巴西橡胶树HbMYC1基因的克隆及序列分析

从GenBank中搜索到1条来自橡胶树的MYC(Myelocytomatosis)家族基因EST序列,以该序列为保守区,通过RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,共1817bp。通过BLAST工具搜索GenBank数据库,结果表明,该cDNA序列同其他植物的MYC家族基因高度同源,认为该cDNA序列为橡胶树MYC家族成员。利用GenScan和Clastal X对该序列进行分析,推测其编码区长度为1428bp,编码476个氨基酸。生物信息学分析结果表明,巴西橡胶树的MYC基因编码的氨基酸序列与其他物种的相似性很高,同时推导的蛋白质序列中还存在着1个螺旋-环-螺旋的DNA结合区域和1个核定位信号,表明克隆到的基因是1个MYC家族成员的转录因子。     

甘蔗可溶性酸性转化酶基因的克隆及序列分析

可溶性酸性转化酶在植物糖代谢中起着关键作用,为了研究甘蔗中可溶性酸性转化酶,利用电子克隆与RT-PCR方法从甘蔗中分离出1个甘蔗可溶性酸性转化酶基因DNA及cDNA序列,DNA序列长度为3 266 bp,含有3个外显子和2个内含子,cDNA序列长度为1 890 bp,包含1 656 bp的完整开放阅读框,编码551个氨基酸。BLASTX分析显示,该蛋白与其它植物已知的酸性可溶性蔗糖转化酶具有很高的同源性,推测该蛋白为可溶性酸性转化酶。预测甘蔗SAI家族可能只有1个基因,这可能与其大量积累蔗糖的能力有重要关系。     

白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶基因PDS3的克隆与序列分析

利用电子克隆技术,从数据库中找到与拟南芥高度同源的油菜EST序列,继而通过RT-PCR和RACE等方法,成功克隆了白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶（类胡萝卜素合成途径中的一个关键限速酶）基因PDS3的cDNA,命名为BrPDS3（GenBank 登记号GQ200741）。cDNA序列全长1940bp,其中包含114bp的5’前导序列和134bp的3’不翻译序列,编码区长度为1 692bp,编码63kD的蛋白。序列分析表明,BrPDS3蛋白与其他植物的PDS蛋白具有较高相似性;在系统进化树中,BrPDS3与甘蓝亲缘关系最近。根据全长cDNA序列设计引物,从白菜型油菜青油13号DNA中克隆得到BrPDS3基因的全长DNA,长度为3 911bp,ORF（开放阅读框）1 692bp,含有15个外显子和14个内含子。     

茶树CsASR基因的克隆及其表达分析

逆境胁迫影响茶树生长发育及茶叶品质,ASR(abscisic acid,stress,ripening-induced)基因在植物抗逆响应中具有重要功能。本研究以龙井43品种茶树为材料,从中克隆了CsASR基因的全长cDNA序列、基因组序列及其启动子序列,分析了该基因的生物信息学特征及在组织间和不同胁迫处理下的表达模式。结果显示,CsASR的cDNA序列全长875 bp,含有546 bp的ORF序列,编码181个氨基酸,蛋白质分子量19.89 kD,理论等电点5.69;CsASR蛋白结构序列中74.5%的序列为无序结构,是一种无序蛋白;CsASR的C-端含有ABA/WDS功能结构域,主要定位于细胞质和细胞核中;茶树CsASR与海枣的ASR相似性最高,为87%,而在进化树中与枣的关系最近。CsASR基因含2个外显子,第1个外显子长363 bp,第2个外显子长183 bp,内含子较大为2 750 bp,内含子中含7种简单重复序列和2种DNA转座子序列。克隆获得起始密码子ATG上游2 554 bp的启动子区序列,该启动子上含有干旱、低温、高温以及ABA等相关的顺式作用元件。CsASR在根中的表达量最低;ABA抑制CsASR的表达,而干旱、NaCl和低温胁迫能够显著上调CsASR的表达。表明CsASR基因可能与茶树抗逆密切相关。     

大豆△~1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因GmP5CS1和GmP5CS2的克隆与过表达载体构建

