基于壳聚糖载体的蛋白质药物纳米颗粒制备研究

采用基于壳聚糖(CS)与聚阴离子(多聚磷酸纳)间静电作用的离子凝胶化方法,以牛血清白蛋白(BSA)为模型,在室温下制备了包载蛋白质的亲水性壳聚糖纳米颗粒.对BSA-壳聚糖纳米颗粒的形成条件进行了考察,结果表明:在pH值为5.0,CS与TPP的质量比为4,壳聚糖分子量为40 kDa的最优化的条件下可制备粒径小于100 nm的BSA-壳聚糖纳米颗粒,对BSA的包封率达到50%以上.并将该体系初步应用于蛋白类药物丙种球蛋白-壳聚糖纳米颗粒的制备研究,这种壳聚糖纳米颗粒对丙种球蛋白具有良好的缓释作用.     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在大肠杆菌中的表达及其特性研究

将大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚单位(LTB)基因eltb克隆到表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21/DE3/plyss。采用SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明,在大肠杆菌中高效表达了LTB蛋白,其产量约为细菌总蛋白的20%,GM1-ELISA方法鉴定目的重组蛋白可与GM1结合,具有潜在的佐剂活性;由纯化的重组蛋白免疫小鼠制备的抗血清效价为1:16000,并且可以特异性识别天然毒素。结果表明,所表达的LTB有良好的抗原性和佐剂活性,制备的抗血清具有良好的免疫活性,为下一步以LTB作为佐剂的黏膜疫苗研究提供基础材料。     

新鱼腥草素钠纳米乳佐剂对肉仔鸡免疫功能的影响

以新鱼腥草素钠纳米乳为免疫佐剂,将其混入传染性支气管炎灭活疫苗,探讨其对肉仔鸡免疫功能的影响。选150只1日龄黄羽肉鸡,随机分成3组,第1组用新鱼腥草素钠纳米乳佐剂疫苗,铝胶佐剂疫苗为阳性对照组作为第2组,第3组为空白对照组(PBS)。免疫后21d(35日龄)采用IBV M41株病毒液进行点眼、滴鼻攻毒。通过测定每组鸡淋巴细胞(PBMC)增殖情况、鸡血清抗体效价、IBV强毒株攻毒保护及组织病理学变化。结果表明:新鱼腥草素钠纳米乳佐剂组PBMC增殖指数、鸡血清抗体效价水平显著提高(P0.05),在IBV M41株攻毒试验中,新鱼腥草素钠纳米乳佐剂组可显著减轻病毒感染肉仔鸡临床症状,肺和肾无明显组织病理学变化,免疫保护率达到96.7%。这表明以新鱼腥草素钠纳米乳佐剂能提高肉仔鸡对传染性支气管炎的免疫力。     

携肠球菌Ace抗原的铁蛋白纳米粒制备与免疫效果检测

为制备携肠球菌胶原蛋白黏附素Ace抗原表位的铁蛋白纳米颗粒,并评价其免疫效果,利用生物信息学软件预测Ace抗原表位,合成相应的基因片段,分别构建含有相应抗原表位基因与铁蛋白H亚基基因的融合表达载体,同时构建融合表达Ace蛋白和H亚基的质粒pET-32a-ace-H,分别转入大肠杆菌中进行融合表达。利用Western blot鉴定各重组融合蛋白的反应原性,并利用透射电镜观察目的蛋白表征。用重组铁蛋白纳米颗粒分别制备免疫原进行家兔接种试验,并定期检测家兔血清特异性抗体水平。结果显示,正确构建了6个Ace蛋白抗原表位基因与H亚基基因的融合表达载体pET-32a-ace1-H～pET-32a-ace6-H,其中pET-32a-ace1-H、pET-32a-ace3-H、pET-32a-ace5-H和pET-32a-ace6-H为可溶性表达载体。Western blot检测显示可溶性表达的4种融合蛋白均具有较好的反应原性。透射电镜图像显示,4种融合蛋白均形成了具有中空结构的铁蛋白纳米笼,其直径与天然铁蛋白类似;而融合蛋白Ace-H纳米笼没有中空结构,且直径比天然铁蛋白大。家兔免疫试验结果显示,6种融合蛋白均在家兔体内诱导产生了特异性抗体,而且,携带单个Ace表位的铁蛋白纳米颗粒Ace1-H、Ace3-H、 Ace5-H与携带多表位的Ace重组蛋白以及Ace-H纳米颗粒相比,其诱导的抗体效价和消长规律均一致,其中以铁蛋白纳米粒Ace5-H的免疫效果为最佳。本研究结果表明铁蛋白纳米颗粒能有效增强蛋白质抗原的免疫原性,有望作为候选表位疫苗佐剂得到应用。     

