新型检测技术在犬猫主要病原检测中的应用进展

犬猫传染性疾病严重影响犬、猫健康，甚至威胁人类生命健康。随着新型材料和科学技术的发展，在传统检测方法的基础上建立了多种快速、灵敏、特异的检测技术。针对研究较多的快速检测方法如等温扩增技术、基因芯片技术、时间分辨免疫荧光层析技术以及免疫微球分离检测技术等多种新型检测技术，从检测时间、优缺点及在犬猫主要病原检测的研究进展等多角度予以综述，旨为在不同的检测环境下选择适合犬猫病原检测技术及产品研发提供参考。     

快速检测阪崎肠杆菌新型凝集技术研究

为建立新型快速检测阪崎肠杆菌(E.sakazakii)的技术,本研究采用有机活性染料与抗体共修饰二氧化硅活性微球制成单分散免疫彩色二氧化硅微球(Immune colored silica nanoparticles,ICSN),建立了快速的E.sakazakii新型凝集检测技术。扫描电镜检测显示,利用反相微乳法制备彩色二氧化硅纳米微球(Colored silica nanoparticles,CSN)大小均匀(约70μm),分散程度好。通过ICSN凝集试验检测E.sakazakii结果表明,该新型凝集技术对目标菌的检测范围为6×103cfu/mL~6×109cfu/mL,其凝集结果清晰、直观、易于判别;重复性和稳定性好,而且具有良好的特异性和准确性。实验结果显示,采用ICSN建立的新型凝集技术具有灵敏、快速、稳定、简便、准确及低成本等优点,适用于快速检测E.sakazakii,并为其它病原性微生物快速检测方法的建立提供技术平台。     

悬液芯片系统在检测领域的研究进展

悬液芯片系统诞生于20世纪90年代中期,由美国Luminex公司的研制。该系统使用荧光编码的聚苯乙烯微球作为特异性反应的固相载体,通过偶联试剂的作用,将蛋白质、寡核苷酸、小分子肽类及脂肪偶联到微球的表面构成不同的检测探针。在反应体系中,检测探针通过特异性反应（如抗原―抗体,配体―受体,核酸互补碱基对）捕获与探针相对应的分析物,用荧光标记物标记与探针结合的分析物得到悬液芯片系统的检测物。依据微球内部红色和橙色荧光染料比例的不同,将供悬液芯片系统使用的聚苯乙烯微球分为100种不同的型号。检测器对荧光标记物荧光强度进行检测的同时能分辨不同型号的微球,并将不同型号微球对应的标记物的荧光强度进行分别记录,最终实现一次分析多种检测物的目的。作者综述了悬液芯片系统的原理及在蛋白质、核酸检测领域的研究进展。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光微球抗体检测方法的建立

为建立一种荧光微球免疫层析方法用于猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）抗体检测,将兔抗羊二抗和重组N蛋白分别作为质控线（C线）和检测线（T线）,喷涂于硝酸纤维素膜上,通过优化反应条件,建立了PRRSV荧光微球抗体检测方法,采用ROC曲线确定本方法的判定临界值,并对其敏感性、特异性、重复性及符合率进行了分析。结果显示:本研究建立的PRRSV荧光微球抗体检测方法能够检测到32倍稀释的阳性血清,对猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型阳性血清的检测结果均为阴性;重复性试验结果的变异系数为3.7 1%～8.99%;与美国爱德士试剂盒的符合率为91.30%,具有较高的一致性。结果表明,本研究建立的PRRSV荧光微球抗体检测方法性能稳定、结果可靠,为PRRSV抗体快速检测提供了新方法。     

4种重要虫媒病的核酸液相芯片高通量检测方法的建立

为建立可检测鹿流行性出血热病毒(EHDV)、阿卡斑病毒(AKV)、蓝舌病病毒(BTV)和水泡性口炎病毒(VSV)的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中BTV的VP7基因、EHDV的VP7基因、AKV的N基因和VSV的NP基因序列进行序列分析,设计针对这些基因的特异性探针并标记生物素,分别与不同编号的荧光编码微球偶联后再与这些病毒相应基因的PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪(Liquichip 200)检测荧光信号建立了以上4种虫媒病的快速液相芯片检测方法。检测结果显示,该方法具有较好的特异性,偶联特异性探针的微球只与相应的病毒基因的PCR产物反应,而不与其他虫媒病病毒反应;检测灵敏度达到50~100个TCID50。本研究建立了可以同时检测鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、蓝舌病病毒和水泡性口炎病毒的快速高通量液相芯片技术,为其他类似病毒的快速高通量检测提供了借鉴和经验。     

