猪乙型脑炎病毒在BHK-21细胞上蚀斑技术的建立

目的:分析研究猪乙型脑炎病毒在BHK-21细胞上蚀斑技术的建立。方法:配制甲基纤维素(MC)覆盖物、甲基纤维素(MC)覆盖物、结晶紫染色液,在进行蚀斑试验。结果:MC粘度直接影响蚀斑的形成,在粘度为1500的MC覆盖物中,JEV病毒不产生蚀斑;在粘度为4000的MC覆盖物中产生清晰的蚀斑。结论:蚀斑技术是病毒感染力测定的精确定量方法。     

4种可食性纤维素薄膜的表征及其在羊肉保鲜的应用研究

为筛选适用于冷藏羊肉保鲜的可食性薄膜中纤维素的种类,将可食性纤维素薄膜应用于冷藏羊肉的保鲜中,比较了羧甲基纤维素(CMC)、羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、甲基纤维素(MC)4种可食性纤维素薄膜与日常使用的市售聚乙烯(PE)保鲜膜的机械性能、氧气透过率、透光率等指标;探究了5种薄膜保鲜冷藏羊肉的pH值、TVB-N、滴水损失的变化。试验结果表明:CMC胶液粘度适中;CMC、PE薄膜感官评价较好,透光率较高;CMC薄膜水溶性、抗拉强度、断裂伸长率、阻气性优于其他几种薄膜。应用于冷藏羊肉中,PE薄膜效果较差,肉样发生酸败,CMC、HPMC效果较好,有效延缓了pH值、TVB-N和滴水损失的升高,保鲜期为11 d,提高了50%。     

乙型脑炎病毒在BHK-21细胞上的蚀斑技术研究及其应用

乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2弱毒株免疫易感动物猪后,在猪体内主要是由T细胞识别抗原引起的细胞免疫,而只有极少部分参与体液免疫,这就给抗体的检测带来困难。参与体液免疫所产生的抗体可以通过ELISA方法检测到血清中的抗体,而参与细胞免疫所产生的抗体在血清中仅有少量存在。JEV SA14-14-2弱毒株可在BHK-21细胞上形成清晰的蚀斑,利用这一技术不仅可以测定JEV的蚀斑单位,还可通过蚀斑减少中和试验比较精确的测定乙脑阳性血清中中和抗体的效价,并可用于病毒的纯化和分型鉴定。     

乙型脑炎病毒在BHK-21细胞上的蚀斑技术研究及其应用

乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2弱毒株免疫易感动物猪后,在猪体内主要是由T细胞识别抗原引起的细胞免疫,而只有极少部分参与体液免疫,这就给抗体的检测带来困难。参与体液免疫所产生的抗体可以通过ELISA方法检测到血清中的抗体,而参与细胞免疫所产生的抗体在血清中仅有少量存在。JEV SA14-14-2弱毒株可在BHK-21细胞上形成清晰的蚀斑,利用这一技术不仅可以测定JEV的蚀斑单位,还可通过蚀斑减少中和试验比较精确的测定乙脑阳性血清中中和抗体的效价,并可用于病毒的纯化和分型鉴定。     

五号病强弱毒在传代细胞上产生蚀斑的研究

对五号病强弱毒在传代细胞上产生蚀斑的研究表明,强毒OK_5株大、中、小斑分别为8,5和2mm,且一般在接种后50h就能充分出斑,弱毒OM_2R_(39)株大、中、小斑分别为3.5,2和1mm,出斑时间在100h以后;用蚀斑测毒,强毒OK_5的蚀斑毒价高于弱毒OM_2R_(39)3.8倍。由此证明五号病强弱病毒有遗传本质的不同。     

