尼罗罗非鱼Hsc70的原核表达和多克隆抗体制备

通过原核表达系统表达尼罗罗非鱼热休克蛋白Hsc70,纯化该蛋白并制备其多克隆抗体。对尼罗罗非鱼热休克蛋白进行生物信息学分析,设计特异性引物,扩增出Hsc70基因,通过双酶切与pET-28a构建重组质粒表达载体,并转入大肠埃希菌B21中通过诱导剂IPTG进行原核诱导表达,表达产物用SDS-PAGE鉴定并用镍柱进行纯化。将纯化后的重组蛋白免疫日本大耳兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体效价,Western blot检测抗体特异性。结果表明,原核表达系统成功表达了尼罗罗非鱼热休克蛋白Hsc70,重组蛋白分子量约为75 ku,主要以包涵体形式表达。经镍柱纯化得到高纯度的Hsc70;该蛋白免疫日本大耳兔获得特异性多克隆抗体,效价为1∶2 048 000;Western blot检测到一条75 ku的特异性条带,表明该抗体能特异性地识别尼罗罗非鱼Hsc70蛋白。尼罗罗非鱼Hsc70蛋白在大肠埃希菌中成功表达,制备的重组蛋白和多克隆抗体为深入研究尼罗罗非鱼Hsc70的功能提供了分子工具。     

鲫鱼一种新型SNRPC基因的蛋白表达和抗体制备分析

本研究构建了鲫鱼卵母细胞特异表达的新型SNRPC基因的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体,并检测抗体特异性,为进一步研究新型SNRPC基因的功能奠定基础。首先设计引物,应用RT-PCR从鲫鱼成熟卵母细胞中获得含该基因片段,重组入原核表达载体PinPoint T中,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,应用亲和层析法获得纯度较高的原核表达蛋白并免疫家兔制备多克隆抗体,用Western blot方法检测此抗体特异性。成功构建了新型SNRPC基因重组表达载体,表达的蛋白经纯化后免疫家兔得到了特异的多克隆抗体。鲫鱼卵母细胞的新型SNRPC基因的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化及抗体的制备为后续的研究提供了理论基础。     

泉古菌Sulfolobus islandicus PCNA1的原核表达及其多克隆抗体的制备

泉古菌Sulfolobus islandicus中PCNA有3个同源类似蛋白,本研究选取PCNA1作为研究对象,为获得可溶性表达的PCNA1蛋白,制备多克隆抗体,深入了解PCNA1基因的功能,将PCNA1基因片段克隆到组氨酸标签融合的表达载体pET30a中,利用IPTG诱导,金属螯合亲和层析进行纯化分析表明,融合蛋白大部分可溶。紫外分光光度法测定纯化蛋白的纯度可达90%以上,浓度约为2 mg/mL。免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗血清效价可达1∶10 000以上,Western印迹检测证明抗体特异性良好。     

蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白获得稳定表达.表达产物经Glutathione-sepharose 4B亲和层析初步纯化后,用凝血酶切除GST标签,而后经离子交换层析及分子筛在AKTA Explorer上进一步纯化,得到高纯度无标签的PKR蛋白.以纯化后的PKR蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,斑点杂交试验检测其效价达到1∶50 000以上,Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明制备的多抗与PKR蛋白的反应具有高度特异性.【结论】PKR蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多克隆抗体可用于PKR蛋白的检测,从而为研究PKR在病毒感染过程中的作用提供了重要的工具.     

猪肺炎支原体脂蛋白LppT的多克隆抗体制备及鉴定

试验构建猪肺炎支原体重组表达质粒pET30a-LppT,通过快速定点突变试剂盒将LppT基因中513、945、1 860、2 547 bp处的A突变为G,使改造后的LppT基因能在大肠杆菌系统中正确表达,IPTG诱导重组蛋白的表达并进行了蛋白纯化,纯化的目的蛋白与佐剂混合、乳化制备免疫原,免疫新西兰大白兔制备LppT蛋白多克隆抗体。SDS-PAGE分析结果显示,IPTG诱导表达后获得1条特异性蛋白条带,分子质量约为110 ku,与预期蛋白大小一致。可溶性分析结果表明目的蛋白以可溶形式表达于上清中,纯化的蛋白经SDS-PAGE分离后,用制备的LppT多克隆抗体进行Western Blot检测,结果表明制备的LppT多克隆抗体具有较强的特异性。     

