过量表达拟南芥NPR1基因提高小麦纹枯病的抗性

拟南芥NPR1基因是植物重要的抗病调控因子,转基因过表达该基因可以赋予植物广谱抗性.为明确该基因在小麦抗纹枯病基因工程中的应用潜力,本研究构建了由玉米ubiquitin启动子驱动的拟南芥NPR1表达载体,采用基因枪介导法导入到小麦品种扬麦12号中,获得20株转基因植株.对14个外源基因纯合株系的半定量RT-PCR和测序分析结果显示,外源拟南芥NPR1基因已经导入转基因小麦并有不同水平的表达,部分转基因株系拟南芥NPR1基因发生重排；纹枯病抗性鉴定结果表明,转基因株系中拟南芥NPR1基因的正确表达可以减轻纹枯病菌引起的病症发展,提高转基因小麦的纹枯病抗性.     

水稻质膜H+-ATPase基因对拟南芥遗传转化及其抗盐性分析

RT-PCR扩增得水稻质膜H -ATPase全长cDNA(PM-H -ATPase),构建了植物表达载体获得质粒pBI121-PM-H -ATPase,农杆菌介导、真空渗入法转化PM-H -ATPase基因入拟南芥,得35株T1代卡那抗性植株.抗性植株PCR分析表明,抗性植株整合了目的基因.Northern杂交分析进一步表明T3代转基因拟南芥表达了目的基因.抗盐(NaHCO3和NaC1)性分析表明:转基因植株的耐盐能力明显高于野生型;盐碱胁迫下转基因植株开花优先于野生型植株.     

DOF转录因子AtDof1.7 RNA干扰载体的构建及拟南芥的遗传转化

DOF (DNA binding with one finger)转录因子是植物特有的转录因子家族,含有一个独特的富含Cys残基的单锌指DNA结合区域,在植物生长发育中参与多种生物学过程。本研究根据拟南芥AtDof1.7基因(GenBank登录号为AT1G51700)序列设计含有不同酶切位点的特异性扩增引物,以拟南芥总DNA为模板,扩增AtDof1.7基因片段,将AtDof1.7基因正向反向分别插入表达载体的相应位置,构建成AtDof1.7基因的RNA干扰载体pADOF1。利用改良的floral-dip方法将干扰载体pADOF1成功转入野生型拟南芥,经草甘膦抗性筛选和PCR检测获得5株阳性转基因植株。利用RT-PCR技术和气相色谱法分别分析了AtDof1.7基因的表达和种子脂肪酸组成,结果表明5株转基因植株中AtDof1.7基因的表达量不同程度低于野生型植株,种子油酸含量明显上升,亚麻酸含量明显下降,说明AtDof1.7转录因子与拟南芥种子脂肪酸代谢途径有一定的关系,为进一步研究其在脂肪酸代谢过程中的调控作用以及在油菜中研究该类转录因子的功能奠定了基础。     

含异位表达花生AhNCED1基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力

AhNCED1是干旱胁迫下调控花生ABA生物合成的关键基因。以pCAMBIA1301为基本双元表达载体,分别构建CaMV35S启动子和拟南芥AtNCED3基因启动子(AtNCED3p)驱动花生AhNCED1基因的2个植物双元表达载体p35S::ORF和pAtNCED3p::ORF,通过根癌农杆菌介导法将上述两个表达载体分别转化野生型和129B08/nced3突变体拟南芥,经潮霉素筛选和PCR鉴定分别获得35S::ORF-WT和A3p::ORF-B08转基因植株,RT-PCR证实花生AhNCED1基因已在转基因植株中稳定表达,并对野生型、129B08/nced3突变体和转基因拟南芥进行外源ABA敏感性和耐渗透胁迫能力分析。结果表明,129B08/nced3突变体对外源ABA的敏感性下降,而花生AhNCED1基因在拟南芥中的异位表达提高了对外源ABA的敏感性。在山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体种子的相对萌发率明显低于野生型的,而A3p::ORF-B08转基因拟南芥种子的相对萌发率与野生型的相当,显著高于129B08/nced3突变体的,且300mmolL–1山梨醇胁迫下,35S::ORF-WT转基因拟南芥种子的相对萌发率明显高于野生型的。在300mmolL–1山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体幼苗叶片高度黄化,根的形成和幼苗生长受到严重抑制,而A3p::ORF-B08转基因突变体与野生型相似,叶片仅轻度黄化,幼苗生长势良好;35S::ORF-WT转基因植株幼苗生长未受明显影响。这些结果说明,拟南芥129B08/nced3突变体对山梨醇诱导的非离子渗透胁迫有超敏性,异位表达花生AhNCED1基因能恢复该突变体对山梨醇的超敏性,提高拟南芥的耐渗透胁迫能力。     

