快速检测联苯菊酯的胶体金层析试纸条研制

[目的]采用免疫胶体金技术,建立一种快速检测联苯菊酯的试纸条方法。[方法]利用有机合成方法制备了联苯菊酯半抗原,并与载体蛋白偶联得到免疫抗原,利用人工免疫的方法获得其单克隆抗体,通过酶联免疫法对制备的单克隆抗体的性能进行了验证。联苯菊酯胶体金层析试纸条是利用单克隆抗体标记胶体金,并将联苯菊酯抗原与羊抗鼠Ig G分别喷制到硝酸纤维膜上,与样品垫、吸水垫组装在PVC衬板上制备而成。[结果]联苯菊酯胶体金层析试纸条检测限为500~800μg/kg,具有速度快、简单等优点。此外,该试纸条与大部分的拟除虫菊酯没有明显的交叉反应,利用该试纸条可实现对苋菜中联苯菊酯添加试验的准确判定。[结论]胶体金试纸条方法具有前处理简单、检测速度快、可以肉眼判断结果等优点,该试纸条有望实现对果蔬中联苯菊酯残留的快速筛查。     

莱克多巴胺胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制

应用胶体金免疫层析技术建立了一种快速检测莱克多巴胺的方法.采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒,标记莱克多巴胺单克隆抗体并喷于玻璃纤维上,莱克多巴胺偶联OVA抗原和羊抗鼠IgG分别结合于硝酸纤维膜上,依次将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装切割成莱兜多巴胺胶体金免疫层析快速检测试纸条.试验结果表明,陔快速检测试纸条的灵敏度为5 ng/mL,检测时间为5 min,批内和批问重复性为100%,假阳性率和假阴性宰均为0.     

农产品中玉米赤霉醇ELISA检测试剂盒的研制与应用

[目的]建立快速、有效检测农产品中玉米赤霉醇(ZER)残留量的方法。[方法]试验以人工合成的ZER为包被原,ZER为竞争半抗原,两者与一定量的抗玉米赤霉醇单克隆抗体反应,应用间接竞争ELISA法建立玉米赤霉醇单克隆抗体快速检测农产品中ZER含量的半定量检测,同时对该ELISA试剂盒进行了调试。[结果]试验建立检测ZER的ELISA方法,其最适包被浓度为1∶5 000,抗体最适工作浓度为1∶2 500,酶标二抗的最适工作浓度为1∶5 000。试剂盒检测限为0.5 ng/ml,添加回收率在70.0%~116.0%,变异系数小于20%,在2~8℃条件下可保存90 d。[结论]该试验建立的方法可应用于玉米、小麦、高粱等中的玉米赤霉醇的检测,应用前景广阔。     

伏马菌素B1胶体金免疫层析试纸条的研制

[目的]建立用于快速检测伏马菌素B1(FB1)的胶体金免疫层析试纸条。[方法]首先制备了FB1单克隆抗体和FB1-OVA偶联抗原,然后将FB1单克隆抗体与胶体金制成金标抗体包被在金标垫上,将FB1-OVA抗原和羊抗鼠Ig G包被在硝酸纤维素膜(NC膜)表面分别作为检测线和质控线。采用间接竞争法检测待检样品中的FB1与NC膜上的FB1-OVA抗原竞争结合金标抗体中的FB1单克隆抗体情况,并以检测线和质控线显示检测结果。[结果]本试验优化了金标抗体、检测抗原及羊抗鼠Ig G的包被量,检测FB1的灵敏度可达到2 ng·m L-1,最佳判定质量浓度为40 ng·m L-1。[结论]本试验制备的检测试纸条具有较高的特异性和稳定性,操作简单,检测时间仅需10 min,且与高效液相色谱法检测结果一致,可作为检测玉米中伏马菌素B1残留的有效手段。     

水产品中恩诺沙星残留胶体金免疫层析技术的研究

[目的]制备一种特异、快速、便捷的检测虾及鱼肉中恩诺沙星残留的胶体金免疫层析试纸条。[方法]用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金标记恩诺沙星多克隆抗体,喷于试纸的金标垫。将ENR-OVA(恩诺沙星和卵清白蛋白的偶联物)和纯化的羊抗兔IgG分别喷于试纸的T(检测线)处和C(质控线)处,通过挑选试纸条材料和调试工艺参数,并最终组装成试纸条。[结果]制备的试纸条检测体系方法的检出限为0.9 ng/ml。试纸条对虾及鱼肉中的恩诺沙星残留的检出限分别为5和10 ng/g。[结论]制备的恩诺沙星胶体金检测试纸适用于现场实际样品恩诺沙星残留水平检测,具有良好的应用前景。     

