内源性绵羊肺腺瘤病毒NM株gag基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

提取内源性绵羊肺腺瘤病毒内蒙古分离株（NM）总DNA，参照GenBank中内源性绵羊肺腺瘤病毒enJS56A1株gag基因序列设计1对引物。应用PCR技术特异性地扩增出病毒的gag基因片段，将其克隆到pMD19-T载体中进行测序得到完整的gag基因序列，并用DNAStar软件进行序列分析，分析结果表明，与内源性南非代表毒株enJS56A1（AF153615）的gag基因序列比较，核苷酸同源性为98．9％，推导出的氨基酸同源性为98．4％。与外源性美国代表株JSRV21（AF105220）的gag基因序列比较，核苷酸同源性为89．6％，氨基酸同源性为94．8％。利用生物信息学软件对其蛋白结构进行预测，结果表明gag-enJSRV-NM为一结构松散的蛋白分子，这也是我国首次报道的内源性绵羊肺腺瘤病毒的gag基因的全序列，为我国科研工作者进行更深入的研究奠定了基础。     

绵羊基因组中内源性绵羊肺腺瘤病毒相关序列的确定

绵羊都含有与绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)密切相关的15~20拷贝内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)相关序列。宿主可利用内源性病毒来预防致病性反转录病毒的感染,一些内源性病毒可以有效地干扰相关外源性病毒的复制。本试验通过分子生物学手段确定了蒙古绵羊基因组中含有enJSRV6和enJSRV10两个内源性病毒基因而内蒙古白绒山羊中未发现。通过比较内、外源病毒LTR序列的酶切图谱,获得专一作用外源性病毒的核酸内切酶M spⅠ、TfiⅠ、BsaWⅠ,如果将酶切与聚合酶链式反应(PCR)相结合,不需要经过测序就可分辨enJS-RV和外源性绵羊肺腺瘤病毒(exJSRV),形成"酶切-PCR"检测技术,将为绵羊肺腺瘤病的快速诊断提供了新的手段。     

内源性绵羊肺腺瘤反转录病毒的研究进展

从内源性绵羊肺腺瘤反转录病毒（enJSRV）与外源性绵羊肺腺瘤反转录病毒（exJSRV）基因组结构的比较、enJSRV与绵羊肺腺瘤病（OPA）的关系、enJSRV在羊体内的表达及其系统发育分析等方面综述了enJSRV的研究进展，旨在为早期诊断及预防OPA提出新方法，为揭示该病的分子发病机理及探索其基因治疗提供新思路。     

绵羊、山羊内源肺腺瘤病毒启动子甲基化修饰检测

为分析绵羊和山羊内源性肺腺瘤病毒启动子甲基化修饰状况,参照绵羊、山羊内源性肺腺病毒gag基因上游非编码区序列CpG岛设计特异性甲基化引物,采用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测了5只绵羊和5只山羊胎儿的肺脏、皮肤、血液基因组内源性病毒基因启动子区甲基化情况.结果表明：山羊和绵羊肺脏、皮肤、血液基因组中均存在甲基化和非甲基化的内源性肺腺瘤病毒启动子.     

内源性绵羊肺腺瘤病毒全基因组序列测定与序列分析

参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20全基因组序列设计合成3对引物,应用PCR技术扩增内源性绵羊肺腺瘤病毒基因片段分别连接pMD-18T载体并测序,完成了内源性绵羊反转录病毒基因组序列测定。分析结果显示,测定序列全长7519bp,与内源性绵羊肺腺瘤病毒代表株enJSRV-20核苷酸同源性为99．4％,与外源性绵羊肺腺瘤病毒代表株AF357971．1的核苷酸同源性为90．4％。基于全基因组序列核苷酸的系统进化发生树分析结果显示,扩增序列与enJSRV-20的亲缘关系最近。     