壳聚糖对口蹄疫DNA疫苗黏膜免疫的影响

以寻求有效DNA疫苗黏膜免疫途径为目的，利用带有负电荷的具有黏膜粘附性多糖-壳聚糖来包裹口蹄疫DNA疫苗pcD～VP1形成纳米级颗粒，用此颗粒经滴鼻、口服、直肠和生殖道4种黏膜免疫小鼠，检测小鼠的针对口蹄疫的体液和细胞免疫水平。结果显示：壳聚糖／pcD-VP1滴鼻免疫小鼠，抗体的高峰来临比只免疫pcD-VP1提前2周。直肠免疫处理中也呈现如此效果；经口服和生殖道途径的免疫，均没有呈现比pcD-VP1免疫组更好的抗体水平。但壳聚糖／pcD-VP1在生殖道和直肠免疫途径里均比pcD-VP1免疫组P．P．结的T细胞增殖水平高。所以。除口服途径以外，在滴鼻、直肠和生殖道免疫中，壳聚糖对质粒的包裹均一定程度上提高了DNA疫苗黏膜免疫的效果。     

芯-壳复合纳米颗粒及其纳米营养物制备技术的研究Ⅰ.儿茶素纳米胶囊的研制

利用分子自组装原理制备包封有儿茶素的壳聚糖纳米胶囊,探讨了pH值和壳聚糖与三聚磷酸钠(TPP)质量比对纳米颗粒形成及其性质的影响.通过控制壳聚糖与TPP质量比为1.3～3.0,可制备形态规则、分散性好、平均粒径为10～50 nm的球形纳米颗粒.经高效液相色谱法分析,儿茶素的包封率为30.54%～50.46%.本研究结果为进一步研制壳聚糖-功能蛋白芯-壳复合纳米颗粒及纳米营养物奠定了基础.     

黄芪多糖与紫锥菊提取物纳米乳的制备及免疫佐剂效应研究

【目的】筛选制备W/O型黄芪多糖(APS)、紫锥菊提取物(EM)纳米乳佐剂的最佳配方,并考察该纳米乳佐剂的免疫效应。【方法】根据伪三元相图中纳米乳区面积的大小并结合肉眼观察,筛选制备黄芪多糖与紫锥菊提取物纳米乳佐剂的配方,观测制剂的形态、粒径分布、pH、黏度及稳定性;以卵清白蛋白(OVA)为模式抗原,用含不同质量黄芪多糖与紫锥菊提取物的纳米乳佐剂免疫小鼠后,测定并比较血清OVA诱导特异性抗体水平的变化。【结果】制备黄芪多糖与紫锥菊提取物纳米乳的配方中,Tween 80、Span 80、石蜡油、乙醇、水的体积比为3∶1∶1.5∶0.5∶1;所得纳米乳为淡黄色透明液体,透射电镜下呈圆球形,平均粒径45.2nm,pH 6.71,黏度4.60s,理化性质较稳定。用黄芪多糖与紫锥菊提取物纳米乳和抗原同时免疫小鼠后,未见任何不良反应,且用黄芪多糖与紫锥菊提取物纳米乳免疫的各试验组小鼠,其血清OVA特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体水平均显著高于OVA抗原对照组(P<0.05),而各试验组的IgG、IgG1和IgG2a抗体水平无显著差异;只有APS 200μg+EM 200μg+OVA抗原组和APS400μg+EM 200μg+OVA抗原组的IgG、IgG1和IgG2a抗体水平显著高于铝胶(Alum)+OVA抗原组(P<0.05),且以APS 400μg+EM 200μg+OVA抗原组的3种抗体水平最高。【结论】黄芪多糖与紫锥菊提取物纳米乳佐剂制备方法简单,稳定性好,能显著增强机体抗体的产生能力,同时可以增强Th1和Th2的免疫应答反应,具有开发佐剂的应用价值。     

