棉花胞质不育育性恢复候选基因载体构建及其功能初步分析

棉花细胞质雄性不育是研究杂种优势利用和质核互作机理的理想材料。本实验对棉花细胞质雄性不育育性恢复基因ZH46-3437利用pBI121载体构建了过表达载体。同时构建了amiRNA干扰载体即amiR3437,利用病毒诱导基因沉默体系pCLCrV浸染F1植株的子叶。转基因植株的相对荧光定量数据表明,amiR3437的相对表达量上调,而ZH46-3437的相对表达量下调,利用碘-碘化钾染色法鉴定转基因出现半不育性状,表明ZH46-3437基因可能与棉花花粉育性有关。     

水稻转录因子基因SUSIRI的过表达及RNA干扰对水稻分子及表型效应的分析

在克隆到水稻转录因子基因SUSIRI的基础上,构建其过表达及RNA干扰载体进行水稻的遗传转化。由潮霉素筛选及分子检测得到的T0代植株经大田栽植,共有34株过表达及46株RNA干扰植株获得T1代转基因种子。继续种植T1植株收获T2代种子,同时用半定量RT-PCR分析苗期及穗期野生型水稻中SUSIRI基因的时空表达谱并比较过表达及RNA干扰植株的SUSIRI基因在叶片及幼穗中的表达状况,发现过表达植株与野生型对照的基因表达基本相同,但RNA干扰植株的表达受到明显抑制。对过表达及RNA干扰植株稻穗性状考察表明:与野生型对照相比,无论是过表达还是RNA干扰,转基因植株的穗粒数、结实率降低,RNA干扰植株表现得尤为严重(P<0.05),但对水稻谷粒粒重的影响并不显著(P>0.05)。SUSIRI基因的过表达未出现使稻穗性状明显改良的株系,而RNA干扰会导致水稻的结实能力严重降低。     

水稻OsNCED4基因的克隆及功能初探

脱落酸(abscisic acid,ABA)是一种抑制植物生长的植物激素,因能促使叶子脱落而得名,在植物逆胁迫中发挥关键作用。由NCED基因编码的9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED),是ABA在高等植物中的关键酶。本研究已成功从水稻Ilmibyeo(O.sativa L.ssp.japonica)基因组中克隆得到Os NCED4,生物信息学分析表明,Os NCED4基因位于水稻第7号染色体上,ORF全长1749 bp,无内含子结构,编码582个氨基酸,具有NCED家族的RPE65保守结构;以该基因和其启动子序列构建组织表达载体pOsNCED4::GUS、pCaMV35S::OsNCED4:EGFP和RNAi干扰载体p Ca MV35S::OsNCED4:RNAi,用于基因表达和功能分析,并利用农杆菌介导的方法,成功获得了相应遗传载体的转基因植株;GUS染色结果表明,该基因在叶片、叶耳、小穗等组织部位均有表达;RT-PCR结果显示,Os NCED4在水稻不同生育期的根、茎、叶、叶鞘和穗子中均有不同程度的表达,但表达量具有明显的差异;亚细胞定位结果显示,OsNCED4基因编码的蛋白定位于细胞核;与野生型植株相比,RNAi植株的花粉育性无明显差异,而结实率显著下降。该研究结果为进一步研究水稻OsNCED4基因表达的调控,以及为水稻生长发育上的功能研究提供了科学依据。     

棉花GhMADS7基因正调控棉花花瓣发育

MADS-box基因家族作为一类重要的转录因子,主要参与植物花器官的生长发育。GhMADS7/98具有保守的MADS-box及K结构域,属于AG亚家族MIKC~C型MADS-box基因。通过同源序列比对发现,GhMADS7/98与拟南芥AtAG (AT4G18960)基因的蛋白序列具有64%的同源性。组织表达分析表明, GhMADS7基因在花瓣、花药、柱头和胚珠等花器官组织中均有表达。为进一步研究该基因的功能,构建了该基因的RNAi干涉载体并转化棉花,获得了表达量明显下调的转基因株系。表型观察发现,在干涉植株长度为5~6 mm和7~8 mm的花蕾中出现花瓣发育延缓的表型;通过对干涉系转基因植株花瓣进行石蜡切片观察发现,相较于野生型植株,干涉系植株花瓣中的维管束存在明显的收缩现象;通过qRT-PCR检测发现,转基因株系中控制花瓣发育的A、B类基因的表达量出现异常。因此推测GhMADS7在棉花花瓣发育过程中起着重要的作用。     