绵羊肺腺瘤病毒中国NM株gag基因3''''端951 bp段的分子克隆与序列分析

究参照Genebank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的全基因序列,设计合成一对引物,对JSRV中国NM株的gag基因3'端中主要编码核衣壳(NC)蛋白的基因段进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现一条约951 bp的特异条带,将其回收后克隆人pMD-18T载体中,并进行序列测定.结果表明,与南非代表株(基因序列号NC-001494)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为95.4%,推导出的氨基酸同源性为95%.与美国代表株(基因序列号AF105220)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为91.3%,氨基酸同源性为91%.这是我国首次报道的绵羊肺腺瘤病毒的gag基因的一段序列,为我国科研工作者进行更深入的研究奠定基础.     

enJSRV囊膜蛋白及其受体的瞬时表达与绵羊绒毛膜滋养层细胞融合的诱导研究

旨在深入研究内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)囊膜蛋白在绵羊胎盘形成过程中的作用,本研究体外培养了蒙古绵羊绒毛膜滋养层细胞,采用RT-PCR技术扩增出enJSRV-env基因及其受体Hyal2基因全长序列,定向克隆于真核表达载体pEGFP-C1上。优化绒毛膜滋养层细胞电转染条件和测定电转效率。将构建好的真核表达质粒分别电转染到绒毛膜滋养层细胞中,在荧光显微镜下观察enJSRV囊膜蛋白及其受体Hyal2的瞬时表达情况。并研究高表达enJSRV-env基因及通过RNA干扰沉默enJSRV-env基因对绒毛膜滋养层细胞的细胞融合活性的影响。结果显示,真核表达质粒构建成功,分别命名为pEGFP-C1/enJSRV-env及pEGFP-C1/Hyal2。研究表明,绵羊绒毛膜滋养层细胞最佳电转染条件为脉冲电压150 V,脉冲时间5.0 ms,电击2次,间隔50 ms。转染pEGFP-C1/enJSRV-env质粒及pEGFP-C1/enJSRV-env与pEGFP-C1/Hyal2共转染的绵羊绒毛膜滋养层细胞中多核细胞数目明显增加,平均每个视野分别可以观察到1.8和2.3个多核细胞。说明enJSRV-env对绒毛膜滋养层细胞的细胞融合有一定的促进作用。本研究为进一步探究enJSRV囊膜蛋白的结构和功能及绒毛膜滋养层细胞融合机理提供试验基础。     

内源性绵羊肺腺瘤病毒env基因的克隆及序列分析

参照GenBank上已发表的内源性绵羊肺腺瘤病毒env基因与5′长末端重复序列保守区序列设计引物,应用PCR技术成功扩增出内源性绵羊肺腺瘤env基因与5′长末端重复序列,将纯化的扩增片段连接pMD18-T克隆载体进行测序获得目的基因序列。应用MEGA4.1、DNASTAR进行序列分析,分析结果表明,内源性env基因具有完整的开放阅读框,内源性env基因序列与内源性绵羊肺腺瘤(AF153615.1)基因同源性高达99.7%,与外源性绵羊肺腺瘤(M80216.1)基因的同源性仅为90.6%;由内源性env基因推导的氨基酸在NCBI进行BLAST比较:与AF153615.1的氨基酸同源性高达100%。内源性env基因编码表达的蛋白具有亲水性。这些结果为研究5′长末端序列对内源性env基因调控等问题提供了重要参考。     

1株山羊内源性肺腺瘤反转录病毒的序列测定与分析

参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20(EF680302.1)全基因组序列设计合成3对引物,以山羊基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增山羊内源性病毒基因片段,分别连接PMD-18T载体并测序,完成了1株山羊内源性肺腺瘤反转录病毒全基因序列的测定。结果分析显示测定序列全长7 480bp,获得的序列与内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-18(EF680301.1)的核苷酸相似性为93.4%,与外源性绵羊肺腺瘤病毒株JS-7(AF357971.1)的核苷酸相似性为88.1%。根据pro基因序列构建系统进化树,结果显示扩增序列与内源性绵羊反转录病毒株en-JSRV-5(EF680305.1)的亲缘关系最近。本研究有助于内源性肺腺瘤反转录病毒感染性克隆的构建和内源性肺腺瘤反转录病毒功能的研究。     

