洋葱orf393基因线粒体定位表达载体构建及功能初探

通过转基因拟南芥表型分析对洋葱线粒体差异表达基因orf393的功能进行了初步研究。通过In-Fusion Cloning的方法,将基因orf393与编码线粒体定位的靶向肽序列Rf1b5'融合,构建了orf393基因的线粒体定位表达载体pROK2-Rf1b5'-orf393,通过花序浸染法成功转化至野生型拟南芥,获得了雄性育性降低的拟南芥转基因植株,转基因植株的雄蕊花丝变短,柱头表面光滑几乎没有花粉附着,花药颜色暗淡无法正常开裂,种荚短小皱缩、结实率低。亚历山大染色实验结果显示,转基因植株的花药中花粉量少,仅含有极少量的活性花粉。初步证明线粒体基因orf393与细胞质雄性不育有一定关系,为明确orf393参与洋葱细胞质雄性不育的分子机制提供了参考。     

棉花过表达超氧化物歧化酶基因对植株耐盐性的影响

为了探讨棉花过表达SOD基因的遗传效应,利用Gen Bank数据库中棉花胞质SOD基因的核酸序列,设计1对特异引物,克隆了棉花胞质Cu/Zn-SOD基因,构建了植物双元表达载体;采用农杆菌介导的子叶腋芽遗传转化新技术,获得了过量表达的转基因棉花植株。利用PCR扩增报告基因和Southern Blotting证明目标基因已经整合到棉花基因组上;转基因材料T1种子的耐盐性发芽试验表明,在NaCl胁迫下,与对照(非转基因)相比,转基因材料主根平均长度、芽平均长度和侧根平均数量均大于阴性对照,转基因植株与阴性对照相比,转基因植株叶片的MDA含量明显降低,叶绿素总量增加,脯氨酸含量略降低,SOD活性明显提高;转基因植株荧光定量PCR扩增证实目标基因在转基因材料中呈现组成性表达。在棉花中过量表达胞质Cu/Zn-SOD基因,能增加植株SOD活性,减轻盐分胁迫造成的细胞膜质过氧化,增强植株抵御盐分胁迫的能力。     

转基因棉花再生植株育性影响因素研究

【目的】探究影响农杆菌介导棉花体细胞转化体系产生的再生植株育性的影响因素。【方法】从载体大小、目的基因大小、不同阶段组织培养时间等因素对6个载体的转基因再生植株当代(T₀)育性影响进行分析。【结果】不同载体/目的基因的转基因植株不育率呈现显著差异，但是转基因植株育性与载体大小、目的基因大小之间没有明显关系。进一步研究发现转基因再生植株不育率与胚性愈伤组织分化-植株再生的培养时间呈显著正相关，分化-植株再生培养时间少于110 d、110～130 d、130～150 d、150～170 d、超过170 d的植株不育率分别为19.6%、45.5%、63.8%、72.3%、94.5%；而与诱导愈伤组织形成-胚性愈伤组织分化的持续培养时间没有相关性。【结论】转基因棉花再生植株育性受到胚性愈伤组织持续培养时间的显著影响，缩短胚性愈伤组织到植株再生的培养时间能够提高转基因再生植株的育性。     

南瓜韧皮部特异性启动子在转基因棉花中的表达

以自行构建的重组南瓜韧皮部特异启动子dENP构建了植物表达载体pBII2.利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA44O4介导转化棉花(Gossypium hirsutum L.)品种珂字312,共获得转pBII2和对照pBI121的抗卡那霉素棉花再生植株243株,筛选出172株为转基因阳性植株.Southern blot分析确证外源Gus基因插入拷贝数在1个或2个以上.对这些转基因棉花植株进行Gus染色结果表明dENP和CaMV35S启动子一样均能驱动Gus基因的表达,前者仅在棉花的韧皮部内特异表达,而CaMV35S启动子驱动的Gus基因为组成性表达.Gus酶活力测定结果进一步表明dENP和CaMV35S启动子驱动Gus基因表达水平相当,但是转pBII2棉花植株的Gus富集在韧皮部组织.证明了dENP启动子驱动的外源基因在棉花中具有韧皮部特异而高效表达的特征,从而可用于棉花抗病、抗蚜虫转基因研究.     