绿僵菌黏附素MAD1体外表达及诱导花生响应的作用

【目的】绿僵菌具有昆虫致病性和植物共生性,其黏附素MAD1在绿僵菌侵染寄主昆虫过程中起重要作用。通过体外真核表达MAD1蛋白,明确MAD1在绿僵菌与植物共生中发挥的作用。【方法】以绿僵菌转录组的Unigenes作为参考序列,在GenBank中进行同源性检索比对,设计引物,以金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）IPPM010202菌株的cDNA作为模板,克隆得到mad1,通过DNAMAN对mad1序列进行蛋白翻译,利用ProtParam在线工具预测MAD1蛋白氨基酸组成及其理化特性,利用SMART在线程序分析其结构域。构建mad1重组真核表达载体并转化毕赤酵母,获得重组子,通过甲醇诱导表达得到MAD1蛋白;通过Ni-NTA亲和层析获得纯化蛋白。以纯化蛋白溶液（20 μg·mL^-1）浸没处理花生根0.5、6、12和24 h,通过qPCR检测花生根膜受体基因（CERK1、RPK）、免疫相关级联基因（MAPK、MMK1、CDPK）和转录因子基因（MYB86）、细胞壁整合基因（SCW1）及防御相关基因（PTi1、RML1A）的转录水平。【结果】克隆得到了绿僵菌黏附素基因mad1,全长2 136 bp,编码711个氨基酸,分子量约为74.8 kD;生物信息学分析表明,MAD1的N端有信号肽,C端有糖基磷脂酰肌醇（GPI）细胞壁锚定位点,且含有CFEM功能结构域,属于亲水性蛋白。成功构建了MAD1真核表达系统,诱导表达并纯化出具有生物活性的MAD1蛋白,对花生根进行不同时间段的处理,发现MAD1处理后0.5 h,根尖细胞感知并启动膜类识别受体基因CERK1表达;0.5—6 h,根膜受体基因CERK1、RPK转录水平均上调,膜整合基因SCW1转录由下调转为上调,免疫反应相关基因MAPK、MMK1、CDPK、MYB86的转录受到短暂抑制,防御基因PTi1、RML1A转录下调,植物根部免疫防御反应受到抑制;6—12 h,膜受体基因维持上调表达,而防御基因RML1A从下调逆转为强烈上调;12—24 h,膜受体类基因CERK1、RPK,防御基因PTi1、RML1A均上调,免疫相关级联基因MAPK、MMK1、CDPK,转录因子基因MYB86也出现微弱的上调,植物根部启动免疫防御反应。【结论】在绿僵菌与花生根的互作早期,绿僵菌MAD1蛋白 6 h时已激活花生根膜受体基因CERK1和RPK的识别响应,同时抑制花生免疫级联基因MAPK、CDPK、MMK1及防御相关基因如PTi1、RML1A的表达,有助于绿僵菌在花生根组织上定殖;随后诱导花生细胞壁整合基因SCW1上调表达,参与根上受损细胞壁的修复与重建,促进绿僵菌与花生共生关系的建立。诱导植物的免疫抑制和细胞壁重建整合可能是绿僵菌与植物建立共生关系的重要步骤。     

牛病毒性腹泻病毒Core蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的Core蛋白及其多克隆抗体,根据Core蛋白的编码基因序列,设计合成一对特异性引物,利用RT-PCR扩增BVDV Core基因并定向插入Pet30a载体中,构建重组质粒Pet30a-Core,经酶切鉴定后转化大肠埃希菌TOP 10感受态细胞,筛选获得阳性重组菌,以IPTG进行诱导后成功表达出分子质量为20 ku的重组Core蛋白。将诱导表达的蛋白产物经融合蛋白的Ni柱亲和法进行纯化,利用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并利用间接ELISA法测出多克隆抗体效价达到1∶512 000。蛋白质印迹法(Western blot)和间接免疫荧光试验(IFA)证实,多克隆抗体可与细胞中的BVDV抗原发生反应,具有良好的免疫原性和特异性。本实验成功制备了BVDV重组Core蛋白的兔源多克隆抗体,为BVDV的检测及其Core蛋白功能研究奠定了基础。     

大肠杆菌NrfA蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备(英文)

[目的]为克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并鉴定。[方法]以以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,WesternΒlotting检测抗体的特异性。[结果]适构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可以高效表达NrfA蛋白,免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1:204900,经WesternBlotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,构建了表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。为研究细菌有关NrfA奠定了基础。     

大肠杆菌NrfA蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备

[目的]克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并对其进行鉴定。[方法]以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,Western Blotting检测抗体的特异性。[结果]构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可高效表达NrfA蛋白;免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1∶204 900;经Western Blotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,并构建了其表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性,为研究细菌有关NrfA奠定了基础。     

西农萨能羊MAT基因的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备高特异性、高效价的乙酰/丙二酸单酰转移酶(MAT)多克隆抗体,为研究山羊MAT在脂肪酸代谢中的功能奠定基础。【方法】采用PCR方法扩增奶山羊的MAT基因,将其亚克隆到pET32a(+)载体得到pET32a(+)-MAT原核表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的MAT蛋白经复性后进行活性检测。采用皮下免疫法将纯化的MAT蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测血清多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR扩增得到981bp的MAT基因编码区;成功构建了pET32a(+)-MAT原核表达载体,诱导表达获得了56ku的重组蛋白。活性检测表明,复性后的MAT具有转移酶活性,ELISA检测显示抗体效价达1∶128 000,经Western blot鉴定,制备的多克隆抗体能特异性检测原核表达的MAT蛋白以及在HEK-293细胞中表达的MAT蛋白。【结论】获得了具有酶活性的MAT蛋白以及高特异性、高效价的兔抗MAT多克隆抗体,为研究MAT在脂肪酸代谢中的功能提供了重要的试验工具。