团头鲂和草鱼肠道纤维素酶产生菌的筛选和鉴定

采用以羧甲基纤维素(CMC)为唯一碳源的选择性培养基,通过直接筛选和富集分离纯化再筛选的初筛方法,透明圈法和摇瓶发酵的复筛方法,从团头鲂和草鱼肠道中,筛选到2株具有较高纤维素酶活性的纤维素酶产生菌MA35和MC。16S r DNA/ITS分子鉴定和形态学观察分析表明:来源于团头鲂的真菌MA35鉴定为雪白曲霉(Aspergillus niveus),来源于团头鲂的细菌MA1和来源于草鱼的细菌CI10为同一种细菌MC,鉴定为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。发酵趋势的研究表明:在发酵过程中,与MC相比,MA35具有更高的胞外和胞内纤维素酶活力。本研究不仅从草鱼肠道内筛选到了纤维素酶产生菌,而且从我国特有的水生生物团头鲂肠道内分离到了一株新的纤维素酶产生菌,为草食性鱼的合理性养殖和鱼类饲料的膳食性配比提供了科学的研究基础。     

表达牛流行热病毒G基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒的构建

病毒活载体疫苗兼有常规活疫苗和灭活疫苗的优点 ,是当今最有发展前景的疫苗研究领域之一。试验将已构建的表达牛流行热病毒 (BEFV)结构糖蛋白 G基因的牛传染性鼻气管炎病毒 (IBRV )转移载体 pd TK - L ac Z-G,通过脂质体方法转染由牛传染性鼻气管炎病毒 Bartha毒株感染的 MDBK细胞 ,筛选出形成蓝色蚀斑的重组病毒 ,并对其进行蚀斑纯化。通过 PCR方法鉴定该重组病毒证明基因组中含有完整的牛流行热病毒 G蛋白基因 ,实验为开发 BEFV/ IBRV二联基因工程疫苗奠定了基础。     

一组高效稳定纤维素分解菌复合系MC1的产酶条件

用CMC糖化力法和纤维素减重法探讨了对一组高效稳定的纤维素分解细菌复合系MC1的产酶条件。结果表明,在6种纤维素材料中,可直接利用的天然纤维素含量高的C源(如滤纸、棉花)存在下表现出高活性;利用蛋白胨和酵母粉作N源时的纤维素酶活性远高于硝酸铵、尿素等无机N源;以滤纸和酵母粉作为惟一C、N源时,最适发酵浓度分别为0.5%和0.125%,其产酶最高峰均出现在发酵第5d。MC1最适纤维素分解温度为55℃,但60℃以上的高温抑制MC1纤维素分解酶;MC1的最适氧气浓度为0.01～0.04mg·L-1,过高过低的氧气浓度均抑制纤维素分解。MC1的微好氧特点对堆肥工程降低生产成本具有重要意义。     

牛病毒性腹泻病毒陕西株的分离与NS5b基因序列测定

【目的】分离并鉴定陕西省牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)。【方法】采集腹泻犊牛的肠系膜淋巴结,处理后接种于MDBK细胞,盲传,逐日观察是否有细胞病变产生。采用病毒蚀斑技术对病毒克隆纯化后,提取其RNA,进行RT-PCR鉴定。将扩增的NS5b基因克隆入pMD18-T载体中,采用碱裂解法小量提取质粒,并对质粒进行EcoRⅠ和SalⅠ双酶切、SalⅠ单酶切及PCR鉴定,对阳性克隆进行核苷酸序列测定及分析。采用病毒蚀斑试验测定分离毒株的半数组织培养感染量(TCID50)。【结果】盲传4代后细胞出现典型、规律的细胞病变。RT-PCR扩增出预期长度(360 bp)的基因片段,核苷酸序列分析结果表明,所扩增的基因为牛病毒性腹泻黏膜病病毒NS5b基因,其与BVDV VEDEVAC株NS5b基因核苷酸序列有99%同源性。BVDV陕西株的半数组织培养感染量(TCID50)为3.6。【结论】成功分离了牛病毒性腹泻病毒陕西株,为陕西省BVDV的防治提供了理论依据。     