壳聚糖-海藻酸钠载药微球制备工艺研究

为研究制备壳聚糖-海藻酸钠载药微球的新方法,研究采用D相乳化法,结合微乳及胶体制备技术,以硫酸小檗碱为模型药物,以药物包封率为评价指标,应用单因素试验考察了氯化钙溶液浓度、海藻酸钠溶液浓度、壳聚糖溶液浓度,以及初次凝胶时间对微球性能的影响。应用响应面法筛选优化了载药微球的制备工艺。结果表明,在微球制备及药物包封率的影响因素中,海藻酸钠溶液浓度、氯化钙溶液浓度对评价指标的影响最大,其次是壳聚糖溶液浓度和初次凝胶时间,筛选优化的载药微球生产工艺条件为海藻酸钠溶液浓度1.57%,氯化钙溶液浓度2.13%,壳聚糖溶液浓度0.86%,初次凝胶时间30.71min,该条件下制备微球的平均粒径为329nm,药物包封率94.09%。验证试验证实,本工艺可制备优良的硫酸小檗碱壳聚糖-海藻酸钠微球,且制备工艺简便,生产效率高,本技术为微球制剂的产业化生产奠定了一定基础。     

以免疫纳米微球为凝集原的犬细小病毒2型抗体凝集检测方法的建立

为建立以红色聚苯乙烯纳米微球为载体的犬细小病毒(CPV)抗体检测的间接凝集方法,本研究表达纯化了CPV-2VP2截短的重组蛋白rsVP2,并以rsVP2为致敏原与纳米微球偶联制备了免疫彩色纳米微球;通过对反应条件的优化,建立了一种快速检测CPV-2抗体的间接凝集方法。特异性试验结果显示,致敏微球仅与CPV-2阳性血清发生凝集反应,不与犬瘟热病毒、狂犬病病毒和犬腺病毒的阳性血清发生凝聚反应,特异性强;该凝集方法检测血清中和抗体的最低效价为1∶256;同一批次制备的3份致敏微球、3个不同批次制备的致敏微球以及4℃保存90d的致敏微球与CPV-2阳性血清的凝集反应特异性一致,凝集程度无明显差异,重复性稳定性均较好。该间接凝集检测方法对40份血清样品的检测结果与ImmunoComb■ Canine VacciCheck试剂盒(Dot-ELISA)检测结果的阳性符合率为97%。本研究建立的间接凝集方法为幼犬CPV-2母源抗体或免疫犬CPV-2抗体检测提供了一种快速、简便、准确、经济的方法。     

呼吸系统疾病与呼吸道微生态的研究进展

随着医学检验技术的发展,人们对呼吸道微生态有了进一步的认识,并开始对微生物组学与呼吸系统疾病之间的关系进行深入探索。越来越多的证据表明呼吸道微生物群与肺内环境稳定和疾病的发生有关,目前的研究着力寻找微生态失衡与慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺癌等呼吸系统疾病之间的因果关系及潜在机制。痰作为呼吸道微生态研究的首选样本,包含了丰富的微生态信息,并且极易获得。总结了呼吸道菌群的检测方法,综述了近年来呼吸道微生态的研究进展,探讨了呼吸道微生态与呼吸系统疾病发生发展的关系,以期为呼吸系统疾病的特异性诊断和治疗提供新的思路。     

丝素蛋白-氧化石墨烯多孔微球支架的制备及性能测试

为了拓展丝素蛋白(SF)在组织工程等生物医学领域的应用,采用微乳液-冷冻相分离技术制备丝素蛋白-氧化石墨烯(SF-GO)复合多孔微球支架,并通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)、拉曼光谱(Raman)、扫描电子显微镜(SEM)及热重分析(DTG-TG)等方法对SF-GO复合支架的化学结构和形貌等理化性质进行分析表征。结果表明,宏观上SF微球支架和SF-GO复合微球支架均呈现为表面规则平滑的球形且粒径均匀,但SF-GO微球支架比SF微球支架有更大的微孔结构;加入氧化石墨烯后,微球支架的热稳定性能得到明显改善。体外细胞培养实验表明该微球支架有良好的生物相容性,且SF-GO复合微球支架比普通SF微球支架更能够促进骨髓间充质干细胞的黏附和增殖。     

