紫花苜蓿锌指蛋白基因RNAi表达载体的构建及在苜蓿的转化

根据紫花苜蓿锌指蛋白MsZFN基因(GenBank登录号为EU624138)序列,设计两对含有酶切位点的特异性引物,以紫花苜蓿cDNA为模板,分别合成用于构建干扰载体的正反义片段,将正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置,构建成含有发夹结构的RNAi载体pART-F-R。利用农杆菌介导方法,将pART-F-R转化到紫花苜蓿中,经过PCR检测,获得了3株转基因植株。经过RT-PCR检测,证明转基因植株中MsZFN基因表达量明显低于未转基因的植株。结果表明,已构建成功具有发夹结构的RNAi载体pART-F-R,它可有效的抑制紫花苜蓿MsZFN基因。     

紫花苜蓿LEA蛋白基因ihpRNA表达载体构建及烟草转化

根据紫花苜蓿LEA蛋白MsLEA3-1基因(GenBank登录号： EU665182)序列,设计两对含有酶切位点的特异性引物LEAf1/ LEAf2和LEAr1/ LEAr2,以构建好的PMD-LEA质粒为模板,分别合成用于构建干扰载体的正反义片段pMD-F和pMD-R,将正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置,构建成含有发夹结构的RNAi载体pART-F-R,经过Not I酶切鉴定,证明载体构建成功。通过农杆菌介导的方法,以干扰表达载体pART-F-R转化烟草,经过PCR检测,得到16株阳性转基因植株,为MsLEA3-1基因的功能研究奠定基础。     

ZmPti1基因正义和RNAi表达载体的构建及其转化玉米的研究

构建了ZmPti1基因的正义表达载体和RNAi载体,以bar基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将构建的两个表达载体分别转化到玉米自交系178.收获的种子播种于营养钵中,出苗后,经0.1%的草丁膦筛选得到40株草丁膦抗性植株,进一步用PCR鉴定与PCR-Southern检测得到33株转基因植株,其中15株是转化正义表达载体的转基因植株,18株是转化RNAi表达载体的转基因植株.并对转化方法和ZmPti1基因的功能进行了讨论.     

菊花DgLsL基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

培育少侧枝的标准切花菊品种具有重要的实际意义。本研究利用RNAi的方法抑制菊花侧枝发育相关基因DgLsL基因的表达,以期得到侧枝生长受抑制的转基因植株。从切花菊‘神马’基因组DNA中克隆侧枝发育相关基因DgLsL基因,经过测序分析,将一个413bp长的保守片段连接到植物表达载体pBI121和pFGC5941,构建植物RNAi载体pBI121-R2,并运用农杆菌介导法将其导入切花菊‘神马’。结果:PCR得到的DgLsL基因片段测序后与GenBank上的DgLsL基因比对,DNA序列一致性为99.4%;构建的RNAi表达载体经过PCR和酶切证实外源基因的正确插入;转化后得到了18株抗性植株,PCR结果显示,12株抗性植株为阳性。本试验通过将DgLsL基因干扰片段导入切花菊,获得了转基因植株,以此为基础可进一步选育少侧枝的切花菊品种。     

DOF转录因子AtDof1.7 RNA干扰载体的构建及拟南芥的遗传转化

DOF (DNA binding with one finger)转录因子是植物特有的转录因子家族,含有一个独特的富含Cys残基的单锌指DNA结合区域,在植物生长发育中参与多种生物学过程。本研究根据拟南芥AtDof1.7基因(GenBank登录号为AT1G51700)序列设计含有不同酶切位点的特异性扩增引物,以拟南芥总DNA为模板,扩增AtDof1.7基因片段,将AtDof1.7基因正向反向分别插入表达载体的相应位置,构建成AtDof1.7基因的RNA干扰载体pADOF1。利用改良的floral-dip方法将干扰载体pADOF1成功转入野生型拟南芥,经草甘膦抗性筛选和PCR检测获得5株阳性转基因植株。利用RT-PCR技术和气相色谱法分别分析了AtDof1.7基因的表达和种子脂肪酸组成,结果表明5株转基因植株中AtDof1.7基因的表达量不同程度低于野生型植株,种子油酸含量明显上升,亚麻酸含量明显下降,说明AtDof1.7转录因子与拟南芥种子脂肪酸代谢途径有一定的关系,为进一步研究其在脂肪酸代谢过程中的调控作用以及在油菜中研究该类转录因子的功能奠定了基础。     