利用同源克隆方法从强耐旱栽培大豆(Glycine max)品种齐黄22中克隆得到2个编码大豆△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)的基因,分别命名为Gm P5CS1和Gm P5CS2。氨基酸序列分析发现,Gm P5CS1包含1个长度为2 163 bp的ORF,编码720个氨基酸,等电点p I为6.70,分子量大小为78.38 k Da;Gm P5CS2包含1个长度为2 271 bp的ORF,编码756个氨基酸,等电点p I为6.10,分子量大小为82.18 k Da。与NCBI公布的部分物种蛋白质序列比对发现,Gm P5CS1与紫花苜蓿(Medicago sativa)的亲缘关系最高,Gm P5CS2与豇豆(Vigna unguiculata)的亲缘关系最高。组织表达分析表明,Gm P5CS1与Gm P5CS2基因在大豆的各个组织中均有表达,其中叶和根中的表达量相对较高,茎中表达量次之,花和籽粒中的表达量相对较低。利用Gateway技术得到植物过表达载体p Earley Gate103-Gm P5CS,再转入根癌农杆菌EHA105中,为Gm P5CS基因的转化及功能分析奠定了基础。     

大豆GmNAC115基因克隆及特征分析

NAC转录因子在植物发育和逆境应答中具有重要的作用。本研究从大豆中克隆了1个NAC基因GmNAC115。该基因c DNA全长1 383 bp,开放阅读框长912 bp,编码303个氨基酸,预测分子量约为34.278 k D,p I8.37。推测的氨基酸序列中含有1个高度保守的NAM结构域。Gm NAC115基因组包含3个外显子和2个内含子。进化树分析发现Gm NAC115和Pv NAC为1个分支。转录活性分析结果表明,Gm NAC115转录因子具有转录激活功能。SDSPAGE电泳分析表明,p ET-28a-Gm NAC115最佳诱导表达条件为在37℃下1.0 mmol·L-1IPTG诱导2 h。组织特异性表达模式分析表明在检测的所有组织中Gm NAC115都有表达,在根中表达量最高,在种子中表达量最低。     

南农87C-38大豆优质11S球蛋白Gy7基因克隆及序列分析

大豆种子不仅富含蛋白质,而且赖氨酸含量较高,利用大豆高赖氨酸基因能够弥补谷类作物种子赖氨酸含量的不足.运用现代分子生物学技术,从高蛋白大豆南农87C-38中克隆11S球蛋白Gy7全基因及cDNA序列.经生物公司测序后,利用vector NTI软件将所克隆的Gy7全基因及cDNA序列与Genbank(AF319776和AF319777)报道的序列进行比对分析,同源性分别为99%和99.6%.序列比对结果显示,Gy7基因cDNA与Genbank报道的序列之间所有的核苷酸差异都位于第3外显子.由此推测,第1、第2和第4外显子编码的氨基酸对于G7多肽形成特定高级结构可能具有非常重要的作用,它们在进化过程中受到的选择压力可能比第3外显子更强.根据遗传密码表推测,克隆的Gy7与Genbank报道的cDNA序列所编码的多肽,两者存在2个氨基酸组成的差异.大豆球蛋白Gy7优质基因的获得为今后利用转基因技术改良水稻、小麦等谷类作物的营养品质奠定了基础.     

橡胶树5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的克隆及其响应非生物胁迫的表达分析

5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPs)是植物合成芳香族氨基酸的一个重要酶,与许多抗逆相关的次生代谢物的合成有关.本研究利用RACE技术从橡胶树热研7-33-97中获得了全长为2025 bp的HbEPSPS基因cDNA序列,开放阅读框为1572 bp,编码523个氨基酸;使用ProtParam tool预测该基因编码的蛋白质分子量为56.01u,等电点(pI)为7.91.该基因由8个外显子和7个内含子构成,全长4600 bp.实时荧光定量PCR结果表明,HbEPSPS基因在橡胶树叶片、皮、花、胶乳和胚中均表达,其中以叶片中的表达量为最高.激素、干旱、盐和低温等非生物胁迫都能诱导HbEPSPS基因表达量上调,其中茉莉酸甲酯、乙烯和PEG的上调作用最为显著.橡胶树HbEPSPS基因的克隆及其在非生物胁迫下的表达调控研究将为橡胶树抗逆相关的研究提供理论依据.     

