E.tenella河北株重组IL-2-EtMIC-2 DNA疫苗的构建及保护力分析

为了构建E.tenella河北株重组IL-2-EtMIC-2DNA疫苗,并确定其抗球虫效力。采用RT-PCR方法分别克隆出鸡IL-2和E.tenella河北株EtMIC-2基因,并连接到pMD18-T载体上进行测序;将目的基因克隆到pcDNA3.0载体,构建重组质粒pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2,并转染293T细胞,用Western blot方法验证表达。将构建的重组IL-2-EtMIC-2DNA疫苗以50,100,150μg/只的剂量分别在14,21日龄胸肌注射免疫试验鸡,除阴性对照组外,28日龄时经口灌服孢子化E.tenella卵囊4×10~4个,研究其对E.tenella感染后的免疫保护效果。结果表明:成功构建了重组质粒pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2,且能在293T细胞中表达出融合蛋白;3个免疫组的ACI比阳性对照组分别提高了97.63%,127.02%和129.81%,其中免疫剂量为100,150μg时,ACI均达160以上,具有良好的免疫保护效果。     

HB株E.tenella AMA-1基因的克隆及免疫调节型真核表达载体构建

为研究HB株柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)AMA-1基因的免疫原性,根据GenBank收录的AMA-1基因序列设计了1对引物,对HB株E.tenella的AMA-1基因进行克隆,应用生物信息学分析软件预测AMA-1基因的核苷酸及编码的蛋白质的结构和功能。连接pPIC9载体,并与细胞因子IL-2串联,构建真核表达载体pPIC9-IL-2-AMA-1,转化毕赤酵母细胞GS115,进行蛋白表达及纯化验证。结果显示,HB株E.tenella AMA-1基因全长为1 617 bp,编码535个氨基酸,具有跨膜区及信号肽。经酶切和测序鉴定表明,真核表达载体pPIC9-IL-2-AMA-1构建成功。毕赤酵母转化结果表明,成功将重组载体转化到毕赤酵母中,PCR鉴定得到2 200,2 100 bp 2条带。Western blot检测结果表明AMA-1在毕赤酵母中得到了很好的表达。本试验结果为AMA-1基因的功能和核酸疫苗的研制提供依据。     

E.tenella河北株SO7基因在毕赤酵母系统中的表达及免疫保护力评价

为了确定重组质粒pPIC9-IL-2-SO7在毕赤酵母系统中的表达及重组蛋白SO7的免疫保护力,采用RT-PCR方法克隆E.tenella河北株SO7基因并测序,将目的基因与IL-2及真核表达载体pPIC9串联,构建真核表达载体pPIC9-IL-2-SO7,转染毕赤酵母细胞GS115,SDS-PAGE电泳及Western blot方法验证其在毕赤酵母系统中的表达。将纯化后的重组蛋白SO7分别在雏鸡7,21日龄以50,100,150μg/只进行免疫,28日龄时,除阴性对照组外的其他试验组口服接种E.tenella孢子化卵囊8×10~4个/只,测定各组存活率、相对增重率、盲肠病变值和卵囊值,并计算抗球虫指数(ACI)。结果显示,阳性重组子具有2条带,分别为2 200,1 100 bp,表明成功将重组质粒pPIC9-IL-2-SO7转染毕赤酵母细胞GS115,Western blot检测证明表达的蛋白具有免疫原性;3个免疫组的ACI分别比阳性对照组提高了29.66%,33.33%和19.72%,其中以免疫剂量为100μg/只时,抗球虫效果最好。     

山羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建及表达

从重组克隆栽体pMD18-P32中扩增出山羊痘病毒P32基因,与毕赤酵母分泌性表达载体pPICgK相连接,构建重组表达载体pPIC9K-P32.重组质粒pPIC9K-P32用SaIⅠ线性化后,与毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115混合后电转化,使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组.采用G418抗性梯度筛选法得到高拷贝重组菌株,甲醇诱导目的基因表达.SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,用酵母成功表达出了31 000的重组蛋白,该蛋白具有生物学活性,能被山羊痘阳性血清识别.     