拟南芥转录因子AtOFP19功能的初步研究

AtOFP19是植物中特有的蛋白质,是拟南芥卵形家族蛋白(AtOFPs)新发现的成员之一。为确定AtOFP19在植物体中的特定作用,采取PCR克隆方法,获得了AtOFP19基因,并利用生物信息学的方法对AtOFP19基因进行分析。采取农杆菌介导法浸染野生型拟南芥,获得35S∶HA-AtOFP19转基因植株。对比35S∶HA-AtOFP19转基因植株、atofp19突变体植株与野生型植株的形态差异,结果表明,atofp19表型与WT无明显差别,OE与同时期WT相比较,其植株莲座叶较小,茎细,植株整体较细小。此外还成功构建了PUC-GD-AtOFP19载体,应用原生质体瞬时转染技术,利用酶标仪测定GUS相对表达量,证明AtOFP19是转录抑制子。qRT-PCR测定分析表明,AtOFP19基因在拟南芥各个部位均有表达,在花中表达量最高。在拟南芥不同发育阶段中,AtOFP19基因表达量在拟南芥发育初期较高,随着拟南芥生长发育AtOFP19基因表达量降低,在开花期又升高。进一步探究AtOFP19基因在植物体内的功能,对比OE、atofp19与WT的种子萌发率,发现AtOFP19对种子萌发具有抑制作用。为探究AtOFP19基因对激素的反应,外源添加5种激素于1/2MS培养基中,挑选生长状况良好的幼苗于土壤中培养,进行qRT-PCR分析,结果表明AtOFP19基因的表达主要受到6-BA激素的调控。以上结果表明,AtOFP19是转录抑制子,对种子萌发有抑制作用,且在植株体内主要受到6-BA调控。     

转拟南芥NPR1基因可增强棉花对真菌病害和肾形线虫的抗性

<正>NPR1(non-expressor of pathogenesis-related genes1)基因是从拟南芥中克隆得到的控制系统获得性抗性(SAR)的重要调节基因。过表达NPR1基因可提高拟南芥等多种植物的抗病性,但对植物生长无不良影响。棉     

蛋白激发子Hrip1基因在拟南芥中表达可提高植株的耐盐耐旱能力

Hrip1是从极细链格孢(Alternaria tenuissima)代谢物中分离的一种蛋白激发子。将蛋白激发子基因Hrip1转化到拟南芥,对5个T₁代转基因拟南芥株系进行分子检测, 证明Hrip1基因能够在拟南芥中转录和表达。转基因植株对盐和干旱胁迫的抗性显著增强, 75 mmol L⁻¹ NaCl和50 mmol L⁻¹甘露醇渗透胁迫2 d, 转基因植株种子平均相对发芽率为32.1%和77.9%, 分别比野生型的增加3.72倍和5.61倍; 150 mmol L⁻¹ NaCl和50 mmol L⁻¹甘露醇处理拟南芥幼苗7 d后, 转基因植株平均相对根长为81.79%和93.25%, 分别是野生型的1.53倍和1.34倍。3周龄的转基因植株在250 mmol L⁻¹ NaCl条件下胁迫20 d, 平均存活率为67%, 显著高于野生型(42%)(P<0.05); 干旱胁迫25 d后, 复水5 d转基因植株平均存活率为72%, 而野生型仅为44%。检测结果显示转基因植株叶片的抗氧化酶活性明显高于野生型, 用200 mmol L⁻¹ NaCl和200 mmol L⁻¹甘露醇处理24 h后, POD活性分别比野生型植株提高1.56倍和1.85倍, CAT活性分别比野生型植株提高1.64和1.86倍。说明蛋白激发子Hrip1基因在拟南芥中的表达能够改善和提高植株的耐盐抗旱能力。     