玳玳花瓣脂氢过氧化物裂解酶基因cDNA的克隆及原核表达

以玳玳花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术,克隆了玳玳HPL基因cDNA全长,全长为1 776 bp,其中包含52 bp的5′非编码区,224 bp的3′非编码区,1 500 bp的编码区(编码499个氨基酸,分子量为55.7 ku)。将该HPL基因cDNA编码区的核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与其他植物的HPL基因cDNA序列进行比较,推断玳玳花瓣HPL属于13-HPL类。通过PCR扩增得到了玳玳HPL基因组全长。测序结果显示玳玳HPL基因中包含1个长2 374 bp的内含子。将分离出来的玳玳HPL基因cDNA的编码区序列插入pET-15b载体上构建原核表达载体,在细菌BL21细胞中进行原核表达。结果表明:该编码区片段可在原核细胞中大量表达,其表达产物分子量大小约为55 ku,与13-HPL蛋白的分子量55.7 ku相符。本研究为下一步利用HPL基因cDNA进行遗传转化研究奠定基础,将为花卉香味的遗传改良提供一条新途径。     

荔枝古树胚性愈伤组织Fe-SOD成员基因克隆及生物信息学分析

为了解Fe-SOD在荔枝古树胚性愈伤组织保存中的分子机制,选择荔枝古树"宋荔"花药诱导而来的胚性愈伤组织为试验材料,采用同源克隆和RACE方法,获得荔枝Fe-SOD的两个转录本和基因组序列,并对该基因组的内含子进行分析。克隆获得长1 285 bp含有完整开放阅读框的荔枝Fe-SOD核酸序列,其编码1个含有250个氨基酸的蛋白质,将该序列命名为LcFe-SOD7a。生物信息学分析结果表明:该蛋白为稳定的、亲水的、含跨膜结构域的偏酸性蛋白质,定位于微体(过氧化物酶体)和细胞质,具有多样的磷酸化位点。LcFe-SOD7a基因组序列长2 284 bp,含7个内含子,其中第4个内含子较长,达920 bp。同时还得到其中的1条内含子驻留型可变剪接基因,该可变剪接基因提前终止,仅编码207个氨基酸的蛋白质,将该可变剪接基因命名为LcFe-SOD7b。     

烟草伤诱导型过氧化物酶基因(tpoxN1)启动子的克隆及分析

利用GenomeWalker的方法获得了烟草伤诱导过氧化物酶基因(tpoxN1)的5’调控序列,序列分析表明,烟草的tpoxN1基因的转录起始位点(tspA)的保守序列5’TCAATCA与其它植物基因非常一致,转录从tsp下游79bp处开始。在邻近5’区域,发现下列5个真核生物顺式调控元件:在-28bp处存在TATAbox序列(TATAAATATGT);在-66bp处具有TCCAAT序列,与众多高等真核生物的启动子的‘CAAT’相似;在-204,-749处发现有TCA-like序列;在-840处存在GC-box;在-1005处存在CCAAT-box。      

大豆乙酰羟基酸异构还原酶基因GmAHRI的克隆与分析

基于电子克隆获得的大豆GmAHRI基因cDNA序列编码区设计特异引物,以高异亮氨酸大豆品种“和龙早熟豆”总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1764 bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定.测序结果显示:GmAHRI基因家族有2个成员,分别命名为GmAHRI1( FJ594399.1)和GmAHRI2( JN...     

茶树根际土壤真菌ALF-1(Neurospora sp.)耐酸铝基因片段克隆

采用rt-PCR克隆了茶树根际土壤耐酸铝真菌ALF-1(Neurospora sp.)与耐酸铝相关的基因片段,该片段由ALF-1在酸铝诱导条件才表达。序列分析后获得359 bp的可读片段,最大开放阅读框为260 bp,位于第100-359 bp之间,编码86个氨基酸残基。BLAST分析结果表明,该片段与Arabidopsis thaliana (thale cress)的耐酸铝相关基因序列同源性为50%。     

