金龟子绿僵菌在草原羊草和克氏针茅根际的种群动态和根内宿存鉴定

绿僵菌防治草原蝗虫效果显著,其在草原田间的存活能力影响其持续控害效果。除了侵染昆虫,绿僵菌还具有在植物根际宿存和根内生的生活方式,但相关宿存规律和内生性的研究报道很少。本文研究了绿僵菌在内蒙古草原两种优势种植物羊草和克氏针茅根际的种群数量变化并对其在这两种草的根内宿存进行了鉴定。结果表明,在干旱的内蒙古草原,绿僵菌施用后种群数量在30 d内快速下降,但能够以低密度在羊草、克氏针茅根际土壤中至少延续宿存75 d,羊草根际环境比较利于绿僵菌生存。对菌株egfp基因标记的特异PCR检测证明了绿僵菌在羊草和克氏针茅根内宿存。试验数据为指导植保生物防治中充分利用绿僵菌的昆虫病原性和植物内生特性提供理论基础,也将成为绿僵菌物种生活方式多样性、与植物互作及共进化研究的重要基础。     

花生田施用绿僵菌对土壤微生物群落的影响

昆虫病原真菌绿僵菌对地下害虫防治具有良好应用前景，而大量释放绿僵菌可能引起土著微生物群落变化，从而影响其植物保护的综合效果。本文研究了花生播种期施用绿僵菌后，在根际和根围土壤中绿僵菌自身种群及土著细菌、真菌和放线菌种群的消长和群落结构变化。结果表明，绿僵菌种群在30 d内快速下降，之后降速减缓，以低密度持续存活。随花生生长，土壤微生物自身有消长过程，施用绿僵菌对放线菌影响最大、真菌其次、细菌最小，在根际的影响大于在根围的影响。分别地，绿僵菌处理对根际和根围细菌、根围真菌无显著影响；使根际真菌种群初期的下降速度减缓，到达谷底时间由15 d推迟到30 d，但回升速度加快，达峰顶由60 d提前到45 d，峰值降低1/3；绿僵菌明显抑制了根际放线菌种群，使其消长变化周期与对照完全相反，且45 d时回落至低点后不再回升；绿僵菌减缓了根围放线菌种群下降，使达谷底时间由30 d推迟到45 d，且回升幅度减小。土壤微生物群落结构在施菌后15～30 d的幼苗至初花期有明显变化，细菌种群总体占比显著下降，但与对照相比，施菌后的根际细菌占比提高，真菌占比下降，放线菌占比显著地先抑后扬。在根围的变化相对较小。45 d即盛花期后，三类微生物结构逐渐恢复趋近原来状态。     

生物杀虫剂组合在有机水稻种植中的作用效果

针对上海市崇明区有机水稻生产过程中病虫害防治效果不佳的问题,在水稻无化肥、无化学农药种植条件下开展了生物杀虫剂对水稻主要害虫稻纵卷叶螟和稻飞虱的田间防控效果评价。在崇明区的2个试验基地,于水稻不同生长时期,以绿僵菌、白僵菌产品分别与病毒杀虫剂MbNPV、植物源杀虫剂苦参碱和细菌杀虫剂Bt组合进行施药处理。结果表明,应用绿僵菌/白僵菌与MbNPV组合,能够有效防治稻纵卷叶螟,在稻纵卷叶螟发生较早的基地,施药后7 d和14 d的防效可达58.2%～81.2%,而在稻纵卷叶螟发生较晚的另一基地,施药后7 d防效可达61.3%和65.6%;绿僵菌/白僵菌与苦参碱组合,可用于防治稻飞虱,7 d和14 d的防效达64.7%～76.1%;绿僵菌/白僵菌与苏云金杆菌组合防治稻纵卷叶螟的14 d防效分别达64.0%和75.4%,优于对稻飞虱的防效;各组合试验结果显示,白僵菌有相对较长的持效作用,且在害虫迁入早期阶段(水稻发育分蘖盛期至拔节期)施用生物农药比在中后期(抽穗期及之后)施用的防效高。可见,生物杀虫剂组合可作为农作物绿色防控的有效手段。     