GFLVCP 基因 RNAi 载体构建及其在转基因烟草中的干涉效果

为探讨RNAi策略在抗GFLV基因工程中的效果,通过RT-PCR克隆获得了310 bp的GFLV外壳蛋白基因保守片段,采用Gateway技术将该基因片段连入目标载体pHELLSGATE12构建了RNAi植物表达载体,并通过农杆菌介导法转入烟草中,RT-PCR检测表明目的基因片段已整合到烟草基因组中并在RNA 水平上得到表达,病毒接种结果显示阳性植株的发病率明显低于对照,说明在转基因植株中dsRNA表达可干涉GFLV侵染过程。     

蚜虫基因RNAi载体的构建及其在转基因烟草中dsRNA的表达分析

RNAi机制可以通过dsRNA诱导同源mRNA的降解,从而导致该基因转录后沉默。RNA干扰作用从发现以来就具有了利用转录后基因沉默（PTGS）来进行抗虫的一种潜在可能性。针对dsRNA的这种作用,研究中提取蚜虫RNA,克隆出蚜虫Cathepsin B基因的干扰片段并构建出RNAi载体,转入本氏烟草中,在转基因烟草体内表达dsRNA。成功构建RNAi载体后,通过农杆菌转化和叶盘法将RNAi载体导入烟草中并采用组织培养方法培养出转基因烟草,通过PCR鉴定显示15株生根的转基因烟草中14株显示阳性。提取转基因烟草的RNA进行RT-PCR和Northern表达分析显示转基因烟草植株中dsRNA表达的存在。实验结果说明了在转基因植物体内表达RNAi载体可以产生dsRNA,从而在蚜虫进食植物时达到利用dsRNA抗蚜虫的作用。     

拟南芥rd29A基因启动子克隆及其在马铃薯抗胁迫转基因中的应用

从拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组中用PCR技术分离了rd29A基因上游824 bp的调控序列,序列分析表明该片段与已报道的rd29A启动子有99.39%的同源性,包括缺水诱导表达元件DRE、ABA作用元件ABRE等顺式作用元件。将此片段与GUS基因连接构建了植物表达载体pBIrd,用农杆菌介导法获得了转基因马铃薯植株。对转基因植株进行G     

植物RNA干涉载体的构建及其在水稻基因表达沉默中的应用

为了方便利用RNA干涉（RNA interference，RNAi）研究植物基因的功能，本研究构建了2个用于RNAi的植物转化载体pRNAi-35S和pRNAi-Ubi。这两个载体以pCAMBIA双元载体为骨架，含有2个多克隆位点区进行目的基因片段的正向和反向克隆，并分别由CAMV35S启动子和玉米泛素基因启动子控制发夹结构RNA的产生。为了验证该载体的有效性，用PCR扩增了1个水稻转录因子（Arabidopsis AP2／EREBP同源基因）基因片段组装入pRNAi—Ubi，转化水稻获得转化体。在所检测的7株转化株中，5株的内源目标基因的mRNA被降低至RNAblot检测不到的水平。这些结果说明本研究构建的RNAi载体对基因表达沉默是有效的。     

紫苏FAD3基因RNA干扰载体的构建及遗传转化

本研究利用RNA干扰的方法抑制紫苏ω-3脂肪酸脱氢酶基因FAD3的表达,以期得到低ALA含量的转基因植株。根据紫苏FAD3基因(Gen Bank登录号为KC990786.1)序列设计含有不同酶切位点的特异性扩增引物,通过扩增获得长度为258 bp的RNA干扰片段,构建以Ca MV35S启动子驱动表达的紫苏FAD3基因RNA干扰表达载体p FGC5941M-FAD3I,将该载体转入根癌农杆菌GV2301后,采用农杆菌介导法进行紫苏的遗传转化,经除草剂抗性筛选和PCR检测获得1株阳性转基因植株。利用荧光定量PCR技术对野生型和转基因阳性苗的FAD3基因进行了表达分析,结果显示,阳性植株中FAD3基因的表达受到显著抑制,FAD3基因表达量降低了80%,说明此研究构建的FAD3基因RNA干扰载体对该基因表达沉默是有效的,为FAD3基因在不饱和脂肪酸代谢过程中的功能研究提供了理论依据。     