纳米ZnO对浮萍（Lemna minor L.）的生态毒性及其聚集性和溶解性分析

纳米颗粒的大量生产和应用增加了其环境释放风险,为此以不同浓度的纳米ZnO(0、1、10mg·L-1和50mg·L-1)处理浮萍(LemnaminorL.)7d,分析了纳米颗粒对植物D665/D665a值(叶绿素与脱镁叶绿素的比率)以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和Na+K+-ATP酶(Na+K+-ATPase)活性的影响,并对纳米ZnO的聚集性与溶解性进行了测试。研究结果显示,浓度为50mg·L-1的纳米颗粒显著抑制D665/D665a值和Na+K+-ATPase活性,而抗氧化酶活性则显著升高;纳米颗粒在培养液中易发生聚集作用而沉积,12h后基本上完全沉积到底部。结果说明,50mg·L-1的纳米ZnO对浮萍产生了显著的胁迫作用,其对浮萍的毒性作用主要来源于其溶出的Zn2+。     

新型鹅星状病毒ORF2蛋白纳米抗体的筛选及鉴定

【目的】由新型鹅星状病毒(novel goose astrovirus, nGAstV)引起的雏鹅痛风病对我国养鹅业造成了重大经济损失。通过构建nGAstV纳米抗体(nanobody, Nb)噬菌体展示文库，获得识别nGAstV ORF2蛋白的特异性Nb，可为建立nGAstV抗体检测方法及研究nGAstV ORF2蛋白结构和功能奠定基础。【方法】使用蔗糖密度梯度离心方法纯化在LMH细胞中增殖的nGAstV,RT-PCR鉴定nGAstV并通过细胞病变测定nGAstV滴度。用0.06%甲醛溶液灭活纯化的nGAstV作为免疫原，免疫两周岁羊驼。首次免疫时用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏完全佐剂乳化后免疫，第2—5次免疫用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏不完全佐剂乳化。每间隔两周免疫一次，每次免疫剂量均为50μg。第5次免疫14 d后，通过间接ELISA方法测定羊驼血清中针对nGAstV的IgG抗体效价。待IgG抗体效价达到构建噬菌体抗体展示文库标准时，分离羊驼外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte, PBL)，然后提取PBL总RNA将其反转录为cDNA，利用...     

巯基修饰和胡敏酸包裹纳米Fe3O4颗粒的制备及其对溶液中Pb2+ Cd2+ Cu2+的吸附效果研究

采用改进的化学共沉淀法制备纳米Fe3O4颗粒,利用3-巯丙基三乙氧基硅烷(MPTES)和胡敏酸(HA)对所制备的纳米Fe3O4进行巯基修饰和胡敏酸包裹,通过红外光谱(IR)、X射线衍射分析(XRD)等方法对上述制备的纳米颗粒的性质进行了表征,同时对上述不同的纳米Fe3O4颗粒在恒温下对水体中金属离子(Pb2+、Cd2+、Cu2+)的吸附进行了研究。结果表明,所制备的功能化前后的纳米Fe3O4纯度较高,平均粒径约为20～30nm,且分布均匀。不同纳米型Fe3O4颗粒对溶液中金属离子具有较好的吸附性能,其吸附等温线均可以用Langmuir方程进行较好的拟合;裸露的纳米Fe3O4颗粒对Pb2+最大吸附量(b)达到172.4mg·g-1,经过胡敏酸包裹后的纳米Fe3O4颗粒对Cd2+、Cu2+的最大吸附量分别增加了75.8%和231.5%;对不同金属离子而言,裸露的和巯基修饰的纳米Fe3O4对3种重金属离子的吸附能力的强弱为Pb2+>Cd2+>Cu2+,而经胡敏酸包裹后的顺序则为Pb2+>Cu2+>Cd2+;与裸露的和巯基修饰的纳米Fe3O4相比,经HA包裹的纳米Fe3O4对Cd2+和Cu2+具有较高的吸附量和吸附亲...     