水产品中孔雀石绿·结晶紫及其代谢物残留快速检测试纸条的研制

[目的]研究开发用于现场检测水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留的快速检测试纸条。[方法]采用胶体金免疫层析技术,通过利用不同的样品垫及反应模式进行试验,研制出适合于现场检测水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留的快速检测试纸条。[结果]该试纸条对孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫的检测限均为2μg/L,检测所需时间约10 min。[结论]该试纸条操作简便、快速、检测灵敏度高,试验结果一目了然,可作为孔雀石绿、结晶紫及其代谢物在水产品中残留检测的有效筛查手段。     

五氯酚钠胶体金快速检测试纸条的研制

[目的]研制五氯酚钠胶体金快速检测试纸条。[方法]利用胶体金免疫层析技术,研制一种快速检测猪肉、鸡肉、鱼、虾、水质中五氯酚钠的试纸条。[结果]经测试,该试纸条对猪肉、鸡肉、鱼、虾的检测限为1μg/kg,对水质的检测限为2μg/kg,检测时间为15 min,假阳性率和假阴性率均为0。[结论]该方法准确、可靠,使用简便,适合大量样品的现场检测。     

胶体金免疫层析法快速诊断犬弓首蛔虫病

[目的]建立了一种能快速诊断犬弓首蛔虫病方法。[方法]以胶体金标SPA和犬弓首蛔虫（Toxocara canis）抗原蛋白制备免疫层析试纸条,并对其灵敏度和特异性进行评价。采用该试纸条和虫检法对200份犬血清样本进行检测,以评价该试纸条对现场材料的检测效果。[结果]组装的犬胶体金免疫层析试纸条的最低检测线为0.20μg/ml,灵敏度很好;与犬的其他寄生虫病的阳性血清进行反应,均成阴性;对200份犬血清样本的阳性检出率为10%,而虫检法的阳性检出率为2%。[结论]胶体金免疫层析法诊断犬弓首蛔虫病具有操作简便、灵敏度高、特异性强的优点,可用于犬弓首蛔虫病的快速检测。     

抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备

为建立快速、简单、灵敏、有效的玉米赤霉烯酮的检测方法,将玉米赤霉烯酮与羧甲氧基胺半盐酸盐反应,合成半抗原ZEN-oxime,通过活泼酯法将半抗原与载体蛋白偶联制备玉米赤霉烯酮人工抗原,以人工抗原ZENBSA免疫BALB/C小鼠,取该鼠脾细胞与SP 2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选和克隆,得到了1株能稳定分泌抗玉米赤霉烯酮抗体的单克隆细胞株3D10。3D10的抗体类型及亚类均为IgM,其轻链为Kappa链。制备的单克隆抗体腹水通过间接酶联免疫吸附测定,效价在1×10-6以上。该单克隆抗体对玉米赤霉烯酮的IC50为225 ng/ml,除与玉米赤霉烯酮结构类似物有一定的交叉反应外,与其他参试真菌毒素均无交叉反应。所制备的单克隆抗体可用于玉米赤霉烯酮毒素初筛和定性检测。     

基于单克隆抗体的胶体金试纸条检测水产品中甲霜灵的残留

为了建立检测水产品中抗水霉药物甲霜灵残留的快速初筛方法,采用基于单克隆抗体技术的胶体金标记检测水产品中甲霜灵残留。甲霜灵单克隆抗体为IgG1,Kappa型;重链50 ku,轻链20 ku,分子质量约为150 ku;亲和力常数为2.46×10⁹ L/mol;IC₅₀为59.57 ng/mL。利用甲霜灵单克隆抗体作为金垫,甲霜灵-牛血清白蛋白偶联物及羊抗鼠IgG作为检测线与质控线,制备了甲霜灵胶体金免疫层析试纸条。测定结果显示:胶体金试纸条在甲霜灵质量浓度为5 mg/mL时可检出,与恩诺沙星、磺胺甲恶唑、氟苯尼考、呋喃唑酮、吡喹酮、强力霉素、孔雀石绿和亚甲基蓝等8种药物均无交叉反应。利用试纸条对草鱼(Ctenopharyngodon idella)、花蛤(Ruditapes philippinarum)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)等水产品样品进行测试,在草鱼、凡纳滨对虾样品最低检测限可达2 mg/kg,花蛤样品最低检测限可达1 mg/kg。利用高效液相色谱法验证试纸条检测甲霜灵残留,主要数据验证结果一致。基于单克隆抗体的胶体金免疫条快速、灵敏、特异性强,适合作为水产品组织中甲霜灵残留检测的初筛方法。     