鼠层粘蛋白α5链G结构域E3和E8基因在毕赤酵母中的表达

为探索层粘连蛋白G结构域在甲醇型酵母（Pichia Yeast）中的表达，用PCR的方法获得了鼠层粘蛋白α5链G结构域的E3（LG4-5）和E8（LG1-3）基因片段，并将其克隆到P．pastoris分泌型表达载体pPIC9中，构建了pPIC9-E3和pPIC9-E8等2个毕赤酵母重组质粒。将测序正确的质粒用电转化的方法转化酵母表达受体菌GS115。通过表型和PCR的方法筛选出P.pastoris重组子。用甲醇诱导表达后．进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果表明，鼠层粘蛋白α5链G结构域的E3和E8片段在毕赤酵母中获得了成功的表达。     

鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC-2基因真核表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

根据GenBank发表EtMIC-2序列设计1对特异性引物,通过PCR技术扩增EtMIC-2基因,将该基因与真核表达载体pVAX1连接,构建了重组真核表达载体pVAX1-EtMIC-2,并用脂质体介导法将其转染Hela细胞。然后通过间接免疫荧光（IFA）、SDS-PAGE和Western-blot分析检测EtMIC-2蛋白在转染细胞中的表达情况。经测序和序列分析,成功扩增获得了EtMIC-2基因,并成功构建了重组真核表达载体pVAX1-EtMIC-2,Western-blot和IFA表明EtMIC-2蛋白在Hela细胞中得到表达。该结果为柔嫩艾美耳球虫核酸疫苗的研究奠定基础。     

猪髓样分化因子88在毕赤酵母中的表达和纯化

为了在毕赤酵母中表达猪髓样分化因子88因子．我们采用RT—PCR从猪肠系膜淋巴结组织中扩增MyD88全基因,并将其克隆到T载体中,测序验证。将目的基因编码序列插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组质粒,并转化毕赤酵母。重组酵母以PCR验证,表达的重组蛋白用HisTrapTMHP柱纯化后用SDS—PAGE进行分析。结果：构建了重组表达质粒pPIC9K—pMyD88,诱导表达蛋白经纯化后SDS—PAGE分析显示,在相对分子质量（M）约34kD处出现1条特异性蛋白带．说明MyD88在毕赤酵母中获得表达。     

鸡抗病毒Mx蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

为了利用酵母表达技术制备鸡抗病毒Mx蛋白,试验采用基因工程技术,将编码鸡抗病毒Mx蛋白基因亚克隆至含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-Mx;用电转化法将线性化的pPIC9K-Mx转化至毕赤酵母菌株GS115中,G418梯度筛选转化菌;再经MM与MD平板对比生长试验筛选,PCR鉴定目的片段,筛选出高拷贝重组子,该高拷贝菌株分别经0.5%、1%甲醇诱导,表达产物再经SDS-PAGE检测。结果表明:成功构建了鸡抗病毒Mx蛋白基因的毕赤酵母表达载体,经G418抗性筛选得到高拷贝菌株;在甲醇含量维持在1%时,鸡抗病毒Mx蛋白在毕赤酵母GS115中获得良好表达,表达产物大小约为75ku;表达蛋白约占表达上清液的39.2%。     

禽传染性支气管炎病毒M基因在毕赤酵母中表达与蛋白反应活性检测

将禽传染性支气管炎病毒(IBV)M基因克隆到毕赤巴斯德表达载体pPIC9K中,构建了重组表达载体pPIC9K-M,电击转化毕赤巴斯德酵母GS115,经MD和MM平板筛选和PCR鉴定后,采用G418抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株GS115/pPIC9K-M His~+Mut~+,重组菌株用1%的甲醇诱导分泌表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析.结果表明,IBV M基因在毕赤酵母中成功获得了表达,表达蛋白的相对分子质量约为33 000,能与IBV阳性血清特异性结合.将表达蛋白初步纯化后作为包被抗原,ELISA检测结果显示表达蛋白与特异性抗体反应良好,表明表达的M蛋白生物学活性良好.本研究表达的IBV M蛋白可作为制备IB诊断抗原的基础材料,对IB的防治有重要理论和实用价值.     