妊娠早期蒙古绵羊子宫内膜enJSRV及IFN-τ基因表达水平的分析

本研究旨在检测内源性绵羊肺腺瘤反转录病毒(enJSRV)与干扰素-τ(IFN-τ)在妊娠早期蒙古绵羊子宫内膜组织的表达以及enJSRV的表达与外周血孕酮水平变化的关系。运用TaqMan实时荧光定量PCR技术和电化学发光法对enJSRV和IFN-τ在妊娠早期蒙古绵羊子宫内膜组织相对表达及孕酮水平进行了测定。实时荧光定量PCR结果显示,enJSRV和IFN-τmRNA在妊娠早期绵羊子宫内膜组织有不同程度的表达。SAS统计学软件分析得出,子宫内膜组织中enJSRV mRNA在妊娠12～14d(交配日为0d)表达较高,2～10、16～30d的表达均低于前者。IFN-τmRNA仅在妊娠12～25d表达,14d达其峰值,30d就不能检出,且差异都极显著(P<0.01)。电化学发光法结果显示,孕酮水平在妊娠2d为0.4ng·mL-1,以后升高,妊娠8～16d维持在8.3ng·mL-1左右,在妊娠19～30d孕酮水平有所下降,30d为2.5ng·mL-1。以上结果提示,子宫内膜组织中enJSRV mRNA的表达与外周血孕酮含量及IFN-τ的变化高度相关,且enJSRV在胎盘的形态发生及生殖生物学方面发挥重要作用。     

组织原位杂交和Taq Man实时荧光定量PCR检测enJSRV及其受体HYAL2在妊娠蒙古绵羊绒毛膜中的表达

为了探究内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)及其受体HYAL2在妊娠蒙古绵羊胚胎发育过程中的可能作用,本试验应用组织原位杂交技术和Taq Man实时荧光定量PCR对其在不同妊娠时期(30、50、70、90、110、130d)蒙古绵羊绒毛膜的分布定位和表达规律进行了研究。原位杂交结果显示,enJSRV及其受体HYAL2 mRNAs在妊娠30、50、130d蒙古绵羊绒毛膜组织的滋养层巨型双核细胞(BNC)、多核合胞体小半鞘翅(SP)和滋养外胚层(Tr)细胞中均有阳性信号表达;荧光定量PCR结果显示,在妊娠各时期绒毛膜组织中均有enJSRV及受体HYAL2的mRNA表达,通过统计学分析enJSRV mRNA的表达量于妊娠50d时最低,70d和110d相对较高,且差异都极显著(P<0.01),到130d时又降低到起始水平;受体HYAL2的表达于130d时表达量最低,90d相对较高,且差异极显著(P<0.01)。而enJSRV与其受体HYAL2 mRNA表达量之间无线性相关性。研究结果提示,enJSRV在绵羊胚胎发育过程中可能参与调节绒毛膜滋养层细胞的生长并影响胎盘的发育。     

enJSRV及其受体HYAL2在妊娠蒙古绵羊胎盘组织中的表达

为了探究enJSRV及其受体HYAL2在妊娠蒙古绵羊的发育过程和肺腺瘤病的致瘤过程中的作用,运用TaqMan实时荧光定量PCR和组织原位杂交技术对其在不同妊娠时期（30、50、70、90、110、130d）蒙古绵羊胎盘的表达规律和分布定位进行了研究。荧光定量PCR结果显示,enJSRV及其受体HYAL2在蒙古绵羊胎盘组织的不同妊娠时期均有表达,通过SPSS统计学分析可以看出,妊娠蒙古绵羊胎盘组织中enJSRV基因的表达于90d时达到高峰,之后开始下降,直至妊娠130d表达量最低,且enJSRV与其受体HYAL2mRNA之间亦无线性相关性。原位杂交结果显示,enJSRV及其受体HYAL2mRNA在妊娠30、50、130d蒙古绵羊胎盘的腺上皮细胞、肉阜、胎盘绒毛叶、间质及滋养外胚层中均有阳性信号表达。enJSRV及其受体HYAL2在不同妊娠时期蒙古绵羊胎盘组织的表达规律和分布定位揭示其在胎盘的形成过程中可能发挥重要作用,且可通过干扰enJSRV的侵入而影响肺腺瘤病的发生。     