食品中四环素类抗生素金标快速检测试剂条的研究

[目的]建立一种检测四环素类抗生素的新方法。[方法]四环素通过两步衍生化后,与氨基化的BSA上的表位氨基反应,合成TC-BSA偶联物。以四环素多克隆抗体-胶体金复合物作为分析探针,四环素完全抗原作为竞争抗原,构建分析体系。[结果]紫外吸收光谱、凝胶色谱图和红外光谱均表明人工完全抗原偶联成功。选择柠檬酸三钠加入量1.5 ml生成的胶体金作为该试验继续合成胶体金检测探针的金溶胶。当抗体稀释倍数为1∶100、pH值为8.70时,金标灵敏度好。金标试纸条检测样品中四环素的检测限量是200μg/L,检测时间不超过15.0 min。与ELISA法检测样品作对比,采用新法的准确率达100%。探针溶液中加入10%(V/V)保护剂后,试剂条稳定性明显提高。[结论]该研究为四环素的快速检测提供了依据。     

鳗弧菌单克隆抗体-胶体金检测方法的建立

以灭活鳗弧菌(SMW5)全菌为抗原,应用杂交瘤技术,制备了鳗弧菌单克隆抗体3株,分别命名为1H9、1C12、6F8,细胞亚类分别为IgG2a、IgM、IgG2b,其中1H9腹水效价为1∶6.4×105。制备鳗弧菌(SMW5)兔多克隆抗体,效价为1∶3.2×105。应用纳米胶体金颗粒标记单克隆抗体1H9并制备金标垫,抗鳗弧菌(SMW5)兔多克隆抗体与羊抗鼠抗体作为捕获抗体包被硝酸纤维素膜,分别作为检测线T和质控线C,建立鳗弧菌的胶体金免疫层析快速检测方法。经过对试纸条的特异性和灵敏度测定,结果表明:试纸条与嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、副溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌,7种水产常见病原菌没有交叉反应,与鳗弧菌特异性反应,检测灵敏度为6.3×104cfu·mL~(-1),检测所需时间低于10min。所制备的鳗弧菌胶体金免疫层析检测试纸条具有快速、简便、特异性高和适应基层生产推广应用等优点。     

抗阿莫西林多克隆抗体的制备

[目的]为研究阿莫西林残留的免疫学检测方法奠定基础。[方法]采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(NHS)法将阿莫西林分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联,制备免疫抗原AMX-BSA和检测抗原AMX-OVA,用AMX-BSA免疫成年兔以获得高效价的多克隆抗体。[结果]免疫抗原AMX-BSA紫外光谱具有药物和蛋白的叠加特征,其最大吸收峰在276 nm处,说明载体蛋白BSA与AMX成功偶联,可用于动物免疫。检测抗原AMX-OVA最大吸收峰在275 nm处,说明载体蛋白OVA与AMX成功偶联,可用作检测抗原进行包被。间接ELISA检测结果表明,2只兔抗血清效价较高,均达1∶32 000以上,说明有特异性抗体产生。[结论]该研究成功制备了抗阿莫西林多克隆抗体,也进一步证明药物偶联成功。     

同时快速检测马铃薯X病毒、Y病毒和S病毒试纸条的研制

为实现在马铃薯种薯生产田现场同时快速检测马铃薯X病毒(PVX)、Y病毒(PVY)和S病毒(PVS),采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,利用抗体与胶体金相结合的特性制备金原子与PVX、PVY和PVS抗体结合物(简称金标抗体),通过三维划膜喷金仪将金标抗体喷射于玻璃纤维上作为金标垫,将PVX抗体、PVY抗体和PVS抗体分...     

