鸡新城疫病毒、鸡细小病毒和禽流感病毒 三重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立能同时检测鸡新城疫病毒(NDV)、鸡细小病毒(ChPV)和禽流感病毒(AIV)的三重PCR检测方法,为临床上快速诊断及有效防控NDV、ChPV和AIV的单一或混合感染提供技术支持。【方法】参考NCBI中已公布NDV的F基因(登录号DQ195265.1)、ChPV的NS1基因(登录号GU214704.1)和AIV的M基因保守区(登录号DQ485211.1),设计合成针对NDV、ChPV和AIV的特异性引物,应用这3对引物建立三重PCR检测方法,对反应体系及扩增程序进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测等评估其实用性。【结果】优化后的三重PCR反应体系为ChPV和AIV的上、下游引物各0.5μL,NDV的上、下游引物各1.0μL,NDV、ChPV和AIV的核酸模板各1.0μL,Premix Taq~(TM)12.5μL,无RNase水补足至25.0μL。最佳扩增程序:95.0℃预变性5 min;94.0℃1 min,58.5℃1 min,72.0℃1 min,进行35个循环;72.0℃延伸10 min,12.0℃结束反应。建立的三重PCR能同时扩增出NDV(453 bp)、ChPV(687 bp)和AIV(239 bp)的特异性条带,对应的最低检测下限分别为2.5 pg NDV、6.4 pg ChPV和2.0 pg AIV,但扩增传染性支气管炎病毒(IBV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、马立克病毒(MDV)、传染性喉气管炎病毒(AILTV)和禽肺炎病毒(APV)等病原体均呈阴性。应用建立的三重PCR对50份鸡喉头或泄殖腔棉拭子样品进行检测,结果显示有1份NDV阳性、9份ChPV阳性和2份AIV阳性样品,其中包含2份ChPV和AIV均呈阳性的样品,1份ChPV和NDV均呈阳性的样品,与常规PCR的检测结果一致。【结论】建立的三重PCR能同时对NDV、ChPV和AIV 3种病原进行特异性诊断,在混合感染病例鉴别诊断方面具有广阔的应用前景。     

鸡4种主要RNA病毒病多重感染复合PCR检测方法的建立

依据Gen Bank中注册的禽流感病毒(AIV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)基因组核苷酸序列,通过序列比对获得AIV、IBV、NDV、IBDV的相对保守序列。根据每种病毒的保守序列利用生物学软件分别设计3对特异性引物,4种病毒共设计12对引物,并对12对引物进行模拟筛选,获得匹配最佳的4对引物。对获得的最佳匹配引物进行单项PCR验证,优化复合PCR反应条件,确定最佳的退火温度、引物浓度和Taq DNA聚合酶使用量;经特异性、敏感性及简化PCR试验,最终建立了简易复合PCR检测方法。结果表明,建立的检测方法可同时扩增出4条大小与设计相符的特异性片段,即IBV(146 bp)、NDV(215 bp)、IBDV(345 bp)、AIV(435 bp);建立的复合PCR方法具有较强的敏感性和特异性,能检测出100 pg AIV、IBV、IBDV的cDNA和100 fgNDV的cDNA;将三温热循环改进为二温热循环,即将退火和延伸过程合为一步(62℃),大大缩短了反应时间。     

鸡ILV、IBV、NDV和AIV多重RT-PCR检测方法的初步建立

初步建立了鸡传染性喉气管炎(IL)、鸡传染性支气管炎(IB)、新城疫(ND)和禽流感(AI)的多重RT- PCR鉴别诊断方法,并对其特异性和敏感性进行了检测。结果表明,所设计的4对引物可对同一样品中的ILV、IBV、NDV和AIV进行特异性扩增,所扩增的目的片断的长度分别为620 bp(ILV)、445 bp(IBV)、344 bp(NDV)和240 bp (AIV);建立的RT-PCR检测方法能够检测出10 pg AIV、1 ng NDV和10 ng IBV的RNA及100 pg ILV的DNA,说明该检测方法特异性强,敏感性较高。本研究所建立的多重RT-PCR方法可用于上述鸡4种病毒性呼吸道疾病的快速鉴别诊断,在临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。     