ZmPti1基因正义和RNAi表达载体的构建及其转化玉米的研究

构建了ZmPti1基因的正义表达载体和RNAi载体,以bar基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将构建的两个表达载体分别转化到玉米自交系178.收获的种子播种于营养钵中,出苗后,经0.1%的草丁膦筛选得到40株草丁膦抗性植株,进一步用PCR鉴定与PCR-Southern检测得到33株转基因植株,其中15株是转化正义表达载体的转基因植株,18株是转化RNAi表达载体的转基因植株.并对转化方法和ZmPti1基因的功能进行了讨论.     

水稻新基因OsCPSF7启动子克隆及其时空表达特性分析

CPSF(cleavage and polyadenylation specificity factor),真核细胞mRNA3'端前体加工中起主导作用的蛋白因子。然而迄今对植物和水稻CPSF家族基因及其表达调控元件的克隆和功能的研究还不多。本研究克隆了水稻中一个未知功能基因OsCPSF7的上游2 330 bp启动子区域,构建植物融合表达载体pOsCPSF7:GUS,并获得了转基因水稻植株。组织化学染色结果表明,OsCPSF7基因启动子具有表达活性,可驱动GUS报告基因,在转基因水稻植株不同发育时期的叶枕、叶舌、茎间、小穗及种子柱头基部、胚和胚乳的连接部位均有强烈的表达。结果表明OsCPSF7基因启动子可能参与调控信号转导、逆境应答以及水稻生长和发育。该研究结果为进一步研究水稻OsCPSF7基因启动子的功能及其相关调控机制奠定了基础。     

转基因棉花再生植株育性影响因素研究

【目的】探究影响农杆菌介导棉花体细胞转化体系产生的再生植株育性的影响因素。【方法】从载体大小、目的基因大小、不同阶段组织培养时间等因素对6个载体的转基因再生植株当代(T₀)育性影响进行分析。【结果】不同载体/目的基因的转基因植株不育率呈现显著差异，但是转基因植株育性与载体大小、目的基因大小之间没有明显关系。进一步研究发现转基因再生植株不育率与胚性愈伤组织分化-植株再生的培养时间呈显著正相关，分化-植株再生培养时间少于110 d、110～130 d、130～150 d、150～170 d、超过170 d的植株不育率分别为19.6%、45.5%、63.8%、72.3%、94.5%；而与诱导愈伤组织形成-胚性愈伤组织分化的持续培养时间没有相关性。【结论】转基因棉花再生植株育性受到胚性愈伤组织持续培养时间的显著影响，缩短胚性愈伤组织到植株再生的培养时间能够提高转基因再生植株的育性。     

水稻OsbHLH116基因简易RNAi载体构建与功能初步分析

水稻OsbHLH116基因属于bHLH家族转录因子。本研究依据简易RNAi技术原理,在OsbHLH116基因编码区选取一段60 bp序列作为干扰目的片段,根据目的片段序列化学合成2条长寡核苷酸链,使其3'端9个碱基互补配对,经退火延伸得到具有反向重复序列的小干扰片段。小干扰片段和载体pTCK303经一次酶切和连接即可得到OsbHLH116-RNAi表达载体。经菌落PCR验证后利用农杆菌介导法转化水稻品种新丰2号,利用GUS染色筛选获得转基因阳性植株。通过qRT-PCR对选取的三组转基因株系中OsbHLH116基因表达量验证,结果显示OsbHLH116基因表达极显著降低,表明OsbHLH116基因简易RNAi载体构建成功并发挥干扰作用。对OsbHLH116基因功能进行初步分析发现,与野生型新丰2号相比,OsbHLH116-RNAi株系种子萌发率显著降低。     

