猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒多重PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank上已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)的基因序列,设计了3对特异性引物,扩增PCV2、PRV、PPV,建立了同时检测PCV2、PRV、PPV的多重PCR方法。所扩增特异性产物片段大小分别为350、191、270 bp。该方法特异性强、敏感性高,可以用于猪圆环病、猪伪狂犬病、猪细小病的实验室诊断和流行病学调查。     

猪圆环病毒2型和3型双重PCR检测方法的建立

猪圆环病毒3型(PCV3)是一种新的猪圆环病毒,与猪皮炎和肾病综合征、母猪繁殖障碍及心脏和多系统炎症相关。为了建立一种同时快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)和PCV3的双重PCR方法,根据GenBank收录的PCV2和PCV3基因序列,分别在PCV2 Cap基因和PCV3 Rep基因高度同源保守区设计并筛选2对特异性引物,经过双重PCR反应条件的优化,建立了同时检测PCV2/3的双重PCR检测方法。本方法可同时扩增出PCV2、PCV3的486,270bp特异性片段,而扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)等病原核酸结果均为阴性;PCV2/3最低检出量分别为139,21.7拷贝/μL。经临床应用表明,本试验建立的双重PCR方法简便、快速,敏感度高,特异性强,为PCV2/3的鉴别诊断和联合检测提供了依据。     

猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒多重PCR检测方法的建立

摘要:本研究根据GenBank上已发表的猪圆环病毒2型（PCV2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）的基因序列,设计了3对特异性引物,扩增PCV2、PRV、PPV,建立了同时检测PCV2、PRV、PPV的多重PCR方法。所扩增特异性产物片段大小分别为350、191、270 bp。该方法特异性强、敏感性高,可以用于猪圆环病、猪伪狂犬病、猪细小病的实验室诊断和流行病学调查。     

多重PCR方法用于检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒诊断方法的建立

本文建立了一种能够同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的多重PCR方法（mPCR）。借助于Oligo6.0引物设计软件,设计了4对引物分别用于扩增PCV2ORF2基因353bp片段、PPVNS-1基因271bp片段、PRRSVMN基因美洲型434bp片段、PRVgB基因194bp片段。通过人为混合以上4种病毒进行特异性及敏感性试验,结果表明,该方法具有很好的特异性和敏感性。对猪瘟病毒、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;该mPCR方法对PPV的最低检测量为8.64×10-3μg,PRV的最低检测量为2.36×10-3μg,PRRSV的最低检测量为3.68×10-3μg,PCV2的最低检测量为2.90×10-4μg。该方法的建立对临床上PCV2、PPV、PRV、PRRSV的鉴别诊断以及以上这4种病毒的流行病学调查具有十分重要的意义。     

多重PCR快速检测猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型方法的建立

根据GenBank上猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）的已知序列,利用Primer Premier 5.0及DNAstar软件对上述病毒基因保守区进行引物设计,选出扩增序列为PRV gB基因373 bp、PCV2 ORF2基因430 bp两对引物。在优化单项PCR反应条件基础上,建立了PRV-PCV2两重PCR检测方法。敏感性及特异性试验结果显示,该mPCR对2种病毒的核酸检测可至1.47×10-6~1.62×10-6 ng,而对灭菌双蒸水、猪细小病毒（PPV）猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）多重PCR的扩增结果均为阴性,作为临床上猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型感染的病原学快速诊断方法具有可行性。     

