大豆花叶病毒5个分离物的鉴定及外壳蛋白序列分析

通过生物学纯化与血清学鉴定(ELISA)得到5个大豆花叶病毒(SMV)分离物,利用RT-PCR法扩增其外壳蛋白(CP)基因片段并进行测序,结果表明:5个分离物CP基因全长均为795个核苷酸,编码产生265个氨基酸.同源性分析表明,5个分离物核苷酸序列同源性为91.1%～97.1%,由此推导的氨基酸序列同源性为98.1%～99.2%.结合5个分离物在8个大豆品种上的致病性反应得出,5个分离物在8个鉴别寄主上的致病性反应和序列差异的比较表明,分离物在8个鉴别寄主上致病性反应相差越大,其CP基因氨基酸序列差异就越大,由此证实SMV的CP基因与致病性反应之间有一定的联系.     

海南黄灯笼辣椒顶死病病原病毒的分离鉴定

从海南省黄灯笼辣椒顶死病株上分离纯化得到一个病毒分离物.研究结果表明,该病毒分离物能通过汁液磨擦接种侵染供试植物中的4科11种植物,可由桃蚜传播;提纯病毒粒子呈球形,直径28～30 nm,外壳蛋白分子量约为28 ku;分离物与CMV抗血清在ELISA测定中呈阳性反应;提取病毒分离物RNA,应用RT-PCR方法克隆了病毒外壳蛋白（CP）基因.CP基因675 bp,编码218个氨基酸.对CP基因序列分析表明,该病毒分离物的CP基因核苷酸序列与黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ分离物的同源性均在92.1%以上,所推导的氨基酸序列同源性在96.3%以上,而与亚组Ⅱ分离物的核苷酸序列同源性均低于77.3%,所推导的氨基酸序列同源性均低于80.7%.据此将该病毒分离物鉴定为黄瓜花叶病毒,归属于亚组Ⅰ.     

大豆花叶病毒致病基因的克隆与序列分析

通过生物学纯化与血清学鉴定(ELISA)得到5个大豆花叶病毒(SMV)分离物,利用RT-PCR法扩增其CP、HC-Pro、P1和P3基因片段并进行测序。结果表明:5个分离物P1基因全长均为927个核苷酸,编码产生309个氨基酸。同源性分析表明,5个分离物核苷酸序列同源性为88.0%~99.9%,由此推导的氨基酸序列同源性为86.1%~100.0%。此外,5个分离物4个SMV基因CP、HC-Pro、P1和P3长度均为4 137个核苷酸,编码1 378个氨基酸。分析结果显示,5个分离物之间的核苷酸及氨基酸的同源性分别为92.6%~99.3%和95.1%~99.2%。根据系统进化树的分析,结合5个分离物在10个大豆鉴别寄主上的致病性反应,发现SMV的4个基因CP、HC-Pro、P1和P3与SMV的致病力及病样的来源地之间具有一定的关系。同时,这4个SMV基因能够将传统的SMV株系分离物与重组性分离物进行区分。     

海南胡椒中黄瓜花叶病毒分离物的分子鉴定

通过间接酶联免疫法,从海南罹病胡椒植株中检测到黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV).从病叶中提取总RNA,用巢式RT-PCR方法扩增获得657 bp的CMV CP基因片段,并与pMDl8-T载体连接和转入大肠杆菌克隆,然后进行测序.序列分析结果表明,该分离物与CMV亚组I、亚组II之间的核苷酸序列同源性分别为92.54%～99.09%和76.97%～77.42%,推导氨基酸序列同源性分别为98.17%～100%和81.74%～82.65%.该分离物CP基因与印度胡椒分离物同源性相对较低,应属不同株系.     

进境大豆种子中烟草环斑病毒的快速检测

烟草环斑病毒(Tobaeco ringspot virus,TRSV)是进境大豆种子必须检疫的项目,属于我国禁止入境的二类检疫性有害生物,本文建立了大豆种子中TRSV的快速检测方法.采用Trizol试剂直接提取大豆种子总RNA,通过RT-PCR扩增得到359 bp特异性产物.该产物经半巢式PCR进一步验证得到206 bp特异性片段,经测序及同源性比较表明,片段序列与GenBank中登录的TRSV外壳蛋白基因部分序列存在92%～96%的同源性,而未见与其它基因序列存在同源性.同时,大豆种子样品经DAS-ELISA复核检测结果显示TRSV阳性反应.因此,判定该批进境大豆种子携带TRSV.     