转GmAREB基因提高拟南芥的干旱、氧化胁迫耐性

以耐盐性较强的大豆(Glycine max L.)品种铁丰8号为试验材料,克隆到1个A亚族bZIP类转录因子基因,命名为GmAREB (Glycine max ABA responsive element binding protein)。该基因由1 317个核苷酸组成,编码439个氨基酸残基,包括4个保守的磷酸化位点区域(C1、C2、C3和C4)、1个核定位信号区(KVVE)和1个bZIP转录因子保守域。聚类分析显示GmAREB蛋白与拟南芥ABF2、水稻OsTRAB1具有较高的同源性,并存在较近的亲缘关系。采用凝胶阻滞实验方法证明GmAREB蛋白与ABRE顺式元件具有体外结合特异性。功能分析结果表明, 在干旱胁迫条件下, GmAREB转基因拟南芥的存活率(50%)显著高于野生型(5%);气孔统计分析显示转基因植株的气孔开度(0.8 μm)明显比对照开度小(2.6 μm)。氧化胁迫结果显示GmAREB转基因拟南芥在甲基紫精溶液中叶绿素含量比野生型高(7.3 mg g^–1 FW)。转基因拟南芥RT-PCR分析表明,GmAREB基因过表达能够增强下游胁迫相关基因ABI1、ABI2的表达,抑制气孔开闭相关基因KAT1、KAT2的表达。综上所述,GmAREB基因过表达有效调控了转基因拟南芥下游靶基因表达,加速了气孔关闭,减少了水分蒸发和叶绿素降解,从而提高了转基因拟南芥对干旱、氧化胁迫耐性。     

甘蓝型油菜BnADH3基因的克隆及转BnADH3拟南芥的耐淹性

利用RT-PCR技术从甘蓝型油菜耐淹品系WR-4中克隆获得Bn ADH3基因,其完整开放阅读框为1137 bp。该基因编码379个氨基酸,与甘蓝Bo ADH3基因和拟南芥At ADH3基因高度同源,同源性分别达到96%和91%。利用定量RT-PCR检测Bn ADH3基因在油菜耐淹系WR-4和不耐淹系WR-24中的表达表明,在淹水处理下该基因表达受到一定的诱导,淹水处理6 h后表达开始上调,说明Bn ADH3基因在油菜耐淹机制中发挥作用;将其转化到模式生物拟南芥中,采用幼苗淹水3 d后去水处理,测定表明转基因株系叶片和根系中乙醇脱氢酶活性均高于野生型;生长4周和6周的拟南芥植株淹水3 d后的表型显示,Bn ADH3的表达可增强拟南芥对淹水胁迫的耐性,处理的T2代转基因幼苗大部分恢复,但野生型幼苗枯死;调查表明,淹水5 d后野生型植株的存活率为26.7%,转基因株系ADH33和ADH44的存活率分别为80.0%和66.7%。     