J亚群禽白血病病毒gp85基因在毕赤酵母中的分泌表达

为获得J亚群禽白血病病毒gp85蛋白,将gp85基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,构建了pPIC9K-gp85表达载体。将鉴定正确的表达载体经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,经MD及G418抗性平板筛选后挑取阳性克隆进行PCR鉴定,获得重组酵母菌株GS115/pPIC9K-gp85。对阳性重组菌进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE、Western blotting和Dot-ELISA分析,结果表明,gp85基因在毕赤酵母中获得分泌表达,表达产物与J亚群禽白血病病毒多克隆抗体有良好的反应活性,分泌表达量达40 mg/L。本研究为J亚群禽白血病病毒诊断方法的建立及gp85蛋白的深入研究奠定了基础。     

土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR技术从土耳其斯坦东毕吸虫（Orientobilharzia turkestanicum）成虫总RNA中扩增磷酸丙糖异构酶基因（TPI），鉴定后将目的片段与毕赤酵母表达载体pPIC9k连接，构建重组表达质粒pPIC9k-TPI，并将其电击转化到毕赤酵母GS115中，重组菌株经甲醇诱导后表达的TPI蛋白，经SDS-PAGE、Western-blotting检测，并利用葡聚糖凝胶层析柱纯化。结果显示，成功地克隆了土耳其斯坦东毕吸虫TPI；重组毕赤酵母表达了分子质量为43ku的TPI蛋白；葡聚糖凝胶层析过滤得到单一的TPI蛋白。     

猪带绦虫TS018基因真核表达载体的构建及其表达

采用PCR从重组克隆载体pGEM—TSO18中扩增出猪带绦虫六钩蚴TSO18基因，与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9k相连接，构建重组表达载体pPIC9k—TSO18，转化大肠埃希氏菌JM109，经测序证实，基因序列完全正确。制备重组质粒pPIC9k—TSO18，用SalⅠ线性化，并电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合。采用G418抗性梯度法筛选得到高拷贝重组菌株，以甲醇进行诱导表达，SDS—PAGE和Western-blotting分析结果表明，诱导表达的培养上清中表达出具有反应活性的16ku重组蛋白，目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的80％以上，诱导72h目的蛋白表达量为0．5mg／mL。     

牛病毒性腹泻病毒E2基因在毕赤酵母GS115中的表达与鉴定

将牛病毒性腹泻病毒(BVDV)河北分离株HB-bd毒株E2基因去除跨膜区获得sE2基因,将sE2基因克隆入巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中,筛选培养后提取阳性重组质粒,经酶切和PCR鉴定,命名为pPIC9K-sE2.重组质粒pPIC9K-sE2经Sal Ⅰ酶切线性化,电穿孔导入P.Pastoris GS115基因进行整合,使外源基因sE2稳定地整合到P.Pastoris染色体中,G418筛选得到阳性高拷贝转化子GS115-pPIC9K-sE2.经甲醇诱导表达后,sE2融合蛋白获得了表达,表达产物经SDS-PAGE、Western-blot和Dot-ELISA分析,确定其表达的sE2融合蛋白相对分子质量大小为37 000,且具有天然蛋白的抗原特异性.免疫原性研究证明P.Pastoris表达的sE2蛋白能刺激动物产生特异抗体.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆及其在毕赤酵母中表达

用RT-PCR扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重庆分离株C14-2的ORF7基因(384 bp),构建克隆质粒pMD19-T-ORF7,经EcoR Ⅰ /Not Ⅰ双酶切回收ORF7基因插入酵母表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-ORF7,进行PCR鉴定和双酶切鉴定.鉴定的pPIC9K-ORF7经Sac Ⅰ线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,筛选获得阳性重组菌GS115(pPIC9K-ORF7),再经G-418/YPD筛选获得高拷贝重组菌,重组子经表型鉴定为Mut.重组菌GS115(pPIC9K-ORF7)经甲醇诱导表达,在96 h表达的N蛋白量最大,N蛋白经SDS-PAGE鉴定大小约为15 000;Western blot表明N蛋白能与美洲型PRRSV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应活性.本研究为开展PRRSV ORF7基因在毕赤酵母中表达及应用奠定基础.     

柔嫩艾美耳球虫真核起始因子3d基因的酵母表达分析

在毕赤酵母真核表达系统中表达柔嫩艾美耳球虫真核起始因子3d(Emeria tenella eukaryotic initiation factor 3d,EteIF3d)基因,并获得具有天然构象的活性蛋白。将EteIF3d基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,将构建正确的重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选,获得含重组质粒的酵母表达细胞。在含1%甲醇的BMMY培养基中诱导培养,收集1~3 d的表达上清。表达产物进行SDS-PAGE检测,并用Western blot进行免疫学分析。结果表明,本研究成功构建了重组质粒pPIC9k-EteIF3d,并成功表达该蛋白,且该蛋白能与兔抗EteIF3d血清特异性结合,具有良好的抗原性。EteIF3d基因可在真核表达系统毕赤酵母中表达,且获得蛋白具有抗原性,从而为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。     