水稻稻曲病菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达与序列分析

水稻稻曲病是由稻绿核真菌[Ustilaginoidea virens(Cooke)Tak]引起的一种常见的水稻后期穂部病害。G蛋白可能参与了稻曲病菌的致病过程。为了研究G蛋白在病菌致病过程中的作用,分离并分析了稻曲菌的G蛋白β亚基编码基因。根据丝状真菌G蛋白β亚基编码基因的同源保守序列设计简并引物,采用同源克隆和热不对称交错PCR的方法,分离得到了稻曲菌的G蛋白β亚基全编码基因序列。该序列的长度为2037bp,包含4个内含子,5个外显子和1个编码359个氨基酸的开放阅读框。根据克隆到的UvGβ1设计引物,通过RT-PCR克隆到包含整个开放阅读框的cDNA序列。该基因的DNA序列和cDNA序列在GenBank中注册的登记号分别为GU014921和GU065745。系统进化分析表明该片段与栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的G蛋白β亚基基因亲缘关系最近。将该基因的整个开放阅读框连接于pET-30a构建原核表达载体,通过诱导获得了重组蛋白。     

转菰候选基因克隆获得抗白叶枯病水稻植株

以菰NBS-LRR类抗病基因同源序列FZ14(GenBank登录号:DQ239432)为模板设计特异性引物FZ14P1/P2,通过克隆池PCR法经分级筛选,从菰基因组TAC文库中获得1个阳性克隆(ZR1),序列分析比对证实该阳性克隆为含有菰抗病基因同源序列FZ14的抗病基因候选克隆。同时,ZR1具有植物NBS-LRR类型抗性基因中的P-loop(kinase1a)、kinase2、ki-nase3a和GLPL(Gly-Leu-Pro-Leu)等保守基序,可能为抗性基因的部分序列。通过农杆菌介导转化水稻品种日本晴,获得36个对白叶枯病菌PXO71具有明显抗性的独立转化子,结果表明,菰ZR1克隆中至少含有1个白叶枯病抗性基因。     

墨西哥野生马铃薯Solanum pinnatisectum抗晚疫病及抗马铃薯甲虫新基因的遗传分析与分子标记(英文)

马铃薯晚疫病(Phytophthora infestans)和科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)是马铃薯生产中最为严重的病虫害。培育高抗晚疫病和甲虫的马铃薯品种是加拿大马铃薯育种工作的重要组成部分。目前,我们实验室在二倍体1EBN墨西哥野生种中已鉴定出抗马铃薯晚疫病和甲虫的新基因,并利用原生质体融合技术成功的将其转移到栽培品种中。但是,培育出抗晚疫病和抗甲虫的马铃薯新品种仍然是一项艰难而繁杂的工作。为了加快分离抗性基因,建立与抗性基因紧密关联的DNA分子标记至关重要。本研究以感病的二倍体马铃薯品种S.cardiophyllum作为父本,与带有抗性基因的墨西哥野生种S.pinnatisectum杂交。用叶片离体鉴定的方法测试F1和BC1代群体的抗病性,从而筛选抗晚疫病和抗甲虫的植株。US-8/A2交配型病菌测试显示所有的F1代植株都表现出抗晚疫病,而在BC1群体中抗病与感病植株的比例为1:1。这个结果证明,在墨西哥野生种S.pinnatisectum中存在一个抗晚疫病的单显性基因Rpi1。马铃薯甲虫抗性检测中,BC1群体的抗虫性分离比例为1:3.这表明其对甲虫的抗性是由多基因遗传控制的。在F1和BC1群体中利用分子标记结合集团分离分析法(BSA)对S.pinnatisectum中的晚疫病抗性基因Rpi1进行精细作图。根据马铃薯第7条染色体上RFLP标记TG20A和CP56之间的EST和STS标记的序列信息,合成了27对特异性PCR引物。获得一些与抗晚疫病基因Rpi1相关联的新的DNA标记。对BC1群体中大量的个体植株进行的分析表明,在马铃薯第7条染色体上位于抗晚疫病基因Rpi1两侧的两个标记S1c9和GP127-300,它们与Rpi1基因的遗传距离分别为1.17cM和3.89cM。这些标记被用来筛选两个细菌人工染色体(BAC)文库,并分离出与晚疫病抗性相关的90-125kb的BAC克隆,这些克隆将在后续的工作中通过图位克隆的方法而用于分离晚疫病抗性基因。同时分离与甲虫抗性紧密相关的分子标记的工作正在进行中。     

