鸡、鹌鹑及其杂交禽胚胎肌肉发育过程中MSTN和p21基因的表达规律

旨在研究MSTN和p21基因在鸡、鹌鹑和杂交禽胚胎肌肉发育过程中的表达规律,比较这2个基因在杂交禽与亲本鸡和鹌鹑中的差异表达,探讨MSTN和p21基因与肌肉发育的关系。通过人工受精获得鸡(♂)与鹌鹑(♀)杂交禽蛋,与鸡蛋、鹌鹑蛋按照鸡标准孵化条件同批入孵,采集第7～17天活胚胸肌组织,应用实时荧光定量PCR技术检测MSTN和p21基因在3个物种中每一天mRNA的相对表达量。MSTN和p21基因在胚胎肌肉发育的第7～17天均有表达,这2个基因mRNA的表达在鸡胚中第9天到达第1次峰值,在鹌鹑中第7天到达第1次峰值,后都随胚胎的发育表达水平上升,并维持相对稳定的高水平表达。杂交禽的表达规律与鸡一致,也在第9天达到峰值,而p21mRNA表达极显著高于鸡和鹌鹑(P<0.01)。MSTN mRNA表达规律与成肌细胞退出细胞周期的时间规律一致;在胚胎肌肉发育过程中,MSTN基因特异性上调p21的表达。     

鸡胚肢芽发育机理的研究进展

由于鸡胚是在蛋内完成发育,有利于人们方便地进行实验操作,所以它作为了解脊椎动物肢芽发育的理想模型,具有其他生物无法比拟的特点。经典的发育生物学为我们提供了鸡胚发育命运图,并阐明了肢芽发育模式划分中细胞间相互作用的关系。而最早用化学手段模拟这些细胞间相互作用的试验也始于鸡胚的研究。研究表明,Shh和Bmp等基因表达决定着肢芽发育。鸡的基因测序更为我们方便地进行研究提供了机会。本文对鸡胚早期肢芽发育情况进行了介绍,并阐述了早期鸡胚肢芽发育的分子机理以及各个基因之间相互作用的关系,为进一步研究动物肢芽的发育机制提供参考。     

鸭早期胚胎分离及不同发育阶段形态学观察

研究旨在建立快速分离鸭早期胚胎的方法,并观察鸭早期胚胎体节、神经系统、心脏、肢芽与胚胎外部轮廓发育特点,为以鸭胚胎为模型开展相关生物学研究提供资料。通过分离鸭早期不同阶段的胚胎、制作石蜡切片和显微观察,了解鸭胚早期发育各阶段的不同形态学特点。结果表明:鸭的卵裂为盘状卵裂;体节形成开始于孵化后27h左右;心脏从原基经发育成外形呈"S"型,直至心脏随躯体翻转完全向左;胚胎外部轮廓的变化依次为:长条状、头颈部开始弯曲,整体呈"C"型,整体呈"O"型。研究初步整理了鸭早期胚胎发育形态特点,并建立了以滤纸为载体分离鸭早期胚胎的方法,该方法对胚胎的损伤小,更易清理胚胎上的残余物质。     

高邮鸭和金定鸭胸肌早期发育及MyoD1基因表达分析

 
采用qPCR分析生肌调节因子MyoD1基因在高邮鸭和金定鸭胚胎期及初生早期(13、17、21、25、27胚龄和出雏后7日龄)胸肌发育中的表达模式以及与胚胎和胸肌发育的相关性。结果表明,MyoD1 mRNA在两个品种鸭胸肌早期发育中表现出一致的表达规律,均呈“波浪形”,在13胚龄时表达量相对较高,17胚龄时下降,21胚龄时上升到最高,随后下降,出雏后又维持较高水平;品种间比较结果显示除了在25胚龄时金定鸭胸肌中MyoD1 mRNA表达量稍低于高邮鸭,在其他所检测的胚龄/日龄中,金定鸭胸肌中MyoD1 mRNA表达量均高于高邮鸭胸肌中的表达量(P>0.05);高邮鸭胸肌MyoD1 mRNA表达与胚胎和胸肌发育无显著相关性,而金定鸭胸肌中MyoD1 mRNA的表达与其胚胎和胸肌发育呈强负相关(P胚重=0.048;P胸肌重=0.006)。MyoD1基因参与鸭胚胎期及出雏早期胸肌的发育,胸肌中MyoD1基因表达分析研究为进一步深入研究MyoD1基因在胚胎期胸肌发生过程及其调控机理中的功能提供一定的理论依据     