草莓乙烯受体FaEtr2基因植物表达载体构建

为通过转基因技术改善草莓的贮运性能,以全明星草莓为试材,克隆了与草莓成熟有关的FaEtr2基因的2个片段,并构建了该基因的反义和正义植物表达载体。根据已克隆的草莓乙烯受体FaEtr2基因序列及表达载体pBI221上的酶切位点设计2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个全明星草莓FaEtr2基因片段。两片段经双酶切消化后分别以正、反两个方向插入到植物表达载体pBI221的35 S启动子和NOS终止子之间,分别构建成All Star-FaEtr2基因的正、反义植物表达载体。     

烟草(Nicotiana tabacum)生长素响应基因NtIAA27的克隆及功能分析

为了研究内源生长素信号路径对烟草烟碱合成的调控,本研究根据烟草基因组数据和PCR扩增获得烟草生长素响应蛋白NtIAA27基因RNAi干扰片段180 bp,将该基因180 bp的片段克隆至RNAi载体pHellsgate12中,并通过叶盘法将该基因转入烟草K326中。经过实时定量PCR检测获得两株敲除效率较高的转基因植株,对这两株转基因株系及非转基因材料进行烟碱含量测定,结果表明与非转基因植株相比,RNAi转基因植株的烟碱含量升高,表明内源生长素信号路径可以负调控烟草烟碱含量,本研究将为培育不同烟碱含量的烟草品种提供有价值的信息。     

棉花accD基因植物表达载体的构建与遗传转化的研究

摘要：乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化脂肪酸合成的第一步,是脂肪酸合成的限速酶。本研究采用PCR方法分别从陆地棉和拟南芥基因组中扩增出ACCase羧基转移酶β-CT亚基编码基因accD,ACCase羧基转移酶α-CT亚基编码基因CAC3的定位于叶绿体的转运肽序列。将CAC3基因转运肽序列与accD基因进行体外重组,构建融合植物表达载体pBI-CAC3tp-accD。重组质粒通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101。渗透法转化拟南芥,收种子,在含卡那霉素的MS培养基中发芽筛选。用叶盘法转化烟草,经不定芽诱导、生根培养,获转基因烟草植株。T1代转基因拟南芥和转基因烟草植株经卡那霉素检测、PCR、RT-PCR检测后,初步表明目的基因已在植株中转化成功,并可以正常转录。     

苹果抗ASPV病毒RNAi载体构建及转化砧木M26的研究

为获得抗病毒的转基因植物新材料,采用同源重组法构建了抗苹果茎痘病毒的植物表达载体,并对苹果砧木材料M26进行了遗传转化,成功获得了转基因阳性植株。首先以感病的皇家嘎拉叶片为材料,反转录合成c DNA第一链,采用PCR方法克隆获得了489 bp的ASPV外壳蛋白基因的保守片段,通过TOPO克隆技术将该基因片段连接进入载体p ENTR/SD/D,构建了入门克隆载体p EN-ASPV,再通过LR反应置换该片段连接进入目标载体p Hellsgate12,构建了RNAi植物表达载体Phe-ASPV,并采用冻融法转入根癌农杆菌菌株EHA105中,获得了可用于植物遗传转化的工程菌EH-ASPV。采用农杆菌介导的方法转化苹果砧木M26叶盘,经抗生素筛选和脱菌培养获得了Kan抗性芽,进一步进行生根培养后获得了完整的Kan抗性植株,对生根植株提取总RNA后RT-PCR检测结果显示,RNAi表达载体上携带的外源基因片段(489 bp)已成功转入苹果砧木材料M26中,并在转基因植株内RNA水平上得到表达。获得的转基因新材料,为进一步通过病毒接种进行抗病性评价及抗病毒分子育种奠定了基础。     

新疆小拟南芥NPR1基因对植物系统获得性抗性的影响

旨在研究小拟南芥NPR1基因的第三内含子对基因表达的影响。克隆出带有第三内含子的小拟南芥NPR1基因,构建诱导型植物表达载体并对拟南芥进行农杆菌遗传转化,经5 mmol/L外源水杨酸12 h诱导,利用Real-time PCR技术检测拟南芥病程相关蛋白的表达量。结果显示野生型拟南芥的NPR1、PR-1、PR-2、PR-5表达量高于转基因拟南芥;相对于野生型拟南芥,转基因拟南芥中SOD、POD酶活显著降低,而CAT酶活增加未达到显著水平。结果表明转入含有第三内含子的Ap.NPR1基因,转基因植株系统获得性抗性途径受到抑制,植株抗病性降低,说明第三内含子使得系统获得性抗性途径的基因表达受到抑制。     