新型凝集技术快速检测产肠毒素性大肠杆菌菌毛的研究

为建立以彩色二氧化硅微球(CSN)为载体,快速检测产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)菌毛K88ab、K99、987p和F41的新型凝集技术,本研究采用反相微乳液法制备二氧化硅微球,将其与菌毛单因子血清偶联制成免疫彩色二氧化硅微球(ICSN),通过优化反应条件建立了快速检测ETEC菌毛的方法。特异性试验结果显示,ICSN只与携带其对应菌毛的菌株发生反应,与携带其它菌毛的菌株无交叉反应;敏感性试验结果显示菌液的最小检出浓度为1.0×10~6cfu/m L~5.1×10~6cfu/m L;稳定性试验显示4℃保存30 d,ICSN特异性、敏感性无明显变化;双盲样品检测准确率为100%。本研究有助于ETEC菌毛的快速检测和幼畜大肠杆菌性腹泻的诊断。     

A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及纯化

【目的】实现A型塞内卡病毒（Seneca virus A,SVA）VP1蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达,以建立SVA抗体液相芯片技术检测方法。【方法】根据GenBank收录的SVA VP1基因序列（登录号：KY747514.1）,基于大肠杆菌的密码子偏好性优化合成VP1基因,克隆到pCold TF载体,构建重组质粒pCold TF-VP1。将重组质粒pCold TF-VP1转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,进行IPTG诱导表达。通过优化诱导时间及IPTG浓度得出最佳诱导表达条件。采用His标签镍柱纯化VP1重组蛋白,将纯化后的SVA VP1蛋白与荧光微球进行偶联,偶联好的微球与阴阳性血清反应,利用Luminex 200系统上机检测背景及阴阳性血清的中值荧光强度（MFI）,从而判断阴阳性,以用于猪血清中SVA抗体的检测。【结果】重组质粒pCold TF-VP1成功转入大肠杆菌BL21感受态细胞,并以可溶性蛋白形式表达。经诱导表达在约82 ku处出现阳性条带。当重组菌株诱导条件为16 ℃、IPTG终浓度为1.2 mmol/L、诱导时间为3 h时,VP1蛋白表达量最高;经Western blotting分析,可在82 ku处出现明显条带。将VP1 蛋白与荧光微球偶联,阴性对照（背景）的平均荧光值为17（＜100）。测试孔的平均MFI为2 339.5（＞2 000）,证明SVA VP1蛋白与微球偶联成功,偶联成功的荧光微球可用于检测猪血清中SVA抗体的检测。【结论】本研究在大肠杆菌中成功表达并纯化了SVA VP1蛋白,初步建立了SVA抗体液相芯片检测方法,为后续研究奠定了基础。     

生物芯片技术

生物芯片技术（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈｉｐ）是将大量生物识别分子按预先设置的排列固定于一种载体（如硅片，载玻片及高聚物载体等）表面，利用生物分子的特异性亲和反应（如核酸杂交反应，抗原抗体反应等）来分析各种生物分子存在的量的一种技术。其本质是进行生物信号的平行分析，即利用微点阵技术将成千上万的生物信息密码集中到一小片固相基质上，从而使一些传统的生物学分析手段能够在尽量小的空间范围内，以尽快的速度完成。该技术具有高通量、微型化、自动化、成本低、防污染等特点。生物芯片技术将主要应用于生命科学、医学、…     

纳米标记物新型免疫检测技术研究进展

纳米标记物新型免疫检测技术是近年来广泛应用于各个领域且发展迅速的一种简便、精准的现场检测技术,逐步推动着分子生物学的发展及人畜疾病的防控,成为了生物分析领域的重要内容,与之密切相关的纳米材料标记物在检测技术中起着主导作用。由于各种新型的纳米材料标记物的不断研发与优化分析,使得与之相关的检测技术广泛运用于食品质量检测、检验检疫、疾病防控等方面。随着生物分析领域的拓展,更多的标记物如纳米磁珠、镧系元素、上转换发光颗粒、纳米乳球、量子点等已被制备并应用于更多疾病诊断技术中。论文以结合近年来成功研究为基础归纳新型纳米材料标记物的特性方面的研究进展,剖析其多元性,以期为相关研究提供参考。     

基因差异表达分析技术在寄生虫学中的应用研究进展

生物体表现出的各种生物学特性,主要是由于基因在不同细胞间及不同生长阶段的选择性差异表达引起的.这些基因的差异表达按特定的时间和空间顺序有序地进行着,决定了生命活动的多样性.而基因差异表达研究的各种分析技术正是在此基础上发展起来并在兽医寄生虫学中得到广泛应用.以mRNA差异显示、抑制消减杂交法和DNA微列阵分析等为代表的基因差异表达分析技术,在基因表达谱的分析及基因生物学功能研究,阐述寄生虫的发病机制,寄生虫疾病诊断,筛选合适的药物靶标和疫苗候选分子有效地防病治病方面发挥着重要作用.     