利用DGE筛选早期雌性鸡与鹌鹑属间杂交种性分化相关基因

已有研究表明鸡与鹌鹑属间杂交种胚胎早期死亡与性别分化存在关联性,本试验通过高通量测序构建数字基因表达谱(DGE)筛选雌性鸡与鹌鹑杂交种早期(3d)性别分化的相关基因,有助于揭示胚胎性腺分化时期相关基因与其早期死亡间的作用,利用实时荧光定量PCR技术对筛选出与相关表达差异基因进行验证。结果表明,构建雌雄鸡、雌雄杂交种3d胚胎DGE文库,雌鸡与雄鸡之间差异表达基因中有25个上调,41个下调;雌杂交种与雌鸡之间差异表达基因中有55个上调,175个下调;雌杂交禽和雄杂交禽之间差异表达基因中有36个上调,36个下调;这些差异基因大都与胚胎生长发育、细胞分化繁殖相关基因为代表。GO功能富集分析表明,差异表达基因主要定位在参与细胞增殖、分化、胚胎发育等行使催化、促进生物学过程的功能;Pathway分析得出,雌雄鸡、雌鸡与雌杂交种、雌雄杂交种的差异基因分别富集在12、13、15条pathway中。分析推测得出可能由于这些差异基因在体内紊乱表达,导致调控胚胎发育、分化相关信号通路异常是雌杂交种早期死亡原因之一,筛选出的差异基因将为后续的雌性杂交种早期发育、死亡研究提供依据。     

山羊早期胚胎发育相关基因的克隆

用单胚构建的mRNA差异显示技术,对体外培养的山羊早期2、4、8～16细胞期胚胎的基因表达进行了研究,并筛选到了1条在8～16细胞期胚胎特异表达的条带进行分析。结果表明,该片段与犬细胞周期蛋白B3（CCNB3）基因具有82%的同源性。该基因作用和调控细胞的分裂活动,是羊早期胚胎发育过程中的重要影响因素。     

FGF4在牛早期胚胎发育过程中的表达

应用实时荧光定量PCR和免疫荧光染色技术对成纤维生长因子4(FGF4)在牛早期胚胎发育各个阶段的表达和定位规律进行研究。结果表明,FGF4mRNA及蛋白在牛MⅡ期卵母细胞及各阶段早期胚胎均有表达,其表达量由强到弱依次为桑椹胚、囊胚、8-细胞胚、MⅡ期卵母细胞、4-细胞胚、2-细胞胚;从定位来看,FGF4在MⅡ期卵母细胞及8-细胞期前的各阶段早期胚胎的细胞质和细胞核中均有表达,而8-细胞期及之后的桑椹胚和囊胚期仅分布于细胞质。结果提示,FGF4在牛的早期胚胎发育过程中可能发挥重要作用。     

MLP在肉鸡、蛋鸡及其与鹌鹑属间杂交禽胚胎肌肉发育过程中的差异表达

本研究旨在探讨MLP基因在蛋种鸡(♂)×鹌鹑(♀)和肉种鸡(♂)×鹌鹑(♀)子代杂交禽胚胎肌肉发育过程中的表达规律,以及该基因在2种杂交禽中的差异表达情况。通过人工受精获得蛋鸡、肉鸡(♂)与鹌鹑(♀)杂交禽蛋,将4种受精蛋在相同条件下孵育。通过实时荧光定量PCR对7~17d胚胎胸肌组织中MLP基因的mRNA相对表达量进行测定,4种胚胎样品每天各测1次。结果显示,在胚胎肌肉发育的7~12d,4个物种的MLP mRNA表达水平很低,且在13d出现瞬时增高。其中,MLP mRNA的表达在鹌鹑胚胎发育14d达到高峰,在肉鸡胚胎发育的15d达到高峰。肉杂交禽在13~17d维持相对稳定的高表达水平,并在14,16d达到高峰。而蛋杂交禽在15d达到高峰后出现极显著性下降。上述结果表明,MLP mRNA的表达规律与肌管融合相一致,可能参与到肌管的融合过程,MLP可能在胚胎肌肉生长和发育过程中起调控作用。     

