苏云金芽胞杆菌一新菌株的鉴定及其杀虫活性

为分离并鉴定对亚洲玉米螟具有高毒力的苏云金芽胞杆菌菌种,通过棋盘式采集法从吉林省农业科学院试验田土壤中分离获得野生菌株,进行了形态、生化特性、伴孢晶体观察及基因型鉴定,并测定了其对3种鳞翅目害虫的室内生物活性。结果显示:该菌株在LB培养基上为圆形、暗白色菌落,边缘不整齐,革兰氏染色阳性,产生的伴孢晶体形状多为不规则形。16S r DNA序列与苏云金芽胞杆菌属的NBRC 13865同源性达99%;该菌株为cry2+cry9复合基因型,编码氨基酸序列与Cry2Ab和Cry9Ea蛋白同源性分别为94%和99%,鉴定为苏云金芽胞杆菌,命名为JN001。该菌株对亚洲玉米螟具有较高毒性,以1.0×109个/m L菌体浓度接种3龄幼虫72 h后,其校正死亡率为95.06%,致死中浓度(LC50)为4.12×103个/m L菌体,而对斜纹夜蛾和粘虫毒性较弱,接种72 h后校正死亡率分别为12.88%和7.34%。表明该菌株是1株对亚洲玉米螟具有较强毒力的苏云金芽胞杆菌新菌株,具有较好的开发利用潜力。     

金龟子绿僵菌黏着蛋白MAD1原核表达及其抗体的制备

Mad1基因存在于金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae),在侵染昆虫表皮时起到了吸附性作用。为获得高纯度MAD1蛋白,制备多克隆抗体,以便深入了解其功能,本研究从金龟子绿僵菌中克隆出Mad1基因并连接到原核表达载体对其进行表达形式分析,经IPTG诱导及金属螯合层析纯化免疫家兔制备抗体,最后利用Western印记检测抗体特异性。经Western印记检测表明抗体特异性极高,诱导表达及纯化制备出高纯度MAD1蛋白产物,并获得效价为1∶12 800的多克隆抗体,为Mad1基因功能验证及分子检测提供良好的实验材料。     

创制转Mad1基因球孢白僵菌工程菌株提高对玉米螟毒力

克隆来源于生防真菌绿僵菌的黏着蛋白基因Mad1,构建含玉米瘤黑粉菌热激蛋白启动子hsp70和以抗萎锈灵基因carboxin为筛选标记的遗传转化载体上,利用PEG介导的原生质体转化法导入到受体球孢白僵菌菌株D1-5中,获得转化子,经继代培养及分子检测,获得遗传稳定的基因工程菌株。利用蝗虫后翅及洋葱表皮进行吸附试验进行工程菌株的生物学功能鉴定,结果表明,野生型和工程菌的分生孢子对于洋葱表皮的吸附量无明显差异,工程菌的分生孢子对蝗虫翅膀的吸附显著高于野生型,表明Mad1基因的导入能够增加球孢白僵菌对昆虫组织的吸附,对植物表皮组织不存在吸附能力。对亚洲玉米螟幼虫室内毒力测定结果表明,转化后的工程菌株致死中时间比野生型缩短34.07%,杀虫效率显著提高。     

不同交配型球孢白僵菌在玉米植株中的定殖及其交配型基因变异比较研究

本文通过分析两种不同交配型球孢白僵菌菌株(MAT1-1-1,I型;MAT1-2-1,II型)在玉米植株中的定殖效率和回收菌株交配型基因序列的变异,拟揭示球孢白僵菌在玉米植株内生定殖过程中玉米对不同交配型菌株的选择规律、不同交配型菌株对环境的适应性能力。试验分为4个接种组,接种菌株为I型交配型菌株(Bb OFDH1-5)(处理B5)、II型交配型菌株(Bb DPSD2)(处理B2)、两个菌株等量混合(处理B5+B2)、对照组(处理CK),处理组B5、B2、B5+B2接种孢子浓度均为108孢子/m L,对照组接种量为零。结果表明,处理B5、B2、B5+B2三组中均有球孢白僵菌在玉米叶片中定殖,其中,交配型II菌株处理组B2中内生定殖效率高,检测率为33.00%;混合处理组B5+B2中交配型II菌株比I型菌株回收比率高,回收比为12:10。交配型基因序列分析显示,交配型I菌株处理组B5和混合处理组B5+B2的回收菌株中I型交配型基因非编码区序列出现多个位点突变,编码区仅在3个位点出现突变;交配型II菌株处理组B2和混合处理组B5+B2中II型交配型基因序列均没有发生变异。以上结论说明球孢白僵菌在玉米植株定殖过程中,交配型II菌株Bb DPSD2定殖率较I型菌株Bb OFDH1-5高;玉米植株更倾向于选择II型交配型菌株作为内生菌株;交配型基因MAT1-1-1比MAT1-2-1更易发生突变表明I型菌株对自然环境的适应性更强。     

蝉蜕诱导对球孢白僵菌生物学特性及其毒力影响的研究

利用改良蝉蜕诱导培养基对球孢白僵菌进行诱导,以无蝉蜕PDA培养基作为对照,目的是比较蝉蜕诱导后球孢白僵菌菌株的生长速率、产孢量、孢子萌发率等多个生物学指标,及二者对3龄亚洲玉米螟幼虫的毒力。经蝉蜕诱导的球孢白僵菌菌株的产孢量、孢子萌发率以及对玉米螟幼虫毒力都高于对照组,且差异显著,对玉米螟幼虫毒力处理组LT₅₀为4.73天,对照组需要6.97天。同时经蝉蜕诱导过的菌株开始产孢时间和胞外蛋白酶活性都优于对照组,胞外蛋白酶活性的变化范围是1.497×10^-2~3.538×10^-2 IU/mL,但经诱导菌株的生长速率低于处理组。鉴于球孢白僵菌菌株经蝉蜕诱导后,其产孢量和孢子萌发率增加,并且能够增强对玉米螟幼虫毒力,可利用其进行球孢白僵菌菌种保存和改良。