抗双酚A多克隆抗体的制备

[目的]制备可以识别双酚A（BPA）的多克隆抗体。[方法]通过双酚酸（DPA）与载体蛋白牛血清白蛋白（BSA）以及卵清白蛋白（OVA）偶联制备免疫抗原DPA-BSA和包被抗原DPA-OVA,以DPA-BSA免疫新西兰大白兔获得抗血清,并采用间接竞争酶联免疫吸附（ELISA）检测方法对抗体进行鉴定。[结果]经紫外光谱分析,DPA-BSA和DPA-OVA制备成功。抗血清效价最高达到1∶256 000,50%抑制率（IC50）达17.2 ng/ml。[结论]该研究为建立双酚A的快速筛选方法奠定了基础。     

牛奶掺碱快速检测试纸的研制

[目的]牛奶掺入碱性物质是常见的掺假现象,解决原料奶在收购过程中快速检测出掺碱牛奶.[方法]试验将配制的溴麝香草酚蓝(BTB, Bromo Thymol Blue)试剂加载到定性滤纸上,制作成掺碱检测试纸,对牛奶中掺入不同浓度碱性物质(Na2CO3、NaHCO3、NaOH)及氨水的检测,同时与常规采用的检测牛奶掺碱性物质试管法进行比较.[结果]研制的0.04;溴麝香草酚蓝试纸法对碱性物质(Na2CO3、NaHCO3、NaOH)的最低检出量可达0.03 g/100 mL,氨水的最低检出量可达0.04;.与试管法对碱性物质的最低检出量是一致的.[结论]试验研制的牛奶掺碱快速检测试纸,用于牛奶掺碱性物质的检测,操作简单,使用方便,检测迅速,灵敏度较高,制作成本低,不但适用于奶站的检验,也适合在家庭中测试.     

恩诺沙星人工抗原及多克隆抗体的制备

[目的]制备恩诺沙星人工抗原及多克隆抗体。[方法]采用活性酯法合成恩诺沙星的人工抗原,并通过紫外光谱扫描和SDS-PAGE电泳对其进行鉴定。利用免疫原(ENR-BSA)免疫新西兰大白兔,制备抗恩诺沙星的高亲和力和高特异性的多克隆抗体。[结果]恩诺沙星成功地偶联到载体蛋白上。通过动物免疫,获得了高效价的抗血清,最高效价达到1∶100 000,说明人工抗原成功地诱导机体产生免疫应答。[结论]恩诺沙星的人工抗原合成路线简单易行,可为进一步建立恩诺沙星的免疫检测方法奠定了基础。     

生豆浆基因组DNA不同提取方法的比较研究

[目的]探讨适宜生豆浆的基因组DNA提取方法。[方法]以市售豆浆为材料,分别采用热解法、异丙醇沉淀法、CTAB法、SDS法、高盐低pH和异硫氰酸胍法以及它们的改良方法提取基因组DNA,并比较了以上方法的提取效果。[结果]除异丙醇沉淀法外,其他方法提取的基因组DNA均可满足PCR检测要求。同时,综合考虑基因组DNA的纯度和浓度,生豆浆基因组DNA提取方法的优劣依次为：改进高盐低pH法、高盐低pH法、改进CTAB法、改进异丙醇沉淀法、异硫氰酸胍法和改进热解法。[结论]这几种生豆粉基因组DNA提取方法均具有操作简单、耗时短、利于快速检测的优点。     

生物膜干涉技术快速定性检测牛乳中喹诺酮类药物残留

[目的]基于生物膜干涉技术建立一种快速检测牛乳中喹诺酮类抗生素残留的方法。[方法]通过疏水作用力在APS光线生物传感器探头末端固定环丙沙星-BSA偶联物,结合纳米金-喹诺酮类抗生素单克隆抗体偶联物,建立了检测牛乳中喹诺酮类抗生素的方法。[结果]所建立的检测方法具有良好的灵敏度,比免疫层析法至少高出1倍。该检测方法还具有良好的特异性．与浓度1000ng／ml的黄曲霉毒素M1、青霉素G、头孢噻呋、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、泰乐菌素、氯霉素、三聚氰胺无交叉反应。该方法还具有良好的重复性,不同基质牛乳检测对检测结果无显著影响。分别采用免疫层析试纸条和建立的金标记BLI检测方法检测43份牛乳（原奶）样品中的喹诺酮类抗生素残留,二者检测结果一致。[结论]生物膜干涉技术检测牛乳中的喹诺酮类抗生素为一种简便、快捷的检测方法,可以用于牛乳中喹诺酮类抗生素残留的快速定性检测。