基于转录组测序鉴定雌性鸡胚性腺不对称发育相关候选基因

本研究旨在通过转录组测序（RNA-seq）鉴定雌性鸡胚性腺不对称发育相关候选基因,为确定雌性鸡胚性腺不对称发育的分子机制提供参考。随机选择6胚龄（E6）和8胚龄（E8）的雌鸡胚胎各18～24只,分离并采集其两侧性腺,每6～8个同侧同期性腺组成一个样品,匀浆后提取总RNA经质控后送商业公司进行转录组测序。每个样品3个生物学重复。通过基因差异表达分析,GO、KEGG信号通路分析和基因集变异分析（GSVA）,筛选雌性鸡胚性腺不对称发育相关候选基因和生物学通路。经实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对筛选出的差异表达基因进行验证。转录组差异表达分析结果显示雌性鸡胚左右两侧性腺在E6和E8分别存在195个和315个差异表达基因。GO功能富集和KEGG信号通路富集分析发现两侧性腺差异表达基因主要富集在卵子发生、细胞发育、piRNA代谢过程等生物学过程并筛选出Pou5f3、STK31、DMRTB1等与鸡胚性腺不对称发育相关的功能基因。本研究为进一步研究雌性鸡胚性腺不对称发育的分子调控机制提供了参考。     

基于转录组测序挖掘雌性鸡胚性腺不对称发育中的重要lncRNA及其靶基因

为了挖掘雌性鸡胚性腺不对称发育中的重要长链非编码RNA(lncRNA)及其靶基因，试验以采集的胚胎孵化第9天(E9阶段)的雌性鸡胚两侧性腺为研究对象，采用转录组测序(RNA-seq)技术和生物信息学方法对雌性鸡胚左右两侧性腺进行转录组分析预测lncRNA,运用DESeq2 v1.30.1软件鉴定两侧性腺间差异表达的mRNA和lncRNA,预测差异表达lncRNA的顺式和反式靶基因，对靶基因进行GO功能注释和KEGG信号通路分析；通过实时荧光定量PCR扩增验证重要靶基因的表达。结果表明：转录组分析预测出653个基因间lncRNA,467个内含子lncRNA,1 339个反义lncRNA。雌性鸡胚左右两侧性腺间有1 856个差异表达mRNA和443个差异表达lncRNA。GRIA1、DIO3、FSHR、LHX9、CYP17A1和TOX3等229个基因为差异表达lncRNA的靶基因。两侧性腺差异表达lncRNA的靶基因主要富集到了类固醇代谢过程、细胞内雌激素受体信号通路的正向调节、代谢通路等过程。实时荧光定量PCR扩增验证重要靶基因的表达结果与RNA-seq结果基本一致。说明雌性鸡胚左右两侧...     

Cdc42调控细胞骨架影响破骨细胞分化的研究

研究Cdc42在破骨细胞分化成熟过程中的作用及分子机制。采用慢病毒干扰技术构建Cdc42沉默的RAW264.7细胞株,经嘌呤霉素筛选出稳转株。利用荧光定量PCR与Western blot检测其沉默效率。采用TRAP染色观察细胞分化能力。利用激光共聚焦显微镜观察Cdc42沉默经微丝和微管对细胞伪足形成的影响。利用荧光定量PCR与Western blot检测TRAP、PAK4、Cofilin转录和蛋白表达水平。与对照组比较,Cdc42沉默组Cdc42基因的转录极显著下降,蛋白表达水平显著下调,基因沉默效率在50%以上。TRAP阳性破骨细胞数量也急剧减少,细胞呈圆形。丝状伪足和板状伪足减少,TRAP、PAK4、Cofilin转录水平极显著下降,关键蛋白PAK4和Cofilin蛋白表达显著或极显著下调。Cdc42可通过调控细胞骨架蛋白,经丝状伪足和板状伪足,影响破骨细胞的分化。     