Cloning and Sequence Analysis of Mongolian Sheep Brachyury Gene

In order to study Mongolian sheep Brachyury gene DNA sequence, main purpose of this article by using the method of PCR, DNA sequence of Mongolian sheep Brachyury gene cloning and the complete Brachyury gene sequences were obtained for the first time.The sequencing with NCBI BLAST function on the site, comparing the results with the published sequences of sheep Brachyury homology was as high as 99%.We compared these sequences with ten Brachyury genes of human, mouse and other animals in GenBank database.The results showed that the most sequences were identical.Mongolian sheep Brachyury shared a 96.30% amino acid homology with Bos taurus, the highest degree of homology indicated a close genetic relationship, and the Caudata had the lowest homology 58.45%.It could be further confirmed by phylogenetic analysis.Moreover, the results showed that Mongolian sheep Brachyury gene sequence of amino acids and other vertebrates Brachyury gene sequence of amino acids were highly conservative.The research results showed that Mongolian sheep Brachyury gene sequences and other vertebrates Brachyury gene sequences were highly conservative.     

蒙古绵羊Brachyury基因的克隆与生物信息学分析

为了对蒙古绵羊Brachyury基因DNA序列进行研究,试验主要利用PCR技术对蒙古绵羊Brachyury基因序列进行扩增并克隆,首次获得了完整的Brachyury 基因序列。利用NCBI网站上的BLAST功能将测序结果同已发表绵羊Brachyury基因序列进行比对,结果显示同源性高达99%,大部分序列完全一致。将该序列与GenBank数据库中登录的牛、人、大鼠、小鼠、山羊、猴和蝾螈等10个不同物种的Brachyury分子序列进行了比对分析。结果显示,蒙古绵羊Brachyury氨基酸序列与牛Brachyury氨基酸序列同源性最高,为96.30%;最低的则是来源于蝾螈的Brachyury氨基酸序列,仅为58.45%。遗传进化分析进一步证实蒙古绵羊与牛的Brachyury亲缘关系较近,与其他物种则遗传距离较远。此外,序列分析发现蒙古绵羊Brachyury基因高度保守,仅个别碱基发生突变。研究结果表明,蒙古绵羊Brachyury基因序列与其他脊椎动物的Brachyury基因序列也具有高度的保守性。     

Detection and quantitation of a type D retrovirus gag protein in ovine pulmonary carcinoma (sheep pulmonary adenomatosis) by means of a competition radioimmunoassay

A heterologous competition radioimmunoassay (RIA) which consisted of 125I-labeled langur retrovirus major gag protein and goat anti-squirrel monkey retrovirus serum was used to detect a type D retrovirus-associated antigen in tumor cell homogenates, lung fluid, and cell culture supernatant fluids of naturally occurring and experimentally-induced ovine pulmonary carcinoma (OPC, sheep pulmonary adenomatosis). In this assay, there was no cross reactivity between structural proteins of the type D retrovirus and an ovine lentivirus, which frequently co-infects OPC-affected sheep. The sensitivity of the assay was similar to an immunoblotting assay using antiserum to Mason-Pfizer monkey virus major gag protein which had been used previously to detect the OPC retrovirus antigen in tumor homogenates and lung fluids of OPC-affected sheep. All unconcentrated samples of lung fluid collected from five sheep with naturally occurring OPC or six sheep with experimentally induced OPC competed in the competition RIA. The competition RIA titers of the type D retrovirus antigen in lung fluids of lambs with induced OPC were relatively higher than the titers of this antigen in the naturally occurring OPC cases. The competition RIA detected the retrovirus antigen associated with OPC in the culture fluids of four out of five primary lung cultures from OPC sheep tested between 1 and 56 days after culture initiation. Because this RIA is appropriate for the quantitation of OPC-associated antigen, it will provide a means for determination of the target cell type for OPC virus replication in vitro.