牛结核分枝杆菌抗原蛋白Ag85B的表达及纳米疫苗的制备

以牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis,MTB)C68001株基因组DNA为模板,克隆免疫优势抗原基因Ag85B,构建重组表达质粒p ET-28a-ag85b,转化入大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。以明胶为佐剂,Ag85B为目的抗原制备纳米疫苗,并对其进行了相关的工艺检测。以BCA法建立测定蛋白质含量的标准曲线,在此基础上检测纳米疫苗的载药率和包封率。结果显示,明胶佐剂疫苗的载药率为71.83%,包封率为41.03%,符合纳米疫苗的工艺要求。     

猪传染性胃肠炎病毒S1融合蛋白的构建及其免疫原性研究

[目的]研究猪传染性胃肠炎病毒S1融合蛋白的免疫原性。[方法]表达和纯化了猪传染性胃肠炎病毒S1与TAT转导肽序列的融合蛋白S1-TAT,将融合蛋白S1-TAT经腹腔注射和灌胃方式免疫昆明小鼠,采集免疫小鼠血液和粪便样品,检测血清Ig G抗体和黏膜Ig A抗体水平,期间观察小鼠体重变化。[结果]腹腔注射组诱导产生的血清Ig G抗体水平明显高于其他试验组(P0.01),但其黏膜Ig A抗体水平较低;而灌胃组能够诱导中等水平的血清Ig G抗体和较高水平的黏膜Ig A抗体(P0.01);在试验周期中,各组小鼠体重均正常。融合蛋白S1-TAT的穿肠活性较好,与对照组之间差异极显著(P0.01)。[结论]融合蛋白S1-TAT经口服或注射小鼠后,能够有效诱导小鼠机体产生体液免疫应答,并且融合蛋白S1-TAT经口服可诱导小鼠机体产生黏膜免疫应答;融合蛋白S1-TAT具有穿肠功能;融合蛋白S1-TAT经口服或注射小鼠,均安全。     

猪流行性腹泻病毒coe基因的克隆表达及卵黄抗体的制备

通过RT-PCR技术扩增猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)coe基因,将其克隆至原核表达载体p ET32a中,构建重组表达质粒p ET32a-coe,鉴定正确后进行诱导表达。结果表明,重组菌可表达相对分子量约为33 k D的融合蛋白;Western-Blotting结果显示,COE蛋白能与抗PEDV的阳性血清发生特异性结合反应,表明研究的COE蛋白具有良好的反应原性。纯化后的COE蛋白与弗氏佐剂按比率混合作为免疫抗原,免疫产蛋鸡,获得特异性抗猪流性腹泻病毒COE蛋白的卵黄抗体(Ig Y)。氯仿抽提法提取卵黄抗体,通过SDSPAGE、Western-Blotting对提取的卵黄抗体进行鉴定并用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)对其进行效价检测。结果显示,纯化后的卵黄抗体Ig Y具有高度的特异性,其抗体效价可达1∶1 000。研究结果表明,表达的COE蛋白具有良好的免疫原性,作为免疫抗原制备的卵黄抗体具有较高的抗体效价。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因的原核表达

大肠杆菌(Escherichia coli)不耐热肠毒素B亚单位(LTB)不仅是重要的黏膜免疫原,而且作为佐剂在黏膜免疫中起着重要的作用.试验采用PCR方法扩增了肠毒素性大肠杆菌的LTB基因,并将其克隆到pGEX-KG原核表达栽体上,构建了重组质粒pKG-LTB,经酶切和测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,克隆的LTB基因与谷胱甘肽转移酶(GST)基因获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-LTB分子量约为35kDa,并具有免疫反应活性.这为进一步研究LTB蛋白黏膜免疫原性和黏膜佐剂的作用奠定了基础.     