NSP4基因突变的重组牛轮状病毒的拯救及其鉴定

【目的】 通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法,拯救出毒力减弱的轮状病毒(rotavirus, RV)。 【方法】 以野生型轮状病毒CHLY基因组RNA为模板,通过重叠PCR方法在NSP4基因93-104 nt引入5个沉默突变核苷酸,并将毒力位点区135aa、136aa和138aa对应的核苷酸进行定向突变,构建了含有突变位点的转录质粒△pT7-NSP4/89/M。将该质粒与携带RNA聚合酶基因的重组质粒pcDNA3.1/T7-RNAP共转染已接种野生型RV病毒的MA104细胞单层,继续培养24 h,获得了携带NSP4变异基因的RV病毒粒子和野生型RV病毒粒子的混合病毒。将获得的混合病毒接种MA104细胞,通过RNA干扰和蚀斑克隆方法逐步筛选纯化以获得拯救RV。 【结果】 成功拯救出了NSP4基因变异的RV,该病毒在MA104细胞上的病变和致乳鼠腹泻效果较野生型RV明显减弱。【结论】 通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法成功拯救出毒力减弱的RV;NSP4毒力位点135aa、136aa和138aa的变异对RV毒力改变和腹泻严重程度有影响。     

壳聚糖复合膜对黄瓜生理特性的影响

以壳聚糖、甲基纤维素(MC)和单甘酯为复合涂膜材料,按照 L₉ (3³) 正交试验优化涂膜配方,研究了不同浓度涂膜后黄瓜贮藏过程中的生理变化,从而确定最优涂膜浓度。结果表明：壳聚糖复合膜的膜特性良好,涂布均匀,可有效保持黄瓜的感官品质,降低失重、呼吸强度、硬度;减少可溶性固形物及叶绿素含量的损失;壳聚糖的保鲜效果达到显著水平。复合膜的最优涂膜浓度为壳聚糖 2.0 %、单甘酯 0.2 %、MC 0.2 %。     

毛细管电泳快速检测限制性内切酶酶切产物

[目的]建立1种利用毛细管电泳快速、高效检测限制性内切酶酶切产物的方法。[方法]以甲基纤维素(MC)为筛分介质,用PBR322/BsuRⅠDNA Marker为试验对象,研究筛分介质浓度、pH值、毛细管柱温度和电场强度对毛细管电泳法分离小片段双链DNA的影响,寻求最佳电泳条件,并将此方法用于检测MspⅠ内切酶的酶切产物。[结果]MC浓度对双链小片段DNA的分离度有较大影响。随MC溶液浓度的增加,分离度呈先增后减的趋势。毛细管电泳的最佳条件为:MC浓度为2.0%,pH值为8.0,毛细管柱温度15℃,电场强度为275 V/cm。在此条件下,对MspⅠ内切酶的酶切产物进行检测,在20 min内检测到3个酶切片段。[结论]与平板凝胶电泳相比,运用毛细管电泳检测小片段限制性内切酶酶切产物更高效。     

新城疫GM2分离株蚀斑克隆纯化及毒力测定

新城疫（newcastle disease,ND）是世界公认的最重要的家禽疫病之一,伴随着NDV活疫苗的广泛使用,野外分离的新城疫病毒往往由多种强弱病毒混合而成。为了避免不同分离株干扰,必须通过蚀斑纯化将混杂在一起的不同NDV毒株区分开来。文章采用蚀斑纯化技术对野外分离毒新城疫GM2进行蚀斑纯化,并对蚀斑纯化前后病毒的生物学特性进行测定,结果显示,该分离毒蚀斑纯化前MDT,ICPI,IVPI分别为50.5,1.78,2.41,蚀斑纯化后MDT,ICPI,IVPI分别为47.5,1.89,2.65。     

H9N2型禽流感病毒HA基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达

采用异硫氰酸胍法提取禽流感病毒分离株的SPF鸡胚尿囊毒RNA,利用RT-PCR技术扩增出禽流感病毒HA基因的cDNA。将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后,亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis,筛选到重组质粒,测序正确后与线性化的杆状病毒DNA(Bac-NBlueTMDNA)共转染Sf9昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑,经三轮蚀斑纯化,获得数株重组杆状病毒rpBlueBacHisH9HA。提取重组病毒DNA,经PCR证明目的基因片段已插入到杆状病毒基因组中,血凝实验、SDS-PAGE实验结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的Highfive细胞中获得了表达。     