猪伪狂犬病病毒和猪博卡病毒混合感染的检测

为了检测猪伪狂犬病病毒和猪博卡病毒混合感染的情况,研究建立了快速,简便,灵敏度高,特异性强的鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪博卡病毒(PBoV)的双重检测方法。针对PRV gE基因和PBoV NS1基因的序列,分别设计了2对特异性引物,通过对引物浓度、模板加入量、退火温度等的优化,建立了快速鉴别PRV和PBoV的双重PCR检测方法,并进行了特异性和敏感性试验。特异性试验表明,该方法可以扩增出PRV gE长度为316 bp和PBoV NS1长度为996 bp的目的片段,对大肠杆菌、猪圆环病毒Ⅱ型、猪捷申病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无扩增;敏感性试验表明,PRV、PBoV的最低核酸检出量分别为6.44×10~2拷贝和9.51×10~3拷贝,与单一PCR敏感性相同。应用该方法对49份送检病料样品进行检测,其中PRV和PBoV的单纯感染检出率分别为34.69%和14.28%,混合感染检出率为8.16%,与单一PCR检测结果符合率为93.88%。     

猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型TaqMan-MGB双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

参照GenBank中猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因以及猪圆环病毒2型(PCV2)中ORF2特异性序列,设计特异引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件,建立了同时检测PRV野毒株和猪圆环病毒(PCV2)的双重荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果表明,该方法检测PRV和PCV2灵敏度分别可达2.23×101、4.5×102拷贝/μL,均比常规PCR检测方法高100倍;同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、均为阴性,无交叉反应;对30份疑似病料进行检测并与普通PCR进行比较,结果显示,二者检测PRV的总符合率为96.67%,检测PCV2的总符合率为93.33%。本试验建立的TaqMan-MGB双重荧光定量PCR检测方法可同时对PRV野毒株和PCV2进行早期快速诊断,可应用于病原学监测,流行病学调查等。     

猪圆环病毒多重PCR诊断方法的建立

根据GenBank中20株猪圆环病毒（PCV2）核苷酸序列设计两对引物，建立的检测猪圆环病毒的多重PCR方法，其中引物P1、P2为PCV特异性，扩增938bp片段。P3、P4为PCV2特异性扩增490bp，因此本方法不仅可以扩增PCV片段，还可以同时区分PCV1和PCV2。该方法具有良好的特异性和敏感性，为猪圆环病毒的临床诊断与流行病学调查等研究奠定了基础。     

猪伪狂犬病毒和猪细小病毒双重PCR方法的建立及初步应用

目的本研究旨在建立一种适用于临床样品和动物源性生物制品中猪伪狂犬病毒和猪细小病毒同时检测的双重PCR技术。方法针对猪伪狂犬病毒(PRV)的gE基因和猪细小病毒(PPV)的VP2基因的保守区域分别设计引物。结果经条件优化后,所建立的双重PCR方法能特异性地检测出样品中的PRV(581bp)和PPV(202bp)。结论本方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性,适用于临床样品中对PRV和PPV的同时检测,也可用于猪源性生物制品的检测。     

猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型 (porcine circovirus type 2,PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV 的VP2、PRV的 gD、和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了3种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV 313 bp、 PRV 217 bp和PCV2 447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明两者的符合率为100％,表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这3种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用建立的多重PCR检测方法,检出PPV阳性42份,阳性率为19.91%;PRV阳性26份,阳性率为12.32%;PCV2阳性56份,阳性率为26.54%;2种以上病毒混合感染25份,混合感染阳性率为11.85%。检测结果表明,山西省猪群已感染这3种疫病。     

Association of porcine circovirus 2 with porcine respiratory disease complex

A retrospective study was performed on natural cases of porcine respiratory disease complex (PRDC) to determine the association and prevalence of PRDC with porcine circovirus 2 (PCV2) and other co-existing pathogens in Korea. Histologically, alveolar septa were markedly thickened by infiltrates of mononuclear cells. Moderate to marked multifocal peribronchial and peribronchiolar fibrosis were present and often extended into the airway lamina propria. Among the 105 pigs with PRDC, 85 were positive for PCV2, 66 were positive for porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), 60 were positive for porcine parvovirus (PPV), and 14 were positive for swine influenza virus (SIV). There were 80 co-infections and 25 single infections. A co-infection of PCV2 with another additional bacterial pathogen is frequently diagnosed in PRDC. The combination of PCV2 and Pasteurella multocida (38 cases) was most prevalent followed by PCV2 and Mycoplasma hyopneumoniae (33 cases). The consistent presence of PCV2, but lower prevalence of other viral and bacterial pathogens in all pigs examined with PRDC, has led us to speculate that PCV2 plays an important role in PRDC.     

