据其高度保守的氨基酸序列设计一对简并引物,并从茶树品种龙井43鲜叶中提取总RNA,用RT-PCR法扩增出一204bp的cDNA特异片段,然后通过3’/5’RACE的方法,分别扩增出3’端和5’端的序列,从而获得茶树巯基蛋白酶抑制剂基因的cDNA全长序列,所得序列全长627bp,编码101个氨基酸,分子量约11.062KDa。该基因在推测的氨基酸序列中含有巯基蛋白酶抑制剂家族中高度保守的、与其活性有关的QXVXG结构,且经Blast分析表明,该基因序列与其他植物巯基蛋白酶抑制剂基因的氨基酸序列同源性为54%~77%。     

Inverse PCR法快速测定转基因马铃薯中T-DNA的拷贝数

利用Inverse PCR技术分析原生质体途径导入PLRV-CP基因的马铃薯转基因后代T-DNA拷贝数,结果与Southern Blot相同。经RT-PCR分析,低拷贝数的转基因后代显阳性反应,多拷贝数的显阴性反应,说明T-DNA多拷贝数影响外源基因的表达。Inverse PCR技术能为早期快速准确预测转基因植株中外源基因的T-DNA拷贝数,排除多拷贝重复串联序列诱导的外源基因沉默植株,为获得稳定表达的转基因株系提供有效方法。     

大豆乙酰羟基酸异构还原酶基因GmAHRI的克隆与分析

基于电子克隆获得的大豆GmAHRI基因cDNA序列编码区设计特异引物,以高异亮氨酸大豆品种“和龙早熟豆”总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1764 bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定.测序结果显示:GmAHRI基因家族有2个成员,分别命名为GmAHRI1( FJ594399.1)和GmAHRI2( JN...     

大豆天冬氨酸途径关键酶基因GmASADH的克隆与分析

本研究基于电子克隆获得的大豆GmASADH 基因cDNA序列,根据其编码区设计特异引物,以大豆品种小鹦哥豆总RNA为模板,通过RT-PCR 获得了约1130bp的cDNA片段,T/A 克隆后进行序列测定。测序结果显示,GmASADH基因家族有两个成员,命名为GmASADH1（FJ581425）和GmASADH2（HM015631）。GmASADH1编码区长度为1134bp,编码378个氨基酸,由7个外显子和6个内含子构成,定位于Gm08染色体。GmASADH2编码区长度为1131bp,编码377个氨基酸,由7个外显子和6个内含子构成,定位于Gm05染色体。两个基因在氨基酸水平上的相似性达到了96.02%,在二级及三级结构上均有不同程度的差异。ASADH蛋白含有NADB_Rossmann superfamily和Semialdhyde_dhC superfamily结构域。     

Development of Bt transgenic potatoes for effective control of potato tuber moth by using cry1Ab gene regulated by GBSS promoter

Transgenic of Indian potato cultivar Kufri Badshah expressing synthetic, modified cry1Ab gene were developed against potato tuber moth (Phthorimaea opercullela Z.) a destructive pest. The cry1Ab gene was in spatial and temporal expression under the control of tuber-specific GBSSi promoter. The transformation vector pBinCG1 was developed harbouring transgene expression cassette comprising cry1Ab gene under the control of potato GBSSi promoter, castor bean catalase intron (5′UTR) and OCS termination signals. Selected kanamycin-resistant putative transformed potato lines were evaluated by positive PCR amplification of 713 bp, 1206 bp and 700 bp with npt II, GBSSi promoter and cry1Ab gene specific primers, respectively. Gene integration in transformed potato plants was elucidated through Southern hybridization and in planta transgene expression analysis. Transgene expression was highest in stolons, followed by tubers matured leaves and young leaves. Insect bioassay of stored transgenic tubers resulted in significant retardation and mortality in neonate tuber moth larvae. RT-PCR and northern hybridization confirmed stable expression in stored tubers. These transgenic lines; thus can represent an effective resistance management strategy which can significantly reduce the selection pressure on target and non-target insect pests to a threshold level.     

栽培大豆Rubisco小亚基基因（rbcS）全长cDNA的克隆及原核表达

根据NCBI中发表的大豆Rubisco小亚基基因（rbcS）序列（AF303939-1）设计特异引物,以吉农13大豆为实验材料,采用Trizol法提取叶片总RNA,通过RT-PCR克隆大豆rbcS的cDNA。将该基因与原核表达载体pET-30a（+）连接,转化大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,双酶切鉴定后筛选阳性克隆,测序结果显示：rbcS全长 696bp,其中开放阅读框为537bp,编码178个氨基酸;选择含大豆rbcS cDNA阳性克隆菌液IPTG诱导,经SDS-PAGE分析,诱导表达出分子量为29.1kDa的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符。诱导7h蛋白表达量最高,为64.15%。