奶牛SRY基因HMG box酵母表达载体构建与表达

研究从牛血中提取总RNA,设计特异性引物,利用RT-PCR技术扩增出SRY基因HMGbox基因片段,将该片段与pMD18-T载体连接并转化到E.coliTop10中,提取质粒并用EcoRⅠ、AvrⅡ酶消化,将消化后的目的基因纯化并回收,与经同样酶消化并纯化回收的载体pPIC9K连接再转化到E.coliTop10,获得重组表达质粒pPIC9K-SRYHMGbox,筛选出阳性酵母表达载体pPIC9K-SRY-HMGbox在酵母菌中诱导表达。结果表明:成功构建了pPIC9K-SRY-HMGbox酵母表达载体,并获得了奶牛SRY基因HMGbox酵母表达蛋白,为进一步利用SRY基因HMGbox酵母体外表达蛋白最终实现性别控制奠定了基础。     

猪带绦虫未知基因SLC10在毕赤酵母中的表达

SLC10是以反式剪切引导序列为基础,通过RT-PCR从猪囊尾蚴中克隆到的一个未知基因。将猪囊尾蚴SLC10基因从重组克隆载体pGEM-SLC10扩增并酶切后,与相应酶切处理的毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-SLC10,转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切和测序鉴定,基因序列完全正确。纯化的重组质粒pPIC9K—SLC10用内切酶Sac I线性化,电转化毕赤酵母,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合;采用G418抗性梯度法筛选多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达;通过SDS-PAGE和Western—blot分析表达产物,结果表明目的蛋白得到了表达,但不具有免疫反应性。     

牛病毒性腹泻病毒E2基因在毕赤酵母GS115中的表达与鉴定

将牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea-mucosal disease virus,BVDV)河北分离株HB-bd毒株E2基因去除跨膜区获得sE2基因,将sE2基因克隆入巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中,筛选培养后提取阳性重组质粒,经酶切和PCR鉴定,命名为pPIC9K-sE2。重组质粒pPIC9K-sE2经SalⅠ酶切后,电穿孔导入P.pastorisGS115基因进行整合,使外源基因sE2稳定地整合到P.pastoris染色体中,G418筛选得到阳性高拷贝转化子GS115-pPIC9K-sE2。经甲醇诱导表达后,sE2融合蛋白获得了表达,表达产物经SDS-PAGE、Western-blot和Dot-ELISA分析,确定其表达的sE2融合蛋白相对分子质量大小为37 000,且具有天然蛋白的抗原特异性。免疫活性研究证明,P.pastoris表达的sE2蛋白能刺激动物产生抗体。     

猪IL-2基因真核表达载体的构建及在酵母中的表达

用真核表达引物从pGEM-IL-2重组质粒中扩增出猪IL-2基因，将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E．coli的JM109中，得到了猪pPIC9K-IL-2重组表达质粒。通过电激法将经SalⅠ酶切线性化的pPIC9K-IL-2质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中，利用甲醇诱导表达，经SDS-PAGE电泳分析，表明在摇床水平及发酵罐中均表达出约17ku大小的分泌性目的蛋白，采用Sephadex G-100分子筛层析对其表达产物进行纯化，纯化结果理想。     

番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC基因在甲醇酵母中的表达

将番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC基因插入到酵母表达载体pPIC9K内,转化大肠杆菌TG1,挑取阳性克隆,获得酵母表达重组质粒pPIC9K-σC。用DraⅠ酶切线性化重组表达质粒pPIC9K-σC和对照质粒pPIC9K,电转化至甲醇酵母GS115感受态细胞内,经G418抗性筛选和PCR鉴定,获得了2株pPIC9K-σC酵母阳性整合子和2株pPIC9K空载体对照酵母阳性整合子。分别挑取1株进行甲醇诱导表达,SDS-PAGE检测发现pPIC9K-σC酵母整合子在不同时段的诱导表达上清液中均有可见的目的蛋白条带,分子质量与预计大小相符,而对照pPIC9K酵母整合子的诱导表达上清液中没有相应的蛋白条带。说明番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC基因真核甲醇酵母表达体系构建成功,目的σC蛋白在酵母中能够有效地分泌表达。