转GbNPR1基因提高烟草抗病性

病害是造成烟草减产和品质降低的主要因素,而利用生物技术提高烟草抗病性是解决此问题的有效途径,其中包括利用与植物抗病性密切相关的关键因子如病程相关基因非表达子(non-expressor of pathogenesis-related genes1,NPR1)。本研究利用源于海岛棉的Gb NPR1基因,表皮特异性启动子CUT1和组成型启动子35S构建两个植物表达载体35S-Gb NPR1和CUT1-Gb NPR1,经农杆菌介导法分别转化烟草。T0代及T1代转化植株PCR检测证明,目的基因已整合到核基因组中。T1代植株RT-PCR分析表明,Gb NPR1基因在转录水平得以表达。bar试纸条检测为阳性,证明和Gb NPR1连锁的草甘膦基因能够正常转录和翻译表达。将阳性植株进行烟草病菌赤星病、炭疽病和低头黑病等三种病害的病原菌离体接菌实验,研究结果表明:转CUT1-Gb NPR1载体的转基因烟草虽然较转35S-Gb NPR1载体的烟草对三种病菌的抗性稍低,但较野生型烟草相比具有较高抗性。转Gb NPR1基因的烟草能提高对低头黑病和炭疽病的抗性为首次报道。     

2个MADS-box基因在山葡萄雌花和雄花中的表达分析

为了探明MADS-box基因在山葡萄性别分化中的作用,笔者利用实时荧光定量PCR技术对Vv MADS5和Vv MADS8 2个基因在山葡萄雌、雄花发育过程的表达情况进行分析。结果表明,2个基因在山葡萄雌花和雄花中都有表达,Vv MADS8在雌花和雄花中的表达趋势以及表达量基本相同。Vv MADS5在雌花和雄花中的表达类型相同,而其在雌花中的表达量显著高于雄花。Vv MADS8在花芽膨大期(4月30日)表达量最高,而Vv MADS5在花序展露期(5月14日)表达量最高。Vv MADS8、Vv MADS5参与山葡萄性别分化,但不是控制性别分化的关键基因。     

百合科十二卷属玉露的组培快繁关键技术研究

为建立十二卷属多肉花卉玉露的快繁技术体系,以当年抽生的花序为外植体,以MS为基本培养基,研究不同的激素配比对外植体的诱导、分化、增殖、壮苗与生根的影响,建立适合玉露离体快繁的技术体系,最佳启动培养基为MS 6-BA 2.0 mg/L NAA 0.02 mg/L,愈伤组织诱导及分化培养基MS 6-BA 0.5 mg/L KT 0.5 mg/L NAA 0.01 mg/L,愈伤组织诱导率达87.1%,丛芽分化率达52.3%,生根培养基为1/2MS IBA 0.5 mg/L NAA 0.1 mg/L AC 0.5 g/L。试管苗生根率达97.5%,炼苗成活率达90%以上。本项研究结果可以在不损伤母本的基础上实现玉露的人工组培快繁,通过此项技术可以实现玉露种苗的规模化生产。     

蝉蜕诱导对球孢白僵菌生物学特性及其毒力影响的研究

利用改良蝉蜕诱导培养基对球孢白僵菌进行诱导,以无蝉蜕PDA培养基作为对照,目的是比较蝉蜕诱导后球孢白僵菌菌株的生长速率、产孢量、孢子萌发率等多个生物学指标,及二者对3龄亚洲玉米螟幼虫的毒力。经蝉蜕诱导的球孢白僵菌菌株的产孢量、孢子萌发率以及对玉米螟幼虫毒力都高于对照组,且差异显著,对玉米螟幼虫毒力处理组LT₅₀为4.73天,对照组需要6.97天。同时经蝉蜕诱导过的菌株开始产孢时间和胞外蛋白酶活性都优于对照组,胞外蛋白酶活性的变化范围是1.497×10^-2~3.538×10^-2 IU/mL,但经诱导菌株的生长速率低于处理组。鉴于球孢白僵菌菌株经蝉蜕诱导后,其产孢量和孢子萌发率增加,并且能够增强对玉米螟幼虫毒力,可利用其进行球孢白僵菌菌种保存和改良。

     

