猪圆环病毒2型DY株ORF2基因在Sf9昆虫细胞中的表达

本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1^TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。     

鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因在杆状病毒表达系统中的表达

将鸡传染性贫血病毒M9905株VP1、VP2基因分别或同时克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDUAL中，然后转化到DHIOBAC感受态细胞中与Bacmid杆状病毒穿梭载体进行转座重组，最后将重组子转染Sf9昆虫细胞，得到分别或同时含VP1、VP2基因的重组杆状病毒rBacVP1、rBacVP2及rBacVP1—2。PCR扩增结果证实VP1、VP2基因重组到杆状病毒基因组中；SDS-PAGE电泳分析和间接免疫荧光试验结果表明VP1、VP2基因在重组病毒中得到了表达。     

Expression of Recombinant bovine L-selectin in Escherichia coli and insect cells.

Bovine L-selectin was expressed in bacteria using pGEX vector and in insect cells infected with recombinant baculovirus in order to obtain recombinant protein for preparation of specific antiserum and its functional studies. In bacterial expression, L-selectin fusion protein with glutathione S-transferase was detected in the insoluble fraction with the expected molecular weight of 60 kDa by SDS-PAGE and reacted with anti-bovine CD62L monoclonal antibody in immunoblot analysis. In insect cells infected with recombinant baculovirus, a band corresponding to L-selectin was not observed in SDS-PAGE with protein staining, but they apparently reacted with anti-bovine CD62L monoclonal antibody in immunoblot analysis. Furthermore, the indirect immunofluorescence test revealed that bovine L-selectin was efficiently expressed on the surface of Sf9 cells infected with recombinant baculovirus, and flow cytometric analysis showed that the percentage of CD62L positive cells in bovine PBMC was about 66% and that most Sf9 cells infected with recombinant baculovirus had specific immunofluorescence.     

口蹄疫病毒P12X3C3D多基因编码蛋白在昆虫细胞中的表达与检测

利用杆状病毒表达系统构建了包含有口蹄疫病毒（FMDV）P12X3C3D多基因片段的重组杆状病毒。将该病毒感染Sf9细胞后，利用SDS—PAGE及夹心ELISA方法检测目的蛋白的表达。结果表明，重组杆状病毒能够表达FMDV目的蛋白，该表达产物能被FMDV阳性血清识别，具有一定的反应原性。     

V5标记的猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒表达载体的构建

试验旨在利用真核表达系统构建V5标记的猪圆环病毒2型（PCV2） Cap蛋白的表达载体。采用基因工程技术将V5标签引入到PCV2 ORF2基因C末端,并将标记基因定向克隆入pFastBacHTA载体,将pFastBacHTA-ORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使用脂质体介导法将鉴定后的重组杆状病毒质粒转染于Sf9细胞中;运用间接免疫荧光试验（IFA）、SDS-PAGE和Western blotting试验对Sf9细胞中V5标记Cap蛋白的表达进行验证。结果显示,本试验成功将V5标签引入到PCV2 ORF2基因末端,pFastBacHTA-ORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后获得了Bacmid-ORF2-V5重组杆状病毒质粒;IFA、SDS-PAGE和Western blotting试验结果显示,在Sf9细胞中能检测到重组杆状病毒V5标记的PCV2 Cap蛋白,具有良好的反应原性,说明本试验成功获得一株rAcMNPV Cap-V5重组杆状病毒。试验结果为PCV2标记亚单位疫苗的研制提供一定的理论依据。     

禽流感病毒核蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地扩增了我国禽流感病毒分离株Ａ／Ｘｉｎｇｊｉａｎｇ／１／９６（Ｈ１４Ｎ５）的核蛋白（ＮＰ）基因,其限制性内切酶图谱和核苷酸序列与鸭源的标准Ｈ１４Ｎ５毒株几乎完全一致,与其它毒株则有较大差异,说明该鸡源分离株与鸭源毒株有非常近的亲缘关系。将ＮＰ基因定向克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３中,再与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－ＢｌｕｅＤＮＡ）共转染于Ｓｆ９昆虫细胞中,经过三次蚀斑筛选,获得重组病毒ｒＢ２。用其细胞表达产物裂解后作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ,结果表明ＮＰ基因在杆状病毒系统中获得了表达。同时用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与现行标准禽流感琼扩抗原具有相同的生物学活性。     