禽白血病病毒B、E和J亚群基因芯片检测方法的建立

目的基于多重PCR技术,建立禽白血病病毒(ALV)的B、E、J亚群的基因芯片分型和检测方法。方法根据NCBI已收录的ALV三个亚群的参考毒株cDNA序列,在各亚群特异性基因突变区两端选取其保守区域,设计合成三个亚群的通用上游引物1条,以及B、E亚群的通用下游引物和J亚群下游引物各1条,将上述引物用Cy3标记,建立多重PCR体系;参考靶序列内部的三个亚群各自的保守区域,选择亚群之间基因突变位点多的区域,设计合成5条寡核苷酸探针,制作寡核苷酸探针基因检测芯片;以寄主细胞DF-1中提取传代ALV的cDNA,以及合成NCBI收录的各亚群参考毒株的cDNA序列作为检测模板;利用Cy3标记的PCR扩增产物,与基因芯片进行杂交反应,扫描结果。结果芯片准确检测并分型三个亚群的参考毒株,其检测灵敏度能够达到102个基因拷贝,且与禽类常见的四种病毒均无交叉反应。结论本研究结果证明,基因芯片技术是一种ALV的B、E和J亚群进行检测和分型的有效方法,且具有较高的特异性和灵敏度,为今后在临床应用中快速鉴别诊断ALV等免疫抑制病提供可行性。     

新疆绵羊种布鲁氏菌OMP25基因的分子克隆及核苷酸序列的测定

根据GeneBank库上国际标准菌株绵羊种布鲁氏菌（63／290）的OMP25的基因序列设计引物，用聚合酶链式反应（PcR）技术从新疆绵羊种布鲁氏菌（80／019）基因组DNA中扩增出OMP25基因片段，TtDNA连接酶将其连接于PBS-T克隆载体质粒上，将重组质粒转化到受体菌DH10B中，蓝白斑筛选阳性菌落，结果成功克隆OMP25基因片段，进行核苷酸序列测定，测序结果分析表明：新疆绵羊菌株与国际标准菌株有明显差异。     

Characterization of Listeria monocytogenes isolates by Southern blot hybridization

A synthetic deoxyribonucleotide probe for virulent Listeria monocytogenes, designated ADO7, was evaluated for its ability to identify restriction fragments of L. monocytogenes with nucleic acid sequences homologous with the beta-hemolysin gene by Southern blot hybridization of clinical and food isolates. The synthetic probe hybridized with three restriction fragments (approximately 1.1, 0.86, and 0.76 kb) of the serotype 1/2A isolates. Southern blot hybridization of the serogroup 4B isolates indicated that the nucleic acid sequences homologous with the beta-hemolysin gene probe were limited to a single restriction fragment of approximately 1 kb.     

A pathogenesis study of foot-and-mouth disease in cattle, using in situ hybridization.

Eight calves were exposed in an aerosol chamber to nebulized foot-and-mouth disease virus. Two control animals were exposed in a similar manner to cell culture media only. Animals were euthanized at intervals and various tissues examined by in situ hybridization using a biotinylated RNA probe corresponding to a portion of the viral gene coding for the polymerase enzyme. By this technique large amounts of viral nucleic acid were found in coronary band, interdigital cleft and tongue as early as six hours postexposure, indicating a very rapid delivery from the portal of entry to the predilection sites for lesion development. This occurred well before the onset of viremia which by virus isolation was not detectable until 30 hours postexposure. The in situ hybridization signal in these tissues decreased in intensity and extent with time to focally positive areas, occasionally surrounding a vesicle. Other epidermal sites not normally thought of as sites for foot-and-mouth lesion development, such as carpus and eyelid, also had some viral nucleic acid detectable at various time intervals. In the lung by in situ hybridization, alveolar septa had viral nucleic acid early in infection (6-18 h postexposure) while later (36-96 h postexposure), the in situ hybridization signal was prominent in alveolar macrophages.     