花生查尔酮异构酶基因的克隆及其序列分析

利用RT-PCR及RACE技术从花生种子中克隆得到查尔酮异构酶基因(chi)的cDNA全长序列,命名为Ahchi,NCBI登录号:JN412735,该序列全长共1 061 bp,编码209个氨基酸,其氨基酸组成与其它已知的高等植物具有很高的同源性,与大豆、倒捻子、蓖麻、毛果杨的同源性分别为81%、71%、70%和69%,且含有高度保守的活性位点。     

茶树根系Actin基因克隆及表达分析

采用SSH技术分析了VA菌根处理后福鼎大白茶根系基因差异表达情况,获得了差异序列,序列比对显示,在下调表达序列中可能包含了10种未知功能的基因;在上调表达序列中可能包含了5种可能的基因。采用RACE技术获得了Actin基因全长序列,Actin基因长1β606βbp (GenBank, 登录号KJ946252),具有1β131βbp开放阅读框（1^st~1β131^st）,编码377个氨基酸。分子生物信息学分析表明,Actin蛋白分子量约30.69βkD,等电点为5.27,定位于细胞核等亚细胞区位。研究还显示,Actin在不同品种中表达无显著差异,对非生物性胁迫响应也较弱。     

无核荔枝凝集素基因的克隆与表达分析

应用PCR技术克隆了无核荔枝凝集素(LcLec)基因的部分cDNA(JF920723)和gDNA(JF920724)序列,序列分析表明,获得的cDNA序列含有一个468 bp的完整开放读码框结构,编码含155个氨基酸残基的多肽序列,该氨基酸残基序列与木菠萝家族的甘露糖结合凝集素同源。获得的gDNA序列含有3个内含子,长度分别为124、108和119 bp。荧光定量PCR结果表明,LcLec基因的表达量在无核荔枝果皮发育前期上升,之后下降至稳定水平;在采后果皮衰老阶段,随果皮褐变指数上升LcLec基因表达量上升。     

香蕉Actin1启动子的分离及启动活性的分析

从香蕉基因组DNA中分离香蕉Actin1启动子序列，序列测定结果表明，该片段1253bp，包含完整的G-box和TATA box，5’非翻译区和其下游的内含子，与文献报道序列的同源性达97．53％。以全长序列取代植物表达载体pCAMBIA3300上的35s启动子序列构建成瞬间表达载体pCAMBIA—Act1，以内含子序列Hind Ⅲ和XbaⅠ双酶切片段（584bp）取代植物表达载体pBI121上的35 S启动子，构建成瞬间表达载体pBI121-Act1-1。采用基因枪法对香蕉根、叶和果实的薄片进行转化，转化材料经培养3h，采用分光光度法测定各组织GUS的活性。结果表明，Actin1启动子在所转化的3种组织中均可启动报告基因的表达，表达活性与35 S启动子接近，具有组成型表达的特点。内含子部分序列（584bp）也具有启动活性，但启动活性较低。     

木薯苹果酸脱氢酶基因克隆和表达分析

为从木薯块根中获得苹果酸脱氢酶(MDH)基因,并研究其在转录水平的表达变化规律,利用RACE技术从木薯“华南8号”块根中克隆得到了苹果酸脱氢酶基因,其cDNA全长1 175 bp,包含999 bp的开放阅读框,共编码332个氨基酸.从木薯“华南8号”中获得的MDH氨基酸序列,与其它物种的该序列相似度达84％～94％,包含细胞质苹果酸脱氢酶中高度保守的NAD结合基元“TGAAGQI”和催化基元“IWGNH”.木薯MDH基因与块根淀粉合成相关,在块根发育前期表达量较低,膨大期表达量较高,膨大后期表达量逐渐降低.     

茶树GAGP基因克隆及表达分析

采用SSH技术分析了VA菌根处理后福鼎大白茶根系基因差异表达情况,获得了差异序列,序列比对显示,在下调表达序列中可能包含了10种未知功能的基因;在上调表达序列中可能包含了5种可能的基因。采用RACE技术获得GAGP基因长3β146βbp（GenBank,登录号KJ946251）,具有2β769βbp开放阅读框（1^st~2β769^th）,编码923个氨基酸。分子生物信息学分析表明,GAGP蛋白分子量约106.9βkD,等电点为8.42,定位于线粒体内。定量PCR分析表明,GAGP在茶树叶片中表达强度存在明显的品种差异,GAGP对生物性和非生物性胁迫均有明显响应。