转基因马铃薯外源基因插入位点分析及检测方法的建立

09-4为本实验室构建的抗马铃薯PRLV的RNAi基因和特异切割马铃薯PSTVd的核酶基因无标记双价表达载体p CAMBIA3301-DR-IS导入马铃薯中获得的转基因无性系。本研究通过染色体步移获取转基因无性系09-4的插入位点左边界旁侧序列,对获得的左边界序列进行分析,扩增获得片段大小为382 bp,包括转化载体序列119 bp及转基因马铃薯的旁侧序列263 bp;依据转化马铃薯的RNAi基因和左旁侧序列分别设计引物,扩增出大小为300 bp的片段,建立了09-4转基因无性系特异性标识和特异PCR检测方法,为转基因马铃薯的检测和身份识别提供技术基础。     

甘蓝型油菜CONSTANS基因植物过表达载体构建及转基因植株的获得

甘蓝型油菜CONSTANS目的基因的克隆以NCBI上公布的序列设计全长扩增引物进行扩增。对目的基因片段测序并进行酶切位点分析,设计酶切引物(BamHⅠ,SacⅠ),通过BamHⅠ和SacⅠ双酶切将目的基因片段连接在真核表达载体pBI121上,PCR鉴定结果表明PBI121+CONSTANS过表达载体已成功构建。将过表达载体转化感受态EHA105细胞,通过拟南芥花絮侵染T0代种子,用含卡拉霉素(50 mg/L)的MS固体培养基进行筛选,获得阳性植株。通过PCR鉴定,结果表明PBI121+CONSTANS过表达载体已成功导入拟南芥中,获得转基因阳性苗12株,为下一步基因功能分析做好了准备。     

水稻育性调控相关基因RNAi载体的构建及其表型鉴定

利用RNAi干扰技术研究不同基因对花粉发育、卵细胞发育和合子胚发育的影响是一种重要的手段。本研究通过筛选水稻在生殖发育过程中的9个重要调控基因,构建基因的RNAi表达载体,分析转基因植株育性及相关性状表型,以期探明RNAi表达载体对靶标性状的干扰效应。其中,AT61~AT63、AT64~AT66、AT67~AT69表达载体分别靶标花粉育性、卵细胞发育以及合子胚发育的调控。结果表明,除RNAi表达载体AT64没有获得转基因植株外,其余8个RNAi表达载体均获得了转基因植株;对T0代转基因植株的花粉育性、结实率以及潮霉素筛选(40 mg/L)发芽率检测的统计结果显示,RNAi表达载体AT62(花粉发育调控)、AT65(卵细胞发育调控)和AT67(合子胚发育调控)的干扰效应较强。本研究结果将为创制新型水稻基因工程不育系提供策略和选择。     

RNAi介导的百合抗CMV和LMoV的载体构建

为获得高效的RNAi(RNA interference)表达载体,培育百合抗病毒新种质,选取感病百合叶片为试验材料,同源序列比对后选取CMV 2b基因271 bp和LMoV cp基因428 bp作为靶基因片段。首先采用RT-PCR方法对感病植株进行病毒检测,确定其带有CMV和LMoV病毒;之后提取感病植株叶片总RNA,反转录得到cDNA,设计带有不同酶切位点的引物,以反转录得到的cDNA为模板,PCR扩增获得目的片段,产物回收纯化后,转化大肠杆菌,重组克隆。将各自的反向片段、正向片段顺次连接到载体pFGC5941上,经多次双酶切、连接、转化后,采用冻融法将构建好的载体转入农杆菌EHA105并进行重组鉴定。酶切结果表明已成功构建了分别抗CMV、LMoV的RNAi植物表达载体pFGC5941-C2和pFGC5941-L2,PCR扩增结果表明表达载体已成功转入农杆菌中。所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致,获得含载体的农杆菌可以直接应用于百合转基因抗病毒育种工程中。     

水稻抗旱基因OsbHLH120 RNAi干扰载体的构建及遗传转化

OsbHLH120是一个参与非生物胁迫响应基因,与水稻的抗旱性密切相关。本研究根据RNAi表达载体设计原则,从水稻日本晴基因组DNA扩增OsbHLH120基因片段,将长度400 bp干扰目的片段通过正反两个方向与载体p TCK303连接。从pTCK303载体的启动子、终止子和Rice Itron结构中设计两对检测引物,直接将检测引物的PCR产物测序验证载体是否构建成功。通过农杆菌介导法将构建的OsbHLH120RNAi干扰表达载体导入水稻品种日本晴,获得18株转基因阳性苗。本研究结果将有利于进一步研究OsbHLH120在水稻抗旱过程中的作用。