ALS抑制剂类除草剂抗性水稻功能标记的开发与验证

【目的】培育具有乙酰乳酸合酶(ALS)抑制剂类除草剂抗性的品种是防治水稻直播田杂草危害最经济、有效的途径之一,而利用分子标记辅助选择有助于提高其品种选择效率。【方法】在明确除草剂抗性突变体黄华占M-1 ALS基因编码区碱基差异的基础上,利用四引物扩增受阻突变体系PCR(Tetra-primer ARMS-PCR)技术,设计引物对不同品种(品系)和淮稻5号/黄华占M-1的F2群体进行基因型检测,并结合除草剂的田间试验对标记的准确性进行验证。【结果】ALS基因编码区序列比对分析表明,尽管籼、粳稻之间具有多处差异碱基,但只有第1642和1643碱基TG到AT的变异能导致位于高度保守域的第548位编码氨基酸由色氨酸突变为甲硫氨酸,进而使水稻产生对ALS抑制剂类除草剂的抗性。依据PCR扩增产物的电泳带型,可以准确区分出3种不同的基因型,其基因型与苗期除草剂抗性的表型完全一致。【结论】利用Tetra-primer ARMS-PCR技术,可以实现对两个连续变异碱基位点基因型的快速检测,从而加快ALS抑制剂类除草剂抗性水稻品种的选育进程。     

甜(辣)椒胚培养与育种加代技术的研究

为了加速甜(辣)椒世代繁殖，利用植物组织培养技术将甜(辣)椒不同成熟度的幼胚进行离体培养研究。结果表明，将授粉后生长30～35 d的幼胚接种到MS基本培养基上进行培养，每代可缩短种子成熟期20～30 d，2年可繁殖5～6代。     

Evaluation by PCR of Xylella fastidiosa subsp. pauca transmission through citrus seeds with special emphasis on lemons (Citrus limon (L.) Burm. f)

Citrus variegated chlorosis (CVC), caused by the xylem-limited bacterium Xylella fastidiosa subsp. pauca (Xfp), is a damaging disease of sweet oranges (Citrus sinensis (L.) Osbeck) in several citrus production areas of South America. CVC was first identified in sweet orange orchards in the Northwest region of São Paulo State, Brazil. Transmission of Xfp from seed of CVC infected sweet orange fruit to seedlings has been reported. However, Xfp has not been reported to infect or cause CVC in lemon (Citrus limon (L.) Burm. f). Therefore, the objectives of this study were 1) to further evaluate the potential for vertical transmission of the bacterium through sweet orange seeds originating from symptomatic fruits to sweet orange seedlings and 2) to examine lemon trees and seeds for PCR detection of Xfp. Based on our evaluations, Xfp was not detected by PCR in leaves and seeds of different lemon cultivars surrounded by sweet orange orchards with high incidence of CVC. Furthermore, we could not detect with PCR that Xfp is vertically transmitted through sweet orange seeds to seedlings of sweet orange even from fruits with typical CVC symptoms. Hence, in this study and with the cultivars tested, Xfp was not confirmed by PCR detection to be transmitted via infected seeds from fruits of Citrus spp. even in areas where CVC is endemic nor was lemon found to be a natural host of Xfp.     

水杨酸浸种对甜玉米种子萌发及生理特性的影响

用不同浓度(0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mmol/L)的水杨酸(SA)溶液浸泡处理甜玉米种子进行发芽试验,统计种子萌发情况,分析幼苗相关生理指标的变化。结果表明,较低浓度的水杨酸溶液(0.25～0.75 mmol/L)处理有利于甜玉米种子的萌发,能有效提高种子发芽率、发芽势及发芽指数,提高可溶性糖和脯氨酸含量,增强幼苗中过氧化物酶(POD)活性,降低淀粉酶活性;较高浓度的水杨酸溶液(1.25～1.5 mmol/L)抑制甜玉米的萌发,与对照相比降低幼苗可溶性糖含量,增强淀粉酶活性,1.5 mmol/L水杨酸溶液处理降低POD活性及脯氨酸含量。综合各指标,在生产中建议使用0.25～0.75 mmol/L水杨酸溶液处理种子,可促进种子萌发,调节酶活性,提高植物对逆境的抗性。     