马铃薯StMAPK4响应低温胁迫的功能解析

马铃薯易受低温危害,造成减产。MAPK基因广泛参与多种环境胁迫,研究发现其参与低温调控。为探究马铃薯StMAPK4在响应低温胁迫过程中的功能,本研究以马铃薯栽培品种‘Atlantic’为试验材料,分析其在低温(4℃)胁迫下不同时间点在马铃薯根茎叶中的表达特性,并对StMAPK4基因进行生物信息学分析及对其编码的蛋白进行亚细胞定位分析,构建StMAPK4的过表达和RNAi干扰表达载体,转化马铃薯获得转基因植株,并分析了在4℃处理下非转基因(NT)、过表达和RNAi干扰表达转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量的变化。结果显示,StMAPK4蛋白的等电点为4.97,属于酸性蛋白,该蛋白定位于细胞核和细胞膜;低温胁迫下,StMAPK4在根茎叶中的表达量显著升高;StMAPK4过表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显升高,而MDA含量明显降低;StMAPK4干扰表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显降低,而MDA含量明显升高;通过表型观察发现,非转基因和RNAi干扰表达植株的叶片萎蔫严重,而过表达植株的叶片受影响较小。因此,过表达StMAPK4基因可以增强马铃薯植株对低温胁迫的耐受性。     

菊花DgLsL基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

培育少侧枝的标准切花菊品种具有重要的实际意义。本研究利用RNAi的方法抑制菊花侧枝发育相关基因DgLsL基因的表达,以期得到侧枝生长受抑制的转基因植株。从切花菊‘神马’基因组DNA中克隆侧枝发育相关基因DgLsL基因,经过测序分析,将一个413bp长的保守片段连接到植物表达载体pBI121和pFGC5941,构建植物RNAi载体pBI121-R2,并运用农杆菌介导法将其导入切花菊‘神马’。结果:PCR得到的DgLsL基因片段测序后与GenBank上的DgLsL基因比对,DNA序列一致性为99.4%;构建的RNAi表达载体经过PCR和酶切证实外源基因的正确插入;转化后得到了18株抗性植株,PCR结果显示,12株抗性植株为阳性。本试验通过将DgLsL基因干扰片段导入切花菊,获得了转基因植株,以此为基础可进一步选育少侧枝的切花菊品种。     

水稻BZIP类转录因子在逆境胁迫下的作用

BZIP类转录因子在植物的逆境胁迫下起着重要作用。本研究构建水稻转录因子OsBZIP88过量表达载体pHB-Osbzip88和干涉载体RNAi-Osbzip88,通过遗传转化获得转基因植株,并对转基因植株在逆境胁迫下的表型鉴定。结果表明,过表达转基因植株抗胁迫能力高于野生型和干涉转基因植株。对OsBZIP88定量表达实验表明:OsBZIP88在水稻各组织中均有不同程度表达,且在叶片中表达量最高。本研究初步探明水稻转录因子OsBZIP88在水稻逆境胁迫应答中具有重要的作用,过量表达转录因子OsBZIP88能够增强水稻的抗逆能力。研究结果为进一步了解BZIP类家族基因和挖掘水稻抗逆基因提供了一定的依据。     

植物RNA干涉载体的构建及其在水稻基因表达沉默中的应用

为了方便利用RNA干涉（RNA interference，RNAi）研究植物基因的功能，本研究构建了2个用于RNAi的植物转化载体pRNAi-35S和pRNAi-Ubi。这两个载体以pCAMBIA双元载体为骨架，含有2个多克隆位点区进行目的基因片段的正向和反向克隆，并分别由CAMV35S启动子和玉米泛素基因启动子控制发夹结构RNA的产生。为了验证该载体的有效性，用PCR扩增了1个水稻转录因子（Arabidopsis AP2／EREBP同源基因）基因片段组装入pRNAi—Ubi，转化水稻获得转化体。在所检测的7株转化株中，5株的内源目标基因的mRNA被降低至RNAblot检测不到的水平。这些结果说明本研究构建的RNAi载体对基因表达沉默是有效的。     