棉花细胞质雄性不育育性恢复基因的定位及分子标记辅助育种研究进展

棉花细胞质雄性不育系统在实现棉花杂交种子大规模生产和培育高产、优质、抗逆等棉花新品种中具有重要的应用价值,而恢复系的好坏对细胞质雄性不育系杂交种的选育的利用起着举足轻重的作用。因此,培育优良恢复系至关重要。主要介绍了棉花细胞质雄性不育系、恢复系的类型,综述了棉花细胞质雄性不育育性恢复基因的遗传方式和遗传定位研究进展,讨论了恢复基因的精细定位和分子标记鉴定在分子标记辅助育种中的意义和应用前景,并针对目前存在的问题提出相应对策。     

水稻育性调控相关基因RNAi载体的构建及其表型鉴定

利用RNAi干扰技术研究不同基因对花粉发育、卵细胞发育和合子胚发育的影响是一种重要的手段。本研究通过筛选水稻在生殖发育过程中的9个重要调控基因,构建基因的RNAi表达载体,分析转基因植株育性及相关性状表型,以期探明RNAi表达载体对靶标性状的干扰效应。其中,AT61~AT63、AT64~AT66、AT67~AT69表达载体分别靶标花粉育性、卵细胞发育以及合子胚发育的调控。结果表明,除RNAi表达载体AT64没有获得转基因植株外,其余8个RNAi表达载体均获得了转基因植株;对T0代转基因植株的花粉育性、结实率以及潮霉素筛选(40 mg/L)发芽率检测的统计结果显示,RNAi表达载体AT62(花粉发育调控)、AT65(卵细胞发育调控)和AT67(合子胚发育调控)的干扰效应较强。本研究结果将为创制新型水稻基因工程不育系提供策略和选择。     

中国科学家阐明Boro II型水稻细胞质雄性不育和育性恢复的分子机理

自从20世纪70年代中国成功实现杂交水稻三系配套以来,不少学者致力于水稻细胞质雄性不育及育性恢复的机理研究。近年来,国内外科学家已定位和克隆了控制细胞质雄性不育和育性恢复的基因。2006年华南农业大学刘耀光研究组在《ThePlantCell》上发表论文揭示:BoroII型水稻细胞质雄性不育由线粒体编码的细胞毒素肽引起,两个含PPR蛋白基因中的任何一个均可破坏或降解细胞毒素肽使植株育性恢复,从而在分子水平解释了BoroII型水稻细胞质雄性不育及育性恢复性的机理。这是中国科学家对植物细胞质雄性不育及育性恢复研究的最新贡献。     

一对等位基因互作控制的核雄性不育性

通过遗传工程能够产生由两个基因共同作用而形成的雄性不育。一个可以是能够导致雄性不育的基因,另一个可以是该雄性不育基因的活化基因,它们共同存在的时候表现雄性不育。利用位点特异性重组和转基因技术能够将这两个基因安排在植物同源染色体的相同位置上表达,成为等位基因,而获得分别只具有其中一个基因的两转基因系。它们之间杂交,F1中两个基因同时存在,F1产生雄性不育而成为不育系。常规品系与此F1不育系杂交,在杂种植株中,这两个基因不能同时存在,所有植株育性恢复。利用光温敏核不育性,化学杀雄和人工去雄可解决此不育系繁殖问题。该雄性不育性利用方式优越,育种简便易行,能够满足对最佳组合选育的要求,且能够定向培育目标杂交组合。     

中国科学家阐明BoroⅡ型水稻细胞质雄性不育和育性恢复的分子机理

自从20世纪70年代中国成功实现杂交水稻三系配套以来，不少学者致力于水稻细胞质雄性不育及育性恢复的机理研究。近年来，国内外科学家已定位和克隆了控制细胞质雄性不育和育性恢复的基因。2006年华南农业大学刘耀光研究组在《The Plant Cell》上发表论文揭示：BoroⅡ型水稻细胞质雄性不育由线粒体编码的细胞毒素肽引起，两个含PPR蛋白基因中的任何一个均可破坏或降解细胞毒素肽使植株育性恢复，从而在分子水平解释了BoroⅡ型水稻细胞质雄性不育及育性恢复性的机理。这是中国科学家对植物细胞质雄性不育及育性恢复研究的最新贡献。     

棉花FAD2-1基因的RNAi载体构建及高油酸新种质的获得

【目的】在棉花纤维产量和品质不受影响的前提下,创造高油酸、低亚油酸棉花新种质。【方法】棉花FAD2-1基因是催化单不饱和脂肪酸的油酸形成多不饱和脂肪酸的亚油酸的关键基因,采用信息分析学方法分析其蛋白质性质、结构、功能;克隆GhFAD2-1的保守片段381 bp,构建RNA干涉载体,采用农杆菌介导的下胚轴侵染方法将干涉载体转入棉花。利用气相色谱-质谱联用仪(Gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)测定转基因T_2～T_4植株种子的脂肪酸成分及含量。对T_4转基因株系进行拷贝数鉴定、目的基因表达量检测、农艺性状及纤维品质考察。【结果】成功构建GhFAD2-1的RNA干涉载体并转入棉花,转基因株系目的基因GhFAD2-1的表达量显著低于对照,具有高油酸、低亚油酸的表型并且能稳定遗传给后代;转基因株系可将棉花种子油酸提高224.1%,将亚油酸降低237.5%。与对照材料相比,转基因株系的农艺性状、纤维品质没有明显差异。【结论】验证了棉花GhFAD2-1基因的功能并且为培育高油酸棉花品种提供了帮助。     