外源硒对谷子叶绿素荧光特性的影响

为了探讨外源硒对谷子叶绿素荧光特性的影响,在大田条件下以‘长农35’为试验材料采用随机区组设计,在谷子抽穗期叶面喷施不同浓度亚硒酸钠,分析谷子叶绿素含量、叶片SPAD值以及叶绿素荧光参数的变化趋势。结果表明:叶面喷施亚硒酸钠提高了谷子功能叶的叶绿素含量并且显著影响谷子叶绿素的荧光特性,叶面喷施合理浓度的硒可以提高谷子叶片的最大光化学效率(Fv/Fm),对电子传递(ETR、ФPSⅡ)和光化学猝灭系数(q P)有增强作用,一定程度上降低了非光化学猝灭系数(q N),从而削弱PSⅡ光能的热耗散,增大PSⅡ的光化学效率。由此可见,叶面喷施硒对谷子叶绿素光和色素、叶片SPAD值以及叶绿素荧光参数相关指标有明显正效应,在谷子抽穗期叶面喷施硒浓度67.84 g/hm2对其叶绿素荧光特性增益效果最佳。     

沉水植物苦草和轮叶黑藻对水环境的影响

为了研究沉水植物苦草和轮叶黑藻的对水环境的影响,在控制条件下单独种植苦草、轮叶黑藻和二者混种,笔者比较研究了苦草、苦草+黑藻、黑藻组合水体中总氮(TN)、总磷(TP)、铵氮(NH4+-N)、叶绿素a、总悬浮质(TSS)及总有机氮(TOC)浓度的区别。结果表明:苦草和轮叶黑藻对水环境的影响不同,单独种植苦草时,上覆水中总氮和氨氮含量高于其他处理,但总磷、叶绿素、TSS和TOC含量都低于轮叶黑藻单种和混种处理。研究结果说明,苦草对于降低上覆水中总磷和叶绿素含量作用优于轮叶黑藻,对维持水体水质有良好效果。     

果园间作小麦对黑绒鳃金龟寄主选择行为的影响

黑绒鳃金龟(Maladera orientalis Motschulsky)是一种多寄主害虫,但是伴随着剧毒农药禁用,已经成为果园的一种重要害虫。由于黑绒鳃金龟昼伏夜出的生物学特性,喷雾防治很难收到好的防治效果。为有效控制果园黑绒鳃金龟,同时达到农药减用的效果。本研究以苹果(Malus pumila)、梨(Pyrus spp.)、桃(Prunus persica)、樱桃(Prunus species)和山楂(Crataegus pinnatifida)为寄主,以小麦(Triticum aestivum)为试材,通过室内选择和田间趋避试验研究了小麦对黑绒鳃金龟选择行为的影响。在果树枝条和小麦之间进行选择时,黑绒鳃金龟对每种果树枝条的选择率都≥90%,而对小麦的选择率都＜10%;不同果树枝条与小麦混合放入同一容器后,黑绒鳃金龟对混合物的选择率明显低于对单一果树枝条的选择率;小麦同时存在于H型嗅觉仪两臂时黑绒鳃金龟的选择行为明显受到影响,两臂之间的选择率差异不明显,且黑绒鳃金龟的不选择率最高达到了25%;田间间作试验发现无间作物的樱桃园、梨园、苹果园3种果树上黑绒鳃金龟的虫口数量分别达到了18.4、17.6、18.9头/株。而间作小麦后黑绒鳃金龟的虫口数量明显下降(P<0.05),其中樱桃上黑绒鳃金龟虫口数量最大,仅为4头/株;同时发现间作小麦后3种果树的叶片受害率相对于没有间作物的果园明显降低;距离试验表明,距小麦0.5、2 m的梨树叶片被黑绒鳃金龟为害率分别为8%、9%,差异不明显(P>0.05),而在距小麦6 m时梨树的叶片的受害率上升为35%,明显高于距离0.5 m时(P<0.05),而在距离8 m时梨树叶片的受害率73%,明显高出0.5 m时8倍(P<0.05)。这些结果表明,小麦严重干扰了黑绒鳃金龟的寄主选择行为。在樱桃园、梨园和苹果园间作小麦对黑绒鳃金龟具有较好的趋避防治效果,在间作果园当梨树与小麦距离在2 m以内对黑绒鳃金龟的趋避效果非常明显。     