不同蛋白酶抑制剂对绿僵菌侵染东亚飞蝗的影响

为了揭示不同蛋白酶抑制剂对绿僵菌致病力的影响,明确绿僵菌经消化道侵染东亚飞蝗的作用机制,采用分光光度法测定了经绿僵菌IPPM202及不同蛋白酶抑制剂处理后,不同时间东亚飞蝗中肠总蛋白酶、类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、乙酰胆碱酯酶(Ach E)和谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)活力的动态变化。结果表明,绿僵菌IPPM202处理后10 d内,东亚飞蝗中肠总蛋白酶活性呈现先上升再下降再上升的趋势,类胰蛋白酶活性呈先上升再下降趋势,类胰凝乳蛋白酶活性逐渐上升;但两种解毒酶的变化均为先上升后下降。加入两种抑制剂后,总体上抑制了东亚飞蝗中肠总蛋白酶和两种解毒酶的活性,降低了菌株IPPM202的侵染力,其中,甲苯磺酰基-L-氨基联苯氯甲基酮(tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone,TPCK)作用较对脒苯基甲磺酰氯(4-amidino phenyl methane sulfonyl fluoride,APMSF)更加显著,使各种酶活力降低至与对照无差异水平。本研究对于揭示绿僵菌在中肠的致病机理及寄主对真菌侵染的免疫机制有一定的指导意义。     

金龟子绿僵菌的藻胶颗粒剂型及其促进种群恢复作用

为了保护绿僵菌的存活能力并促进其田间增殖,本试验研究了以海藻胶粒剂型化金龟子绿僵菌的成胶浓度、载体、促活组分、外膜等因素对绿僵菌的存活保护与增殖促进作用。结果确定了适合于金龟子绿僵菌与海藻酸钠、钙离子交联反应的最适条件为海藻酸钠2%、氯化钙0.2~0.3 mol/L;填充4%~10%凹凸棒土支撑颗粒内部胶网,有利于孢子存活和恢复生长;添加0.5%玉米粉或糊精作为促活剂,可使孢子增殖率提高60%;以1.5%海藻酸钠与3.5%聚乙烯醇联合形成的颗粒剂外膜对抵御外界微生物侵袭有一定作用。     

深圳高尔夫球场草坪蛴螬发生及其生物防治效果研究

调查了深圳2个高尔夫球场春季草坪蛴螬发生情况,研究了昆虫病原真菌绿僵茵对球场不同龄期蛴螬的致病性。调查发现,不同草坪样地的虫口密度为0-16只／m^2,对草坪危害不严重,草坪质量为中等偏上;虫口密度与土壤含水量呈显著负相关,虫口密度与土壤温度显著正相关,草坪色泽、根系完整性都与虫口密度呈显著负相关;草坪密度随虫口密度的增加而减小,但二者间的相关性未达到显著水平。从球场采集到主要为害虫为红脚绿丽金龟成虫,经产卵和孵化饲养获得幼虫用于致病性试验,结果表明绿僵菌对各龄期幼虫均有较强致病力,其中对1龄幼虫作用最强。在土壤舍菌量66．7×10^8孢子／kg和33．3×10^8孢子条件下,1龄幼虫分别在6和9d内死亡率达到90％;在土壤含菌量16．7×10^8孢子／kg时,对1、2、3龄幼虫致死中时LT5。分别为7．3,14．3扣18．0d。增效剂能加速绿僵菌对蛴螬的作用。     

绿僵菌菌株遗传多态性与地理来源及寄主种群分化的关联性

采用RAPD-PCR分子标记技术分析了51株不同地理来源、寄主来源的绿僵菌Metarhizium anisopliae菌株的遗传多态性。从94条RAPD引物中筛选出18条引物,对所有试验菌株进行RAPD-PCR扩增,共获得96条扩增片段,其中81条片段表现多态性,占84.1%。聚类分析表明,供试的51株菌株间的相似性系数范围为0.52~0.98,表明菌株间存在丰富的遗传多态性。供试菌株在相似性系数0.7的水平可分为4个组群。按菌株DNA多态性与地理及寄主来源的聚类分析表明,大多数菌株的DNA多态性与地理或寄主有一定的相关性,即长期的地理环境和寄主适应性可能形成了种群的分化。     