Construction of RNAi Vector of Cotton (Gossypium hirsutum L.) FAD2-1 Gene and Acquisition of New High Oleic Acid Germplasm

[Objective] Here, the aim was to create a new cotton (Gossypium hirsutum L.) germplasm with high oleic acid and low linoleic acid contents without affecting the fiber yield and quality. [Method] The fatty acid desaturation 2-1 (FAD2-1) gene catalyzes the formation of polyunsaturated linoleic acid from monounsaturated fatty acid in cotton. The protein’s properties, structure and functions were analyzed using the information analysis method. A conserved 381-bp fragment of GhFAD2-1 was cloned to construct an RNA interference vector, which was transformed into cotton by Agrobacterium-mediated hypocotyl infection. The fatty acid compositions and contents of T₂―T₄ transgenic plants were determined using gas chromatography-mass spectrometry. The T₄ transgenic lines were used to investigate the copy number, target gene expression, agronomic traits, and fiber quality. [Results] The RNA interference vector of GhFAD2-1 was successfully constructed and transformed into cotton. The target gene’s expression level was significantly lower in transgenic plants than in controls. The transgenic plants had high oleic acid and low linoleic acid contents, which could be stably inherited by the offspring. The oleic acid contents of transgenic cotton seeds increased by 224.1%, and the linoleic acid content decreased by 237.5%, compared with the control seeds. There were no significant differences in the agronomic traits and fiber quality of the transgenic lines compared with the control. [Conclusion] These results verified the function of GhFAD2-1 in cotton and provide a basis for breeding cotton varieties with high oleic acid contents.     

棉花HSP70基因植物表达载体的构建及转化烟草的研究

为研究棉花HSP70 基因在转基因植物中抗旱效果,利用前期克隆的GhHSP70 基因,以pCAMBIA1304 质粒为植物表达载体,构建了GhHSP70 基因的植物表达载体CAMBIA1304-HSP70;采用冻融法转入根癌农杆菌EHA105 菌株,通过叶盘法对模式植物烟草进行遗传转化研究。结果表明,在潮霉素(50 mg/L)选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经过PCR方法以及GUS基因组织化学法检测鉴定转基因烟草,其中有5 株为阳性植株。初步证实了GhHSP70 基因已导入烟草基因组中。为进一步研究该基因的功能提供实验基础,同时为后续转化棉花改善其抗旱能力奠定基础。     

棉花arf1启动子驱动Cry1A基因在烟草中特异性表达研究

在新一代Bt作物以及Bt作物安全性研究方面, Bt毒蛋白在植物特定发育阶段的表达特性渐受关注。本研究构建了植物表达载体pGBI121.A1Bt, 其携带棉花arf1启动子驱动Cry1A基因的表达盒, 启动子后面有一个Ω序列; 对照载体pGBI121.4AB携带P2E35S启动子(增强子加倍的修饰CaMV 35S启动子)驱动Cry1A基因的表达盒, 在启动子后面也有一个Ω序列。利用根癌农杆菌介导法, 将植物表达载体pGBI121.4AB和pGBI121.A1Bt转化烟草, 分别获得44株和42株转基因烟草再生植株。ELISA检测表明, 在pGBI121.A1Bt转基因烟草的蒴果、蒴果壳、花瓣和叶中Cry1A基因的平均表达水平分别为pGBI121.4AB的1.5、1.5、1.4和0.3倍。棉花arf1启动子在烟草中表达, 证明了该启动子在植物生殖器官中具有优势表达特性, 为arf1启动子应用于转基因抗虫棉, 在棉花蕾铃中优势表达Bt毒蛋白, 提高转基因棉花蕾铃抗虫性的新一代抗虫棉研究提供了依据。     

棉花GhCCR4基因的瞬时表达研究

利用棉纤维发育调控基因瞬时表达体系,分析目的基因在棉花纤维发育过程中可能存在的功能。实验构建了由CaMV35S启动子驱动的pGUS-CCR4融合瞬时表达载体,使用基因枪轰击法转化棉花胚珠,确定了转化0DPA胚珠的最佳条件:轰击压力为1350psi,轰击距离为9cm,轰击次数为2次。GUS组织化学染色结果表明,GhCCR4基因在棉花纤维伸长期和次生壁增厚期持续表达。不同发育时期纤维长度测量结果发现,在8DPA时转GhCCR4基因纤维长度和对照相比没有明显差别,但在27DPA时纤维长度明显短于对照。纤维透射电镜切片观察发现,转GhCCR4基因的细胞次生壁与对照相比增厚达17%。     