荧光微球免疫层析法快速检测鸡饲料中喹乙醇的含量

为更灵敏地进行全价鸡饲料中喹乙醇(OLA)含量的快速检测,本研究将新型标记物荧光微球与喹乙醇单克隆抗体偶联,以该复合物为检测试剂制备荧光微球免疫层析试纸条,在肉眼检测的同时,将该装置与荧光微球定量侧向层析读数仪联合使用,可进行全价鸡饲料中喹乙醇含量的定量快速检测。研究结果证明,饲料中喹乙醇的定性和定量检测限分别为100μg/kg和0.51μg/kg,IC_(50)值为1.89 ng/m L,定量检测回收率为78.71%~90.83%。该试纸条特异性强、准确性高,保存期长。定量检测只需18 min左右,肉眼检测需38 min左右,与相同抗原和抗体制备的胶体金试纸条相比,该方法可大大提高灵敏度。     

液相蛋白芯片技术及在人畜疾病诊断中的应用

液相芯片技术是20世纪90年代中期发展起来的被喻为后基因组时代的芯片技术,属于生物芯片的一种。目前,由于传统的固相生物芯片操作繁琐、信息质量稳定性和可重复性差的缺点,极大地限制了芯片技术在疾病诊断领域的应用。液相芯片技术是一种新型生物分子高通量检测技术,这种技术将流式检测技术与芯片技术有机地结合在一起,使生物芯片反应体系由液相-固相反应改变为接近生物系统内部环境的完全液相反应体系。     

载牛冠状病毒N蛋白壳聚糖微球的免疫效果评价

为了对壳聚糖分子作为佐剂的缓释效果进行免疫学评价,本研究合成了牛冠状病毒DB2毒株N蛋白基因的3'端第487位～1287位碱基,用大肠杆菌对其进行了高效表达,通过SDS-PAGE电泳分离、电洗脱纯化该牛冠状病毒N蛋白(BCV N).以戊二醛为交联剂,采用乳化交联的方法制备空白壳聚糖微球.利用吸附法制备载BCVN蛋白的壳聚糖微球,通过肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA方法检测免疫鼠血清中的抗体水平,由此评价壳聚糖微球对BCVN的缓释作用和佐剂效应.结果表明,壳聚糖微球的形态较好、表面光滑、分散性较好,平均粒径为6.50±1.77μm,电势分布在36 mV,吸附BCV N蛋白的壳聚糖微球在体内所产生的免疫效果明显优于唯N蛋白组,说明载BCV N蛋白的壳聚糖微球在体内具有一定的缓释效果,使N蛋白在体内缓慢释放而长时间诱导抗体的产生,该研究结果为以壳聚糖微球作为疫苗佐剂积累了实验数据.     

液相适配体芯片在食源性致病菌检测中的应用

食源性致病菌是引起食物中毒的重要因素,对食源性致病菌的快速和高通量检测是防止和诊断细菌性食物中毒的有效手段。液相芯片检测技术具有需样本量少、高通量等特点。经典液相芯片技术是以有机荧光染料编码的聚苯乙烯微球为载体,新型液相芯片技术是以物理学、光学等编码的基质为载体,通过制备不同配体功能化的载体,实现对同一液相环境中多种靶细菌的同时检测。适配体是一类相比蛋白类抗体特异性高、筛选获得快、化学稳定性强的核酸配体。论文针对核酸适配体分析鉴及以适配体为基础的新型液相芯片技术在食源性致病菌检测中的应用进行了综述。     

对虾黄头病液相基因芯片检测技术研究

 
为获得一种快速特异灵敏的检测对虾黄头病的方法,本研究通过RT PCR得到需要的DNA片段,选择两种高效的荧光编码微球,建立对虾黄头病（Yellow head disease, YHV）液相基因芯片检测体系并对病毒的GP116基因进行检测。通过对检测结果的分析,从试验检测的灵敏度和特异性方面证明这种技术在对虾黄头病的检测中是可行的。     

快速检测牛奶中泰乐菌素残留的荧光微球免疫层析方法的建立

本研究旨在研制一种快速检测牛奶中泰乐菌素残留的荧光微球免疫层析试纸条。将包被抗原(0.80 mg/mL)和羊抗鼠IgG(1.01 mg/mL)喷涂在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质检线。对制备荧光微球抗体免疫复合物(免疫探针)的工艺参数做了一系列的优化,同时比较了不同标记方法对标记效率及稳定性的影响。结果表明,在pH值为6.0的最佳缓冲体系条件下,催化剂碳化二亚胺(EDC)用量为5μg,抗体100倍稀释添加20μL,检测时间低于25 min,检测限为25μg/L。本试验研制的荧光微球免疫层析试纸条具有简便快速、特异性良好、样本无需前处理等特点,可用于基层奶站和现场快速筛选。