分子标记技术在绿僵菌研究中的应用

分子标记技术在真菌研究中被广泛应用，本文就其在昆虫病原真菌绿僵菌的分类、菌株鉴定等方面的研究、应用和存在的问题进行综述，并对其应用前景进行展望。     

蓝光促进绿僵菌产孢和产孢调节基因fluG表达

【目的】明确蓝光照射对绿僵菌产孢的促进作用及与产孢调节基因fluG表达量的关系,为绿僵菌发酵生产提供光照促进产孢的理论依据和技术参数。【方法】以绿僵菌高效杀虫菌株M202为试材,平板接种培养,通过显微观察每隔12 h的菌体发育状态,确定菌株发育进程产孢前期、初始期、旺盛期、平稳期的对应时段。以蓝光6 804—54 432 J?m^-2的8个能量梯度,照射处理在黑暗中培养至不同发育期即24、48、72 h的菌体,继续培养到产孢稳定期后,采用打孔法取样,以显微计数法检测计算产孢量,评估菌体发育阶段对蓝光的敏感性以及蓝光照射能量对产孢量的影响。克隆fluG,建立fluG real-time PCR反应体系;以蓝光6 804—54 432 J?m^-2的8个能量梯度,照射处理发育至48 h即处于产孢前将进入产孢期的菌丝体,照射处理后立即取菌丝,液氮冷冻,提取RNA并反转录成cDNA,通过real-time PCR检测fluG表达量,评估蓝光照射对fluG表达量的影响。【结果】绿僵菌M202菌株发育24 h前为萌发期,24—72 h为菌丝快速生长期,其中48 h还处于产孢前期,60 h已进入产孢初期,72—96 h为产孢盛期,96—120 h为产孢末期,120 h后为孢子成熟期,7—10 d后产量达到稳定。蓝光不同能量照射24 h菌龄即初期菌丝体,其产孢量与无光照处理的对照无显著差异,照射48 h菌龄即菌丝快速生长的产孢前期,其产孢量显著提高,最适照射能量为20 412—40 824 J?m^-2,其中34 020 J?m^-2使产孢量最高达无光照处理对照的1.50倍,72 h菌龄即产孢结构形成、产孢量快速增长期对蓝光最为敏感,低至6 804 J?m^-2的照射能量即可显著提高产孢量,且宽泛的各剂量均有效。对于fluG的表达,在试验照射剂量范围内,48 h菌龄接受蓝光照射后,fluG表达量显著提高,表达量随照射剂量呈先上升后下降的趋势,在20 412 J?m^-2以下较低能量时,fluG表达量与照射剂量成正相关,当照射时间为2.25 h时,表达量达到最高,为无光照处理对照的2.41倍,而在20 412 J?m^-2以上较高能量时,二者呈现负相关,随着蓝光照射时间的增加,基因表达量呈下降趋势;灰色关联度分析显示,当关联因子为0.5时,产孢量与fluG表达量的关联度r值为0.74。【结论】蓝光照射能够促进绿僵菌产孢及fluG表达,不同发育阶段的菌体对蓝光感应有显著差异,在48—72 h菌龄时照射34 020 J?m^-2能量可获得最高产孢量,产孢与fluG之间有较高关联度说明fluG参与绿僵菌产孢的调控。     

绿僵菌防治高尔夫草坪蛴螬试验

金龟子Anomala cupripes幼虫蛴螬是高尔夫草坪的主要地下害虫,直接影响球场草坪质量以及运动性能。深圳市蛴螬危害主要发生在2个时期,春季末期和夏季末期。应用绿僵菌生物农药防治蛴螬,分别进行了小区试验和高尔夫球场大区试验,结果发现,小区试验绿僵菌对蛴螬的杀灭率平均为67.6%,适宜施菌量为2 g/m2;大区试验绿僵菌对蛴螬的杀灭率秋季平均达59.9%。