鸭圆环病毒PT07基因组序列测定与分析

本研究采用PCR方法从临床健康的番鸭法氏囊组织中分段扩增获得鸭圆环病毒(DuCV)PT07全长基因组,将扩增片段分别克隆,获得重组质粒,测序结果表明,DuCV基因组全长为1988nt。经基因组结构分析发现,DuCVPT07的基因组有3个开放阅读框(ORF),其中V1/rep和C1/cap是2个主要的ORF,分别编码Rep蛋白和Cap蛋白;在V1/rep和C1/cap的5'起始端之间存在与启动滚环复制有关的1个茎环结构和1个正向重复序列。遗传进化分析发现,DuCV可分为2个群,PT07与TC1/2002～TC4/2002和FJ0604同处一个进化分支,而与Ger、33753-52和MH25关系较远。     

基因Ⅶ型新城疫病毒F蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫效力研究

本试验旨在利用杆状病毒表达系统对基因Ⅶ型新城疫病毒（NDV）F基因进行表达研究。RT-PCR扩增F基因,将其克隆到pFastBac HT A载体中,阳性重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得含F基因的重组杆状病毒质粒,重组病毒感染Sf9细胞72 h后,进行SDS-PAGE电泳、间接免疫荧光和Western blotting检测。免疫SPF鸡,间接ELISA测定抗体滴度,攻毒保护试验检测重组F蛋白保护性。结果显示,F蛋白在昆虫细胞中能够特异性表达,该蛋白诱导了高滴度的NDV特异性抗体,具有良好的免疫原性;重组F蛋白免疫组攻击保护率达到90%,明显高于阴性对照组。本研究结果为NDV新型亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

Study on Secretory Expression and Immunogenicity of PPRV F Gene in Insect Cells

This study was aimed to explore the use of baculovirus expression system to secrete peste des petits ruminants virus (PPRV) F gene protein and use it as subunit vaccine. The gene fragment encoding F protein of PPRV was cloned into the baculovirus pFastBac Ⅰ transfer vector with a honeybee melittin signal peptide.The constructed F-pFastBac was transformed into Escherichia coli DH10Bac,resulting the recombinant baculovirus DNA (F-Bacmid) which was confirmed by blue-white plaque assay and antibiotic resistance selection.The F-Bacmid was then transfected into Sf9 insect cells by the cellfectin transfection reagent.The recombinant F protein was expressed in High Five cells in the serum-free medium.The SDS-PAGE and Western blotting analysis of recombinant protein showed that the protein could be expressed in insect cells and secreted into the culture medium. For the immunogenicity study,the recombinant protein was then inoculated into BALB/c mice, the results showed that the recombinant protein was able to stimulate B cells to produce special antibodies. In conclusions,the recombinant baculovirus expressing F protein of PPRV were successfully constructed.This study applied a basis for the development of PPRV subunit vaccine.     

Study on Expression and Immune Effect of F Protein of Newcastle Disease Virus Type Ⅶ in Insect Cell

This experiment was conducted to study the protein expression of F gene of Newcastle disease virus (NDV) type Ⅶ by baculovirus expression system.The F gene was amplified by RT-PCR and cloned into pFastBac HT A plasmid, and then the recombinant plasmid was transformed into DH10Bac competent cells to get the positive recombinant bacmid.After 72 h transfection of Sf9 cell with recombinant bacmid, the expression of interest protein was detected by indirect immunofluorescence assay (IFA), SDS-PAGE analysis and Western blotting. Serum antibody titers of immunized SPF chickens were determined by ELISA and the protective properties were determined by protection test. The results showed that F gene was expressed in Sf9 cells infected with the recombinant baculovirus. The expressed protein could induce high titer specific antibody against NDV. The protective rate of recombinant F protein group was 90%, which was significantly higher than that of the negative control group. These results laid a foundation for study on NDV subunit vaccine.     