金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的制备与释放性能研究

以壳聚糖为壁材、聚乙二醇400为助溶剂,采用离子诱导法制备油溶性药物金雀异黄素纳米粒子,通过负染-电镜、傅里叶红外光谱、紫外-可见分光光度法等方法对该纳米粒子的形貌、组成、包裹率及载药率、体外释放性能进行测定。结果表明:根据优化工艺制备的该纳米粒子的粒径为200~300 nm,包裹率和载药率分别为37.1%和9.3%;所获得的金雀异黄素纳米粒子对药物具有明显的缓释效果。     

CFNCpG对BVDV1灭活抗原的免疫佐剂效应研究

分别用CFNCpG、弗氏完全佐剂、氢氧化铝胶与BVDV1灭活抗原配制成疫苗免疫家兔,于免疫后每间隔7d检测中和抗体变化,来探讨CFNCpG对BVDV1灭活抗原的佐剂效应。试验结果表明,CFNCpG单独作为佐剂应用7d可使抗体滴度达到4.4(log_2SN_(50)),14d可达到7.0以上;与氢氧化铝胶联合可使抗体滴度在21d达到7.0以上,其佐剂水平与弗氏完全佐剂相当。有望进—步研制成为BVDV1灭活疫苗佐剂成分。     

豆状带绦虫TPO18基因的原核表达及保护性分析

【目的】明确重组蛋白 pGEX-TPO18 的免疫保护效果。【方法】提取豆状带绦虫六钩蚴 RNA,根据带科其他种属绦虫 18 kD 基因的保守区设计引物,5′端分别引入EcoR I、Xho I限制性酶切位点,RT-PCR 扩增,产物克隆于 pMD18-T中进行序列测定,并对序列进行生物信息学分析。将纯化后的 PCR 产物和质粒 pGEX-4T-1 分别用 EcoRⅠ＋XhoⅠ双酶切,回收目的片段,连接后转化至 E.coli BL21感受态细胞,挑斑摇菌,通过 PCR 方法和重组质粒测序技术进行鉴定,将鉴定正确的重组表达质粒命名为 pGEX-TPO18。用 IPTG 诱导表达重组质粒,收集菌体进行 SDS-PAGE 分析,用 GST 琼脂糖树脂纯化 TPO18 蛋白,进行 Western blottting 检测。将纯化后的重组蛋白分别乳化弗氏佐剂、206 佐剂、氢氧化铝佐剂后免疫家兔,每次 50 μg/只,共免疫 3 次,末次免疫后 34 d 每只家兔感染 1 500 个虫卵,感染 58 d 后扑杀并计算各免疫组减囊率。免疫前后每隔 7 d 采血分离血清,ELISA 法检测血清抗体水平,以 40 µg•mL-1重组蛋白包被酶标板,血清 1﹕200 稀释,检测血清样品的 OD492nm 值。【结果】TPO18 基因的 RT-PCR 扩增产物为 339 bp, 与预期大小相符;测序结果表明无碱基突变,重组质粒pGEX-TPO18构建成功。pGEX-TPO18 在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物为 38.6 kD 的可溶性蛋白,Western blotting分析结果显示兔抗豆状囊尾蚴阳性血清与重组蛋白在38.6 kD处有一条明显的反应条带,表明该重组蛋白具有反应原性。经ELISA检测,免疫后7 d 免疫组家兔抗体水平开始升高,第43 天达到峰值。经口感染虫卵后,免疫组抗体水平开始降低,但仍保持一定水平。家兔免疫保护试验表明弗氏佐剂、206 佐剂和氢氧化铝佐剂免疫组减囊率分别为 79.13%、65.66% 和 50.43%。【结论】研究表明弗氏佐剂免疫效果较好,有望研制出抗豆状囊尾蚴病的高效疫苗。     