3种猪繁殖障碍性病毒Real-time PCR快速检测方法的建立

【目的】建立可同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的多重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank数据库中PRV、PPV和PCV2的核苷酸序列,设计3对特异性引物和探针,以10倍系列稀释的阳性质粒为模板,优化反应条件,建立检测PRV、PPV和PCV2的多重Real-time PCR方法,并对其敏感性、重复性和特异性进行检验;分别采用单项和多重Real-time PCR方法,对临床收集的42份疑似病料进行检测,比较2种方法的符合率。【结果】特异性和灵敏度试验表明,建立的多重Real-time PCR检测方法具有高度特异性,与其他病原无明显交叉反应;检测灵敏度高,可检出1.0×101拷贝/μL的阳性质粒或1TCID50/mL的病毒样品。用多重Real-time PCR对42份临床疑似病料进行检测,其检测结果与单重Real-time PCR结果完全一致,表明多重Real-time PCR方法是可行的。【结论】建立了可同时检测PRV、PPV和PCV2的多重Real-time PCR方法,该法具有快速、灵敏、特异和重复性好等优点。     

禽多杀性巴氏杆菌、副鸡嗜血杆菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

为了建立鉴别禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)和大肠杆菌(Escherichia coli)的多重PCR检测方法,参照GenBank中登录的3种细菌基因组序列,合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立快速检测3种细菌的多重PCR方法。特异性试验结果表明,可分别扩增出3种细菌对应的目的片段,对Ⅰ群禽腺病毒4型(FAV-4)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonellaspp)、鸡胚成纤维细胞(DF-1)的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验结果表明,最低检测量分别为24.3pg/μL禽多杀性巴氏杆菌、21.4pg/μL副鸡嗜血杆菌和28.6pg/μL鸡大肠杆菌的基因组DNA;应用该方法对83份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单重PCR检测一致,说明所建立的方法可用于临床上3种细菌的鉴别诊断。     

鸭圆环病毒和鹅圆环病毒三引物鉴别检测方法的建立

【目的】建立一种可同时检测并鉴别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的PCR方法。【方法】根据已发布的鸭圆环病毒和鹅圆环病毒基因组分子特征设计3条引物，应用3条引物建立了一种在一个反应管中可检测并鉴别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的三引物PCR方法。【结果】该方法可特异性扩增鸭圆环病毒和鹅圆环病毒，并根据扩增片段大小鉴别病毒种类，检测最低限分别为110、80 pg·μL^-1。应用该方法对临床疑似病例样品进行检测，其结果与用2种病毒对应的单病毒PCR检测方法一致。【结论】建立的三引物PCR方法特异性强，敏感性高，丰富了水禽圆环病毒病的临床病例的诊断及流行病学监测的技术手段。     

RT—PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立

根据Genbank中鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(NP)基因序列，设计了1对引物，通过鸡胚繁殖IBV，纯化鸡胚尿囊液中的IBV，提取病毒RNA，建立了检测传染性支气管炎病毒的RT—PCR方法。对IBV各毒株(M41，H52，H120，Aust-T以及野毒株等)检测，结果均为阳性，而对鸡的其他病毒性疾病病毒(IBDV，AIV，NDV)进行检测，结果均为阴性。初步结果表明所建立的RT—PCR．技术可用于鸡传染性支气管炎病毒各血清型毒株的检测。     

禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的禽流感病毒(AIV)M1基因与新城疫病毒(NDV)M基因核苷酸序列,设计用于扩增AIV与NDV的RT-PCR引物,建立了AIV与NDV二重RT-PCR检测方法。敏感性和特异性试验结果表明,该方法对AIV与NDV的最低核酸检出量分别为38和27 pg,可同时扩增出428 bp(AIV)与297 bp(NDV)的特异性片段,而对传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒与鸭肝炎病毒的检测结果均为阴性。该方法可用于2种病毒病的临床快速检测与流行病学调查。     