传染性造血器官坏死病病毒糖蛋白杆状病毒表达系统的构建及其抗原性分析

为研究传染性造血器官坏死病病毒（infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV）主要结构蛋白糖蛋白（G）,本研究采用RT-PCR方法从IHNV中提取RNA并进行反转录,经PCR方法扩增获得1 380 bp的G蛋白基因片段,将其克隆到pFB-LIC-Bse杆状病毒载体中,成功构建了重组质粒pFB-LIC-Bse-G,转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,获得了重组杆粒rBacmid-G。将重组杆粒转染至Sf9昆虫细胞,获得了重组杆状病毒。间接免疫荧光（IFA）和Western blotting分析显示,重组G蛋白可与抗组氨酸单抗（Anti-His）、抗IHNV鼠血清发生特异性反应,表明本研究克隆的IHNV G蛋白在真核表达系统中得到正确表达,且该蛋白具有良好的抗原性。本试验结果为研究G蛋白的功能及开发IHNV新型疫苗奠定了基础。     

Construction of Baculovirus Expression System and Antigenicity Analysis of Infectious Hematopoietic Necrosis Virus Glycoprotein

To study the major structural protein glycoprotein (G) of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV), glycoprotein gene (1 380 bp) was amplified by RT-PCR from IHNV. In order to construct a recombinant plasmid pFB-LIC-Bse-G, G gene was cloned into the baculovirus vector pFB-LIC-Bse. Then, the constructed plasmid pFB-LIC-Bse-G was transformed into E.coli DH10Bac. The recombinant bacmids rBacmid-G was got, and then it was transfected to insect Sf9 cells,and the recombinant baculovirus that contained G gene was obtained. Western blotting analysis and indirect immunofluorescence assay (IFA) showed that the recombinant G protein could be recognized by histidine monoclonal antibody (Anti-His) and anti-IHNV antibody of mouse. The results indicated IHNV G protein had been expressed correctly in Sf9 cells. The study laid a foundation for further studying the G protein structure, function and immunological characteristics.     

应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH_la株囊膜糖蛋白 (GP5 )基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB中 ,与杆状病毒线性DNA(Bac_N_BlueTMDNA)共转染昆虫细胞sf9,经过三轮蚀斑纯化后 ,获得重组杆状病毒rBac_GP5。用该重组病毒感染sf9细胞后 ,应用间接免疫荧光试验、SDS_PAGE和Westernblot检测表明 ,GP5基因在杆状病毒系统中获得了高效表达 ,表达产物因糖基化程度差异 ,表观分子量有 2 2、2 5和 30kDa三种总计约占细胞蛋白总量的 2 6 .4%。     

表达猪圆环病毒2型Rep蛋白的重组杆状病毒的构建与鉴定

猪圆环病毒2型(PCV2)是近年来新发现的引起断奶仔猪多系统衰弱综合征的主要病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap)。为了探究ORF1基因结构及其与功能的关系,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将PCV2的ORF1基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTMDual中,获得重组转移载体pFBD-ORF1,再将其转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,经蓝白菌落筛选获得含有ORF1基因的重组穿梭载体rBacmid-ORF1,经脂质体介导转染昆虫细胞sf9,获得重组杆状病毒rAc-Rep,SDS-PAGE和Western-blotting分析可见大小约为36ku的特异性条带,表明rAc-Rep在sf9中成功表达了PCV2Rep蛋白。     

小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因在昆虫细胞中的分泌表达及免疫原性研究

试验旨在探索利用杆状病毒表达系统分泌表达小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV） F基因蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PPRV F基因克隆到已插入蜂毒信号肽（melittin）的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含F基因的重组杆状病毒DNA （F-Bacmid）,转染提取的F-Bacmid DNA至Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒（F-rBac）,应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白;Western blotting结果显示,重组蛋白可被PPRV的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有反应原性;应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠试验结果显示,该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。本研究成功分泌表达了PPRV F蛋白,该蛋白能够刺激机体产生免疫应答,为小反刍兽疫亚单位疫苗的研制奠定基础。     