乌桕和无患子容器苗育苗密度与苗木生长和质量的关系

为提高乌桕与无患子的苗木品质,研究育苗密度对乌桕与无患子的苗木生长形态变化及苗木品质的影响。试验以当年生乌桕与无患子幼苗为试验材料,设不同育苗密度5个处理,测定分析不同育苗密度下乌桕与无患子幼苗的生长进程以及干物质积累、叶片数、主根长形态指标。结果表明:不同育苗密度下,乌桕与无患子的生长进程差异十分显著;且无患子和乌桕的苗高随着密度的变大逐渐增加,但是当苗高增加到一定程度时,苗高并未随之增加;乌桕、无患子的单株、茎生物量表现为随着育苗密度的变大而逐渐增加。且乌桕与无患子的合格苗所占的百分率随其苗木密度的变大而降低,与之呈负相关关系。综合苗高、地径、单株生物量、茎生物量、幼苗形态因子分化参数、合格苗率、单位面积合格苗数等指标,无患子以育苗密度为280~342株/m2、乌桕以育苗密度为337~412株/m2时,其生长形态和植株品质比较协调,植株苗木品级合格率较高。     

山羊β-防御素表达载体的构建及产物的活性鉴定

对山羊GBD-1进行载体构建,转到毕赤酵母中高效表达并对表达产物的生物学活性进行鉴定,为进一步研究防御素抗菌机理打下基础。根据GenBank中山羊β-防御素的CDS区序列,设计含有特殊酶切位点的引物扩增到目的片段,将该片段克隆到真核表达载体pPICZαA中,构建重组表达质粒pPICZαA/GBD-1,电转化到毕赤酵母中进行诱导表达。测序结果表明扩增的目的片段为114 bp,编码38个氨基酸,经Tricine-SDS-PAGE电泳验证在4.3 KD处有目的蛋白;作抑菌实验发现,重组蛋白对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑菌效果。山羊防御素成功地在毕赤酵母中诱导表达,为进一步研究GBD-1的蛋白纯化以及抗菌机理打下基础,并为利用基因工程方法生产防御素提供理论依据。     

西瓜枯萎病菌的鉴定及申嗪霉素对其防效评价

由于重茬西瓜种植面积增多,西瓜枯萎病的发生面积逐步扩大,严重影响了西瓜生产。本研究用PDA培养基从中国农业科学院郑州果树研究所大棚温室萎蔫枯萎的西瓜上分离病原菌。形态学鉴定为尖孢镰刀菌;ITS序列分析表明其与西瓜枯萎病菌的序列一致性达到99%;发现该菌引起西瓜枯死严重,发病率达96.7%以上。因此,证实是西瓜枯萎病菌引起的。为了防治该病害,进行了温室和室内的申嗪霉素药效评价。室内抑菌实验和温室内药剂处理结果一致,1%申嗪霉素100倍防治效果最好,抑菌率达76.03%,灌根防治率达58.86%。因此,生产上建议在西瓜枯萎病发病早期使用1%申嗪霉素100倍连续3次灌根,每次间隔约8天左右,尽可能减少西瓜枯萎病菌对西瓜的影响。     

青花菜小孢子发育时期与花器形态的相关性

对青花菜小孢子发育时期细胞学特征及其与花器外部形态的相关性展开研究,试图从花器的外部形态特征来推断小孢子的发育时期,最终目的是为花药或游离小孢子培养研究提供科学依据。结果表明,青花菜小孢子发育经历四分体时期、单核早中期、单核靠边期和双核期共4个时期,供试3个青花菜各时期细胞学特征存在明显差异。青花菜小孢子发育时期与花蕾大小和花药颜色等指标密切相关。供试青花菜花蕾纵径为10.52~11.05 mm,花蕾横径为3.64~4.25 mm,花药长度为2.85~2.87 mm,花药宽度为0.95~0.96 mm,且花瓣微露出花萼,花瓣和花药均为淡黄色时,80%以上的小孢子发育至单核靠边期。