棉花转录因子GhSNAC3启动子的克隆与表达分析

为研究棉花NAC转录因子基因GhSNAC3启动子的结构和功能,以鲁棉研32号基因组为模板,用PCR扩增的方法得到棉花基因GhSNAC3的启动子序列,利用分析网站PlantCARE、PLACER和BDGP对启动子上存在的顺式作用元件进行了预测与分析,在此基础上利用该启动子及GhSNAC3基因构建植物表达载体,并通过烟草遗传转化进一步研究启动子的转录活性。结果表明GhSNAC3启动子除含有CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有茉莉酸、赤霉素和脱落酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件。采用不同胁迫处理转基因烟草并进行表达分析,结果显示GhSNAC3在盐胁迫下植株根部有高水平的表达,而在茎和叶中表达量极低,表明GhSNAC3在逆境胁迫应答过程中可能具有重要功能,其启动子是一个盐诱导型启动子,具有组织特异性。研究结果为棉花NAC信号通路研究和耐盐基因工程改良提供了理论依据。     

生长素响应报告基因转化棉花及GUS检测

通过构建以GUS为报告基因的生长素响应表达载体的遗传转化,开展了棉花生长素的原位研究。经棉花叶片瞬时表达分析,证实该报告基因在棉花中有效。采用农杆菌子房注射法将该报告基因转化至湘杂棉21号后,经筛选检测,获得了3株阳性转基因棉花植株。对转基因棉花胚珠及花原基进行的GUS检测表明在棉花受粉前2 d(-2 DAP,Dayafter pollination)至受粉后2 d(2 DAP)的胚珠发育期间,棉花胚珠表面生长素水平呈现"V"形变化过程,且在受粉2 DAP后,GUS染色更集中分布在分化了的纤维细胞中。说明在棉花受粉前的胚珠发育早期,表层细胞中含有较高浓度水平的生长素,维持着表层细胞的持续分裂。而在胚珠表层纤维细胞分化期生长素浓度降低,GUS着色变浅。受精后,纤维细胞开始伸长突起,伸长的纤维细胞中有更强的GUS着色,证明分化了的纤维细胞中具有较高浓度的生长素分布,这可以促进纤维细胞的伸长生长。胚珠表层相邻细胞的低水平的生长素对棉花纤维细胞的分化突起可能起关键作用。对花原基的GUS染色观察,生长素主要集中分布在分化的花组织细胞分裂活跃的区域,表明生长素在促进花器官的发育和器官建成方面有重要作用。     

转Cry1A基因海岛棉的获得和鉴定

进行农杆菌介导转抗虫基因试验，以期选育抗虫性优良的海岛棉新品系(品种)；本实验在海岛棉体细胞胚再生体系的基础上，将携带Cry1A基因的表达载体pBI121通过农杆菌介导法转化到‘新海33号’的胚性愈伤组织中。经培养基筛选、PCR检测、RT-PCR检测、抗虫性鉴定等筛选抗虫后代。经培养基筛选共获得12棵抗性植株。PCR检测结果显示，这12棵抗性植株均能扩增出了大小相符的片段，检测结果呈阳性；RT-PCR结果显示，12棵转基因植株目的基因已经整合入基因组，且能反转录出mRNA；Bt-Cry1Ab/Ac转基因试纸条检测结果表明这12棵转基因植株含有目的蛋白；抗虫性鉴定结果证实了这些转基因植株对棉铃虫幼虫具有一定的抗性。本研究成功将抗虫基因导入至海岛棉的体内，获得了具有抗虫性的植株，其结果对转基因抗虫海岛棉新品种的培育具有一定的参考价值。     

转棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因烟草的获得及其功能的初步验证

构建了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因的植物表达载体,利用农杆菌介导法将其导入NC89烟草,PCR、Southern blotting检测结果显示有4个烟草株系中整合了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因,SOD酶活性测定结果显示4株转基因烟草植株SOD酶活性都明显高于非转基因烟草,离体叶片暗处理试验结果也证明四株转基因烟草比非转基因烟草SOD酶活下降速度明显减慢,百草枯喷施试验表明,转基因烟草都比非转基因烟草对百草枯的耐性增强,这一系列试验间接地说明外源基因的导入增强了烟草的耐衰老能力,本研究为今后利用SOD基因研究作物的早衰性状奠定了基础.