一步法多重RT-PCR禽流感病毒分型诊断法的建立与应用

根据禽流感病毒(AIV)的M基因序列设计合成了1对AIVM基因的通用诊断引物AMDI／AMD2,针对H5N1、H9N2两种亚型的HA基因分型设计合成了2对分型诊断引物H15D1／H5D2,H9D1／H9D2。采用一步法多重RT-PcR技术建立了一种禽流感病毒快速分型诊断方法,并对其特异性和灵敏度进行验证。结果表明,该诊断方法速度快,一般只需要28～30 h即可鉴定出结果,比病毒分离鉴定(5～7 d)至少缩短4～6 d;特异性强,试验组53株AIV全部扩增出与预期同样长度的目的条带,与病毒分离及血清学鉴定方法的检测结果完全一致。对照组中新城疫病毒(NDV)、减蛋综合征病毒(EDS76V)、传染性支气管炎病毒(IBV)均未扩增出特异性基因条带,;灵敏度高,试验组将AIV接种SPF鸡胚,培养后的鸡胚尿囊液(AAF)进行10-2稀释后,仍可以检测到其中的AIV。     

一步法复合RT-PCR鉴别ND强毒与AI病毒的研究

根据新城疫病毒（NDV）融合蛋白和禽流感病毒（AIV）核蛋白的核酸序列设计2对引物,对NDV和AIV的特异扩增片段分别为156bp和219bp,建立了同时检测强毒力NDV和AIV核酸的一步法复合RT—PCR。试验中未能检出弱毒力NDV,IBV,IBDV,REV,REOV及SPF鸡肌肉组织的RNA,从不同年代分离的16个NDV强毒株全为阳性而NDV弱毒株全为阴性。经验证,复合引物与单一引物的扩增效率一致,能够检出NDV和H;亚型AIV的最低病毒量分别为10^3.7EID。和10^3.9EID50。试验结果表明,此次建立的一步法复合RT—PCR特异、敏感,适用于强毒力NDV和AIV．感染的快速鉴别。     

新城疫野毒株的分离鉴定

2000年春从河南省不同地区的鸡群中分离到2株新城疫病毒，该二毒株经鸡胚传代培养，血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)，鸡胚平均死亡时间(MDT)试验，1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)测定，6周龄非免疫鸡静脉接种指数(IVPI)测定及空斑试验等生物学特性试验，结果表明该二毒株为新城疫强毒株。     

太子参病毒病的综合防治技术

太子参病毒病是太子参最主要的病害。在福安市太子参种植区发生普遍，发病率高达80％～90％，严重影响太子参的品质和产量。该文对太子参病毒病的症状、发病规律及原因进行阐述，并提出综合防治技术。     

新城疫病毒的基因组与结构蛋白特征

新城疫病毒属于副粘病毒科、Rubulavirus病毒属、Ⅰ型副粘病毒的惟一成员，为单股负链RNA病毒，整个基因组全长15586个核苷酸，编码核衣壳蛋白、磷蛋白、基质蛋白、融合蛋白、血凝素神经氨酸酶和高分子量的RNA聚合酶6种结构蛋白。为进一步做好新城疫的防治工作，对新城疫病毒的分子生物学特性，特别是对其基因组特征和编码蛋白的结构及功能等方面进行了较为详尽的综述，从而为新城疫病毒的深入研究奠定了一定的基础。     

芹菜病毒病症状分析与毒原种类鉴定

通过对芹菜病毒病毒原的侵染寄主、症状特点及其发展、抗性指标、传播方式、粒体形态与大小等的观察和测定,结果表明,危害芹菜的病毒为芹菜花叶病毒(CeMV)和黄瓜花叶病毒(CMV),这两种病毒的典型鉴别寄主为胡萝卜(Daucuscarotavar.sativa)和千日红(Gomphrenaglobosa);对所得CeMV的测定发现,其致死温度为50～60℃,稀释限点为10-3～10-4,体外保毒期3～4d;电镜观察显示,其形态为线状粒体,属马铃薯y病毒组,长650～850nm,宽15～18nm;其传播方式为汁液摩擦传毒和蚜虫引起的非持久性传毒。     

甘薯资源抗(耐)病毒的鉴定

2001~2002年采用嫁接法接种对“国家种质广州甘薯圃”保存的162份甘薯资源进行病毒抗性的鉴定,结果表明所有资源在指示植物Ipomoea setosa上显示出带毒症状,但是资源的病毒病潜育期之间存在着差异,甘薯地上部分不显症并不意味不带病毒。     

蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒三重RT-qPCR检测方法的建立及应用

目的 建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)及帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)快速筛查和诊断的三重RT-qPCR检测技术。方法 选择BTV的NS3、EHDV的NS1以及PALV的VP7基因作为靶基因,设计3组特异性引物和探针,建立3种病毒的三重RT-qPCR检测方法。对检测方法的灵敏度、特异性和重复性进行验证,同时使用我国分离的BTV、EHDV与PALV不同血清型毒株和对应的阳性血液样本,与24个BTV血清型及6个EHDV血清型参考毒株对该三重法的检测效果进行验证。结果 三重RT-qPCR的扩增效率均可达90%以上,对3种病毒核酸拷贝数的检测下限均为10 μL^-1级别,与单重法的检测灵敏度相当;与阿卡斑病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒和牛流行热病毒之间无交叉反应;Ct值批内、批间变异系数均在2%以内;可检测出24种BTV血清型、6种EHDV血清型与3种PALV血清型,具有群特异性;可有效检测血液中的病毒核酸,检测结果与单重法一致。结论 本研究建立的BTV、EHDV与PALV三重RT-qPCR具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于临床样本中对3种病毒的同时诊断与筛查。     

鸡新城疫病毒强毒株的分离与鉴定

从河北、天津、北京等省市发病鸡群中分离到8株有血凝性的分离物,其血凝作用可被新城疫阳性血清所抑制,而不能被AIV(H9亚型)、EDS76阳性血清所抑制,表明8株分离物均为新城疫病毒。利用鸡胚终点稀释法对这8株NDV进行了克隆。对8株NDV的毒力指数(MDT、ICPI、IVPI)测定结果显示:MDT在42 9～49 5h之间,ICPI在1 95～2 00之间,IVPI在2 68～2 89之间。表明8株NDV均为新城疫病毒强毒株,其毒力与标准强毒株F48E8相近。各分离毒株经2%磷钨酸负染后,电镜下观察,可见丝状、圆形或不规则形态的病毒粒子,表面有纤突样结构。各毒株的大小不尽相同,粒子直径或长轴在100～500nm之间。     

抗新城疫病毒中和性单克隆抗体研制和特性分析

应用杂交瘤技术,以纯化的NDV-lasota为免疫原结合间接ELISA筛选到了24株抗NDV单抗,其中3 株(McAb-14、McAb-18和McAb-21)具有中和活性,并与其血凝抑制效价具有很大的相关性。McAb-18和 McAb-21的免疫球蛋白亚类都属于IgG2a;McAb-14为IgG2b。特异性鉴定结果表明:3株抗NDV的单抗均不与马立克病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、减蛋综合征病毒、传染性喉气管炎病毒等发生交叉反应。用这3株中和单抗的任2种混合液对鸡进行了被动免疫治疗和免疫预防试验,结果表明:McAb-14 McAb -18组合的免疫预防和治疗效果最好。     

传染性法氏囊病病毒分子生物学研究进展

传染性法氏囊病毒是鸡的一种重要的病原。文章概述了在传染性法氏囊病毒基因组结构和功能、分子生物学诊断方法和病毒变异的分子基础等方面的研究进展     

兔出血症病毒感染性克隆的优化

为避免细胞外转录步骤,使RHDV感染性克隆的转录和病毒拯救过程一步化,试验通过PCR反应在RHDV cDNA序列的5′端添加T7启动子核心序列,3′端添加具有自身切割功能的核酶核心序列.然后,将RHDV基因组的不同cDNA片段装配到pTVT转录载体中,构建了含有RHDV全长cDNA序列的重组质粒pTVT-RHDV.在转染能稳定表达T7RNA聚合酶的BHK细胞后,将收获的细胞培养物感染MA104细胞.分别用逆转录PCR、间接免疫荧光检测以及一步生长曲线等方法对拯救病毒进行了鉴定.结果表明,试验成功拯救出了RHDV,优化了RHDV感染性克隆的构建过程.