矮壮素及烯效唑对甜椒幼苗质量的影响

矮壮素和烯效唑属于延缓型植物生长调节剂,能够抑制植物体内赤霉素的生物合成及减慢细胞伸长速度.为控制甜椒穴盘苗徒长,提高穴盘苗质量,以大果型甜椒热甜4号为材料,利用矮壮素和烯效唑进行处理,分析不同浓度的矮壮素和烯效唑对甜椒幼苗质量的影响.结果表明:200～1 000 mg/L 50％矮壮素水剂及20～100 mg/L5％烯效唑微乳剂均能明显抑制甜椒穴盘苗株高、增加茎粗、减小叶面积、增大根冠比、提高SOD和POD酶的活性.烯效唑对甜椒幼苗的抑制作用显著高于矮壮素.400 mg/L 50％矮壮素水剂或60 mg/L5％烯效唑微乳剂是适宜的喷施浓度,可显著提高甜椒幼苗的质量.     

彩色甜椒基因组DNA提取方法的优化

以不同颜色的甜椒为试验材料，采用CTAB法、SDS法、ROSE法和氯化苄法提取彩色甜椒基因组DNA。结果表明，CTAB法所提取DNA的质量和纯度较高，以此DNA为模板进行RAPD-PCR分析，DNA扩增效果较好，带形清晰、整齐，说明CTAB法提取的DNA较为完整，能用作RAPD-PCR模板来开展彩色甜椒分子水平的研究。     

彩椒的离体快繁研究

以红盾彩椒为试材,进行组培快繁,研究不同激素类型与配比组合对愈伤组织诱导、不定芽分化及芽的伸长的影响,并初步建立彩椒的组培快繁体系。 结果表明：子叶愈伤诱导最适培养基为：MS＋0.3 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L NAA;不定芽诱导最适培养基为：MS＋3.0 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L IAA＋4.0 mg/L AgNO3;芽伸长最适培养基为：MS＋2.0 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IAA＋2.0 mg/L ZT＋2.0 mg/L GA3;最后在1/2MS＋0.5 mg/L IBA(或 0.5 mg/L NAA)培养基上进行生根培养。     

水分胁迫对甜椒结果期生理生化指标的影响

在控水条件下,以中椒7号为试验材料,对结果初期、结果盛期和结果末期植株的根系活力、叶绿素、MDA、可溶性糖含量等进行了测定。结果显示：相同控水条件下,结果初期和结果末期MDA含量升高显著,结果盛期则增幅较小,且结果盛期较其他2个时期可溶性糖含量、可溶性蛋白含量升高较多,根冠比变化较大。这说明结果初期和结果末期对水分处理较敏感,不适宜进行控水,而结果盛期内,中椒7号的生理调节能力较其他2个时期强,适当水分胁迫处理不会使植物受到伤害。因此,建议在结果盛期进行适度控水来提高甜椒的水分利用效率。     

双价抗菌肽基因转化辣椒

在建立高效快速辣椒（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ Ｌ．）子叶离体培养和植株再生体系的基础上,将昆虫抗菌肽Ｂ、Ｄ基因构建而成的双价质粒ｐＣＤＢ－Ⅱ以逐杆菌为介导转入５个辣椒栽培品种,共获得Ｋａｎ＾Ｒ植株１２００多株,对部分Ｋａｎ＾Ｒ植株进行点杂交、ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测,结果证明了外源基因被成功整合。盆栽接青枯菌试验,结果显示,转基因植株具有较强的抗病力。     

3种生长延缓剂对甜高粱幼苗生长和生理特性的影响

采用不同浓度的多效唑、矮壮素、比久对甜高粱种子进行浸种处理,结果表明,3种生长延缓剂中,多效唑对甜高粱幼苗生长的抑制作用最强;0.1～0.2 g/L的多效唑浸种处理可以提高种子的发芽势和发芽率,但幼苗生长受到过度抑制而表现不正常;5g/L和10g/L的矮壮素和比九处理可以延缓甜高粱幼苗生长,使叶片缩短、厚度增加,具有提高幼苗可溶性糖、可溶性蛋白质和叶绿素含量的作用,促进了幼苗对干物质的合成和积累,使幼苗十物质重显著提高,有利于培育壮苗.其中,10g/L矮壮素浸种处理效果最佳.