Cultivation of a porcine adenovirus in porcine thyroid cell cultures

The porcine adenovirus type 4 was adapted to grow in porcine thyroid cell cultures. A readily recognizable cytopathic effect appeared in these cells as soon as the first passage of the virus and complete degeneration of the monolayers was obtained after only 72 hours post-infection at the fourth passage. A viral yield of 10(6.0) TCID50/ml was calculated after the third passage. The virus was purified by CsCl density gradient centrifugation and was shown to possess a buoyant density of 1.33 g/ml. A specific antiserum was prepared from two specific-pathogen-free piglets and used for indirect immunofluorescent staining. The fluorescence was observed in the nucleus of infected cells at 24 to 72 hours post-inoculation. The use of TP cells is suggested for routine porcine adenovirus diagnosis.     

Pseudorabies virus, porcine parvovirus, and porcine enterovirus interactions with the zona pellucida of the porcine embryo

Porcine embryos (n = 93) were incubated on cell monolayers that had been previously inoculated with pseudorabies virus, porcine parvovirus (PPV), or each of 2 porcine enteroviruses. After 2, 24, or 48 hours of incubation, the embryos were fixed in glutaraldehyde and examined by electron microscopic procedures. It was found that pseudorabies virus adsorbed to the zona pellucida (ZP) and entered sperm tracks in the ZP. The PPV and both enteroviruses entered pores in the ZP and were associated with sperm that were at or near the outer surface of the ZP. In addition, PPV was seen enmeshed in cellular debris on the outer surface of the ZP. Evidence of a productive viral infection of the blastomeres of the embryos was not found.     

一例猪细小病毒病的诊断

从取自某猪场表现初产母猪流产胎儿的肾脏、脾脏、肠系膜淋巴结组织,进行研磨后接种猪原代肾细胞,成功分离到一株病毒。该病毒的豚鼠红细胞血凝活性为27,用针对猪细小病毒结构蛋白VP2的特异性引物对分离病毒进行扩增,将扩增结果进行克隆测序,结果经BLAST分析后,证实分离到一株猪细小病毒。     

猪伪狂犬病的诊断

本文通过荧光抗体组织切片、细胞接种、兔子致病性等方法对临床怀疑为猪伪狂犬病的病猪进行了实验室诊断。结果如下:病猪脾脏和淋巴结制备的冰冻切片经PRV荧光抗体染色后,在荧光显微镜下见到特异性荧光;病料经处理后接种Vero细胞可致细胞圆缩和形成合胞体,具有疱疹病毒的培养特征;将病料上清和细胞培养毒分别皮下接种家兔均可引起奇痒、麻痹死亡,呈现典型的伪狂犬病临床特征,同时病死兔脏器的PRV免疫荧光试验也为阳性。根据上述结果证实了该病为猪伪狂犬病。     

猪MSTN基因敲除载体的构建及细胞筛选

构建猪肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因的打靶载体并获得敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞.以Puro为正筛选基因,白喉毒素-A(DT-A)为负筛选基因.将同源长臂和同源短臂分别插入Puro基因的两侧.同源长短臂分别为4 294 bp和1 015 bp,定点敲除MSTN基因的部分内含子2和部分外显子3.采用FugeneHD 转染法将打靶载体转入37 d的猪胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用嘌呤霉素筛选.结果显示,成功构建了对猪MSTN基因部分区域进行敲除的打靶载体,共得到48个具有药物抗性的细胞克隆,经PCR检测,获得2个正确同源重组的细胞克隆.