SH2B1基因及miR-276-3p对猪背部脂肪沉积的影响

本试验旨在研究SH2B衔接因子蛋白1（SH2B adaptor protein 1，SH2B1）基因在猪不同组织和生长发育各阶段背部脂肪中的表达情况，预测调控该基因的miR-276-3p对猪背部脂肪表达的影响。应用实时荧光定量PCR技术检测SH2B1基因在猪脂肪、下丘脑等6种组织，以及在30、60、90、120和180 d猪背部脂肪组织中的相对表达量。靶标预测SH2B1基因的调控miRNA，并通过实时荧光定量PCR检测miR-276-3p对该基因的调控作用。结果显示，SH2B1基因在猪的6种组织中均有表达，且在脂肪组织中表达量最高，在肌肉组织中表达量最低。在猪生长发育各阶段背部脂肪中SH2B1基因均有表达，在前期（30和60 d）表达量较低，在中、后期（90、120和180 d）持续高表达，且显著高于前期表达量（P<0.05）。高、低背膘厚组背部脂肪中miR-276-3p与SH2B1基因均呈差异表达，且两者表达呈相反趋势，miR-276-3p在高背膘厚组中的表达量显著低于低背膘厚组（P<0.05），而SH2B1基因在高背膘厚组中的表达量却显著高于低背膘厚组（P<0.05）。miR-276-3p可通过靶向负调控SH2B1基因，影响猪背部脂肪的沉积。本试验结果为进一步深入研究猪背部脂肪沉积和背膘厚差异的分子机制提供参考。     

Somatic cell mapping and restriction fragment length polymorphism analysis of bovine insulin-like growth factor I.

The DNA isolated from cow-hamster hybrid somatic cells segregating bovine chromosomes was analyzed by Southern blotting and hybridization with a heterologous [32P]-labeled porcine cDNA probe encoding insulin-like growth factor I (IGF-I). Thirteen of 25 cow-hamster hybrid cell lines exhibited the bovine-specific IGF-I fragment. Analysis for the retention or loss of bovine IGF-I with markers previously screened against the same panel of hybrid cells revealed a 100% concordance with lactate dehydrogenase B of bovine syntenic group U3 located on bovine chromosome 5. Restriction fragment length analyses of genomic DNA from animals representing five breeds (Angus, Polled Hereford, Simmental, Gelbvieh, and Belgian Blue) and from seven half-sib Angus calves indicated that polymorphisms for the genomic composition of the bovine IGF-I gene may exist in cattle populations.     

内源性绵羊肺腺瘤病毒基因在蒙古羊染色体上的分布研究

本研究旨在探究内源性绵羊肺腺瘤病毒基因在蒙古羊染色体上的分布情况.参照已登入GenBank中的内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV,登录号为DQ838493)序列,设计合成1对引物,PCR扩增gag基因的部分片段,用地高辛标记制备探针,利用荧光原位杂交(FISH)技术检测enJSRV在蒙古羊染色体上的分布.结果表明,用en-JSRV的gag基因合成的DNA探针在蒙古羊中期分裂相的6条染色体上均有杂交信号,分别为1q45、1p23、2q41、3q23、6q13、9q22和14q25,其中在6和9号染色体上出现有较强的荧光信号.结果提示,在6和9号染色体上这2个位点上有多拷贝的enJSRV基因,1q45、1p23、2q41、3q23、和14q25拷贝数少,这与内源性绵羊肺腺瘤病毒进化有关.     

Study on Expression of Newborn Ovary Homeobox Gene in Porcine Ovary

Newborn ovary homeobox gene (NOBOX) is one of maternal genes,which is important in early oogenesis.In order to know the expression pattern of NOBOX gene in porcine tissues,Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detected the expression of NOBOX gene in porcine tissues,and then the probe of NOBOX gene was generated and in-situ hybridization were used to detect NOBOX gene localization in porcine ovary.The results showed that NOBOX gene expression was significantly higher in ovary than in other tissues (P<0.01).There was no significant difference in NOBOX gene expression among kidney,liver,mammary gland,muscle and adrenal (P>0.05).In ovary,NOBOX gene was localized in oocyte cytoplasm specifically,but not in granulosa cell.All these results revealed that NOBOX gene was highly expressed in the cytoplasm of procine oocyte,indicating that it played an important role in porcine oocyte and early embryo development.