OsMYB调控化感水稻酚酸类物质合成及其抑草作用

基因表达调控是水稻化感作用形成的重要基础。本研究对化感水稻PI312777(Oryza sativa L.)的Os MYB(CT829537)基因分别进行过表达(overexpression,OE)和RNA干扰(RNAi),再与稗草(Echinochloa crusgalli,BYG)共培养,以野生型PI312777为对照。结果发现,与稗草共培养下CT829537-OEPI312777的酚类代谢关键酶基因表达上调,根系及其水培液中的总酚酸浓度增加,抑草能力增强;相同处理下CT829537-RNAi PI312777则相反,其酚类代谢关键酶基因较野生型植株表达下调,总酚酸浓度降低,抑草能力下降。这表明Os MYB(CT829537)通过调节化感水稻的酚酸类物质合成进而影响其抑草能力。     

水稻品种生殖生长期耐冷性及其低温胁迫下MADS-box基因表达差异分析

选用来自中国不同稻作生态的4个特殊常规水稻品种:辐恢838(普通籼稻)、月亮谷(云南高海拔籼稻)、C418(普通粳稻)和丽粳11号(云南高寒粳稻),于减数分裂期和开花期分别低温(16℃)处理5d后又恢复5d,研究低温下生殖生长期的冷胁迫效应(花粉育性,结实率,百粒重下降程度)及相关MADS-box基因差异表达情况。结果表明:四个品种生殖生长期耐冷性由低到高排列依次是:辐恢838相似文献   

AT-hook基因及其在植物开花调控中的研究进展

AT-hook基因是能够编码与双链DNA小沟中富含AT碱基的序列特异性结合的一类基因,其所编码的蛋白含有以甘氨酸-精氨酸-脯氨酸(GRP)三个氨基酸残基为中心的DNA结合蛋白基序。笔者通过对AT-hook基因的特点和功能及其在拟南芥及水稻等高等植物开花中的调控作用综述。AT-hook基因不仅参与植物的生长发育及逆境胁迫与激素信号应答,同时在花器官的形成以及植物开花中也起着重要的调控作用。该基因在花器官组织中的表达量最高,影响成花素基因的表达,且其编码蛋白能够通过改变染色质状态或招募蛋白复合体在表观水平上调控植物开花相关基因的转录,从而影响植物开花。该基因可能为植物开花的表观遗传调控提供了新的途径。     

同源四倍体水稻与假稻杂交结籽的胚胎学机理研究

利用激光扫描共聚焦显微技术对同源四倍体水稻与假稻杂交结籽的特殊生殖现象进行了研究.研究结果表明,假稻的花粉粒不能在二倍体水稻的柱头上萌发,因而二倍体水稻与假稻的生殖隔离很严格.然而,假稻的花粉粒在同源四倍体水稻的柱头上能萌发,前者的花粉管能在后者的花柱中伸长并能将雄配子送入胚囊内.在同源四倍体水稻与假稻的     

花粉特异性核糖核酸酶基因诱导籼稻雄性不育及其遗传研究

以水稻愈伤组织和悬浮细胞系作为基因枪转化的外植体,把水稻花粉特异性基因PS1启动子与barnase构成的嵌合基因导入籼稻,获得籼稻五个品种Basmati 1、青油占、胜优2号,明恢63,新山占29的转基因植株.试验以两个质粒PS1- barnase和pILTAB227共转化的方法,以潮霉素B作为筛选因子,选择抗性愈伤及再生植株.获得的barnase转基因植株的育性比未转化的对照明显降低,表现为部分不育和完全不育.除barnase阳性转化株平均株高比对照有所降低外,营养器官发育正常,雌性可育.完全不育的植株花粉粒畸形,不能被I-KI溶液染色,但它们与正常植株杂交能够获得杂交种子.转基因植株的Sonthern杂交分析表明,bamase基因普遍为多拷贝整合.对转基因植株白交及与非转化株测交后代以点杂交分析bamase转基因的遗传行为,发现转基因的遗传符合1～3个插入位点的孟德尔遗传模式.