PRRSV核衣壳蛋白基因在杆状病毒中的表达

根据已发表的猪生殖 -呼吸道综合征病毒 ( PRRSV) CH-1 a分离株核衣壳 ( N)蛋白基因核苷酸序列和杆状病毒转移载体 p Blue-Bac-His B多角体蛋白阅读框架 ,设计合成了 1对特异性引物 P7S1 /P7R1。应用PCR对重组质粒 p UC1 8-ORF7扩增 ,获得了 CH-1 a株 N基因的片段。经 Hind 和 Bgl 双酶切 ,将其定向克隆到同样双酶切的 p Blue-Bac-His B的 PH启动子下游 ,获得转移载体 p Blue-Bac-His B-ORF7。将转移载体p Blue-Bac His B-ORF7与苜蓿银蚊夜蛾多核型多角体病毒 ( Ac MNPV,简称杆状病毒 )线性化 DNA ( Bac-N-Blue TMDNA)共转染 Sf9细胞 ,经过蓝斑筛选和蚀斑纯化 ,获得重组病毒 r Bac7。经用引物 P7S1 /P7R1和杆状病毒多角体蛋白基因通用引物 PCR鉴定 ,证明目的基因已插入到杆状病毒中。将重组病毒接种于对数生长期的 Sf9细胞 ,分别于感染后 2 4、4 8、72、96、1 2 0 h收集感染细胞 ,经 SDS-PAGE和 Western blot分析 ,结果表明 ,细胞接种重组病毒 2 4 h即开始表达重组蛋白 ,至 96h达到峰值 ,占整个细胞蛋白的 8.4 % ,此后开始下降。表达产物为融合蛋白 ,大小约 2 0 0 0 0。将重组病毒感染的 Sf9细胞用抗 PRRSV N蛋白的单克隆抗体SDOW-1 7进行间接免疫荧光试验 ,结果在细胞浆和细胞核中观察到了特异性的亮绿     

蜂王浆主蛋白2在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达蜂王浆主蛋白2（MRJP2）,为后续MRJP2功能的深入研究提供材料。根据GenBank中意大利蜜蜂（Apis mellifera L.）MRJP2基因序列,经PCR扩增、克隆至真核表达载体pFastBac1,构建重组杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid并转染至Sf9昆虫细胞,以P2代杆状病毒感染Sf9细胞进行诱导表达,利用层析柱和离子交换柱对表达产物进行纯化,并通过SDS-PAGE、Western blotting及四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪（Q Exactive）对目的蛋白进行分析验证。结果显示,本试验成功构建杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid,转染至Sf9昆虫细胞并获得表达产物。SDS-PAGE和Western blotting验证结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为52 ku的MRJP2重组蛋白,且纯度较高;质谱分析结果显示,该重组蛋白匹配到蜜蜂蛋白质数据库中MRJP2的特异性肽段为39个,序列覆盖率为61%,且与MRJP2的匹配得分最高,进一步确认该重组蛋白为MRJP2。本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统成功表达出MRJP2,为后续该蛋白生物学功能的深入研究奠定了基础。     

传染性支气管炎病毒非结构蛋白nsp5在真核细胞中的重组表达及鉴定

本文以嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)毒株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得IBV非结构蛋白5(non-structural protein,nsp5)基因片段后,构建了杆状病毒重组质粒IBVnsp5-Bacmid。IBVnsp5-Bacmid转染Sf9细胞,获得nsp5重组杆状病毒,经(immunofluorescence assay,IFA)和Western blot检测到转染细胞表达的nsp5蛋白。进一步从感染的细胞中纯化重组蛋白,并用纯化的蛋白免疫小鼠制备了抗nsp5的多抗血清,该多抗血清可检测到IBV四川株SC021202感染的DF-1细胞中特异性的nsp5蛋白。结果表明IBV nsp5在Bac-to-Bac真核表达系统中获得了成功表达,而且具有良好的免疫原性和反应原性。     

小反刍兽疫病毒N基因在昆虫细胞中的表达

为了研发小反刍兽疫病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原物质,参照GenBank公布的小反刍兽疫疫苗株Nigeria75/1的全基因组序列(GenBank登录号:X74443),人工合成表达核蛋白的N基因开放阅读框序列,通过PCR扩增、经引物设计引入的EcoRⅠ和KpnⅠ特异性酶切位点,将N基因克隆于昆虫杆状病毒表...