MS2噬菌体介导展示猪繁殖与呼吸综合征病毒线性表位的嵌合纳米颗粒制备及免疫原性

【目的】以MS2噬菌体外壳蛋白为载体,构建展示猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白上线性表位的嵌合纳米颗粒,并研究其免疫原性,为猪繁殖与呼吸综合征病毒或其他病毒表位展示提供新的方法和思路。【方法】利用重叠延伸PCR将GP5上优势线性表位基因序列插入到MS2噬菌体外壳蛋白基因上,构建重组载体,通过原核表达系统表达嵌合蛋白,目的蛋白经过硫酸铵沉淀和凝胶过滤层析纯化,用动态光散射和电镜对嵌合蛋白进行物理表征,通过蛋白印迹和动物免疫试验研究表位嵌合颗粒的免疫原性。【结果】成功将线性表位基因插入MS2噬菌体外壳蛋白基因,嵌合蛋白在原核表达系统中以水溶性表达,目的蛋白经过纯化,纯度达85%以上。嵌合蛋白在体外自组装形成了均一的、直径为25～31 nm的嵌合表位纳米颗粒,该嵌合颗粒免疫动物后,产生可以和灭活病毒反应的高水平抗体,具有良好的免疫原性。【结论】MS2噬菌体外壳蛋白可以耐受9个外源多肽(猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5上线性表位)的插入,在体外自组装形成嵌合病毒样颗粒。该颗粒将外源多肽高密度展示在表面,免疫动物可产生针对该表位的抗体。该技术可为猪繁殖与呼吸综合征病毒其他表位或更长串联表位的展示奠定基础。     

犬冠状病毒S1蛋白特异性小分子抗体Fab的制备

为表达犬冠状病毒(canine coronavirus, CCV)S1蛋白，制备其特异性小分子抗体Fab,为CCV的防治提供新材料。采用PCR扩增CCV S1基因全长及其截短片段，分别克隆到原核表达载体pET28a或pGEX4T-1中，转到BL21(DE3)或Rosetta(DE3)感受态细胞构建重组表达菌株；用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot鉴定分析重组蛋白；纯化蛋白分别与ISA71AVG或ISA201VG佐剂配伍乳化后制备免疫原，免疫蛋鸡，用聚乙二醇(PEG)沉淀法提取得到CCV S1蛋白的卵黄抗体，通过Western blot检测抗体滴度，用胃蛋白酶水解卵黄抗体制备小分子抗体Fab。结果显示，S1蛋白全长无表达，CCV S1-a和CCV S1-b分子量分别为79 ku和68 ku。在免疫后第35天2种佐剂组的卵黄抗体滴度可达1∶128 000。制备小分子抗体Fab最佳酶切条件为卵黄抗体与胃蛋白酶混合质量比20∶1、pH值4.1、37℃酶切8 h。完整的IgY可以与CCV呈...     

包裹姜根油的多种纳米颗粒的制备及质量评价

以大豆磷脂、聚乙交酯丙交酯(PLGA)和聚乙二醇(PEG)3种原料成功制备了包裹难溶于水的植物提取物姜根油(GRO)的纳米脂质体、PLGA纳米颗粒和PEG纳米颗粒,并对3种不同载体制备的纳米制剂的形貌、大小、Zeta电位,包封率及物理稳定性等进行了考察.研究结果表明3种纳米颗粒各有优缺点,可以根据不同的条件和不同的需要制备不同的颗粒,为开发新型的难溶药用植物提取物的理想药剂提供了实验依据.