哈尔滨地区新城疫病毒的分离鉴定及部分生物学特性研究

2012年4月~2014年4月,从哈尔滨市18个地区鸡场中疑似新城疫(ND)发病鸡群体内分离到6株具有血凝活性的病毒,经血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)和电镜观察证实了6株病毒为新城疫病毒(NDV)。经蚀斑纯化后进行生物学特性的研究显示,其鸡胚平均死亡时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)分别为37.2~60.8 h、1.71~1.80,说明该病毒属于NDV强毒株或中强毒株。     

虎纹蛙消化道肥大细胞的组化性质

采用改良甲苯胺蓝(MTB)、阿利新蓝—沙黄(AB-S)、甲基绿—派洛宁(MG-P)、天青Ⅱ—伊红—瑞特、硫堇及PAS-HE等6种组织化学染色方法,对虎纹蛙消化道肥大细胞(MC)的组化性质进行了研究.结果表明:虎纹蛙消化道中食管、胃贲门、胃体、胃幽门、空肠、十二指肠、回肠、直肠等部位均有MC分布;MC呈长梭形、圆形、卵圆形、不规则形,主要存在于黏膜固有层或黏膜下层内,有沿血管和腺泡周围分布的趋向.在6种染色法中,用MTB染色效果最好,MC易定位,组织结构清晰可辨,胞质呈紫红色;其次为AB-S染色,而MG-P及天青Ⅱ—伊红—瑞特的染色效果一般,硫堇染色效果差,PAS-HE染色则不着色.     

新城疫病毒在鸡胚成纤维细胞中的培养及纯化

利用鸡胚成纤维细胞对新城疫毒株GM0511株进行增殖培养和蚀斑法纯化,通过对最适细胞密度、病毒最佳接种浓度、覆盖琼脂糖浓度、蚀斑形成时间等条件进行优化摸索,最终获得产斑时间一致,蚀斑大小一致、出斑整齐的纯化新城疫毒株,并使原病毒血凝效价提高2个滴度,为后续实验奠定基础。     

鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)纯化及其检验

在鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)分离鉴定试验确定为鸽副黏病毒Ⅰ型强毒株的基础上,对该病毒株进行了蚀斑纯化,获得了鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)纯化毒株,并对纯化株传代后进行无菌检验、血凝试验、血凝抑制试验和病毒含量测定。结果显示,该纯化毒株纯净、有血凝性和血凝抑制性,病毒含量为10~(8.5)ELD_(50)/0.1 mL,初步判定纯化的鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)可作为鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)免疫效力试验攻毒毒株。     

利用反向遗传操作技术拯救重组新城疫病毒

将新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Anhinga株的全长cDNA的克隆质粒以及L、P、NP的表达质粒共转染稳定表达T7 RNA聚合酶的BSRT7/5细胞,得到拯救病毒。通过RT-PCR扩增、酶切鉴定、测序验证拯救病毒中分子标签的存在,并通过血凝试验测定病毒的血凝效价、测定蚀斑形成单位确定病毒滴度,从而证明病毒拯救成功。新城疫病毒Anhinga株的拯救成功为该病毒进行结构基因研究和疫苗研制奠定了基础。     

橡胶树几种简易抗旱种植方法比较试验

利用废旧的报纸、编织袋、地膜和杂草作覆盖物与常规方法(无覆盖物)进行抗旱定植对比试验,结果表明:有覆盖物25 d后的定植成活率和30 d后的土壤含水量均远高于无覆盖物;其中,用地膜覆盖同时在上面盖沿5～8 cm厚的土壤定植成活率达到100%,30 d后土壤含水量仍达到20%以上.所以,定植后用报纸、编织袋、地膜和杂草覆盖苗木,不但定植成活率高.技术简单可行,而且成本低,还可以废物利用.