SARS-CoV S蛋白抗原表位富集区的表达与初步应用

扩增并克隆编码SARS-CoV S蛋白中包含多个抗原表位的第539～630氨基酸残基区域的基因片段。基因片段经酶切处理后插入表达载体pGEX-6p-1的BamHⅠ和XhoⅠ位点之间,构建成融合表达质粒,转化宿主菌BL21经IPTG诱导后融合基因得到了表达,表达产物可用谷胱甘肽sepharose 4B RediPack亲和层析柱纯化。用5份SARS患者康复期血清对表达融合蛋白进行ELISA和免疫印迹试验,分析融合蛋白的免疫反应性,结果表明重组融合抗原在ELISA和免疫印迹试验中与5份SARS患者康复期血清均具有良好的免疫反应性。试验结果提示该SARS-CoV S蛋白第539～630氨基酸残基区域可作为SARS的诊断抗原。     

双点突变对猪链球菌2型溶血素活性的影响

猪链球菌2型作为一种人兽共患病病原,日益受到关注。而溶血素是其分泌的外毒素,是公认的重要毒力因子之一,具有良好的免疫原性。本试验通过PCR方法获得猪链球菌2型野生型溶血素基因sly和463、464双点突变的溶血素突变体基因slym。将sly和slym克隆至表达载体,构建了2个重组载体并在大肠杆菌中表达了野生型溶血素rSLY和突变型溶血素rSLYm。经过蛋白杂交试验,证明表达的rSLY和rSLYm与提取的猪链球菌的天然野生型SLY分子量完全一致。以提取的野生型SLY为对照,通过溶血试验证明,突变型溶血素rSLYm失去了溶血活性;通过接种PK15、RK13、SUVEC细胞单层,证明突变型溶血素rSLYm失去细胞毒性;通过小鼠试验,证明突变型SLYm对小鼠没有毒力。本试验通过溶血试验、细胞接种和小鼠实验,证明双点突变灭活了野生型溶血素的溶血活性、细胞毒性和小鼠毒力。该溶血素突变体经免疫实验证实后,可作为猪链球菌2型亚单位疫苗的候选抗原。     

出血性大肠杆菌O157∶H7的Tir与Hly融合基因的构建和表达

构建表达Tir和Hly的融合基因,将Tir基因的C端414个氨基酸残基(Tir414)基因部分与Hly基因的C端300个氨基酸残基(Hly300)基因部分串联构建pET28a-Tir414-Hly300重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达.薄层扫描分析表明,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30%左右.由于该融合蛋白由Tir和Hly2部分抗原组成,可刺激机体产生针对转位紧密素受体(Tir)和溶血素(Hly)的抗体,在EHEC O157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值.     

出血性大肠杆菌O157：H7的Tir与Hly融合基因的构建和表达

构建表达Tir和Hly的融合基因,将Tir基因的C端414个氨基酸残基（Tir414）基因部分与Hly基因的C端300个氨基酸残基（Hly300）基因部分串联构建pET28a-Tir414-Hly300重组质粒,将其转化于BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达。薄层扫描分析表明,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30%左右。由于该融合蛋白由Tir和Hly2部分抗原组成,可刺激机体产生针对转位紧密素受体（Tir）和溶血素（Hly）的抗体,在EHECO157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。     

胸膜肺炎放线杆菌三聚体自转运黏附素功能区的表达及黏附活性

试验对三聚体自转运黏附素(TAAs)的重要功能区第1 703～2 018氨基酸残基区域进行原核表达,并利用激光共聚焦显微镜观察重组蛋白在猪肺上皮细胞的结合部位,通过黏附抑制试验研究该蛋白的生物活性.结果显示,扩增的adh4基因片段与GenBank中相应的基因序列的同源性达100%,表达得到相对分子质量约为31 000的Adh4蛋白,该蛋白能够黏附在猪肺上皮细胞膜表面.猪肺上皮细胞经Adh4蛋白处理后,降低了APP对它的黏附能力,同时Adh4抗体可以抑制该菌对细胞的黏附,黏附菌数与其稀释度呈负相关.结果表明,Adh4蛋白可以介导APP对猪肺上皮细胞的黏附作用,进一步证明了位于N端1703～2018氨基酸残基区域是三聚体自转运黏附素蛋白的功能区,为研究胸膜肺炎放线杆菌的黏附机制奠定了基础.     

芽孢杆菌CY1—3株碱性纤维素酶基因celC的克隆及其在大肠杆菌中的表达

芽孢杆菌CY1-3株基因组DNA经Sau3A Ⅰ部分消化后回收2～7 kb片段,构建了部分文库.通过刚果红染色鉴定,筛选出6个纤维素酶基因的阳性克隆子,经酶切鉴定为同一克隆子,命名为pGJc-1.经测序分析,该片段包含一个由1 593个核苷酸组成的开放阅读框（ORF）,命名为celC.经推导,celC基因编码由一531个氨基酸残基组成的CelC蛋白.氨基酸序列分析表明,CelC蛋白的氨基酸序列与多种细菌的β-1,4-内切葡聚糖酶具有很高的同源性.粗酶液的SDSPAGE分析表明,celC基因在大肠杆菌中所表达的CelC蛋白具有纤维素酶活力,其分子质量约为58 ku.     

信号肽对溶血素在大肠杆菌中跨膜转运的影响

信号肽在引导外源蛋白的跨膜转运过程中具有重要作用。本试验通过PCR方法获得带有信号肽序列和不带有信号肽序列的溶血素基因,构建表达载体在大肠杆菌中进行诱导表达。经过溶血试验和免疫印迹试验证明缺失了信号肽的重组溶血素不能被跨膜转运至细胞外;带有信号肽的重组溶血素能够跨膜转运大肠杆菌细胞外。本试验为猪链球菌2型基因缺失弱毒疫苗的研究、细菌信号肽以及基因工程重组蛋白的可溶性表达进行了有益探索。     

Asial型口蹄疫病毒VP2蛋白B细胞线性表位的鉴定

为了对Asial型口蹄疫病毒VP2蛋白进行抗原表位作图,设计了7个相互重叠15个氨基酸、覆盖整个VP2蛋白的重叠短肽,经克隆并在大肠杆菌中实现了融合表达.用Asial型口蹄疫感染血清对7个融合蛋白进行免疫印迹分析,结果初步鉴定出VP2蛋白B细胞线性抗原表位位于氨基末端的第1-44氨基酸区域,并且证实O型、A型、C型口蹄疫标准血清和感染SAT2型口蹄疫康复期的牛血清也能识别融合蛋白F1(1-44 aa).在此基础上,针对F1(1-44 aa)短肽,设计了6个相互重叠5个氨基酸的短肽片段,进一步鉴定出了VP2蛋白B细胞线性表位位于氨基末端的第6-15氨基酸区域.     

温和气单胞菌RC-07-KA株溶血素基因克隆、表达及活性检测

为研究温和气单胞菌(A.sobria)溶血素基因的特性,本研究根据GenBank登录的气单胞菌属溶血素基因序列设计一对引物,经PCR扩增得到大小约1.5kb的A.sobria RC-07-KA株溶血基因片段,将该片段克隆到pGEM-T载体,测序结果显示:溶血素基因片段大小为1 467 bp,编码487个氨基酸残基,遗传进化分析结果表明该基因与气单胞菌属中的A.hydrophila菌株Sb (AY611033)、NLEPA-1607 (AF410466)、AEF (HM853019),A.sobria菌株357 (AY157998)、人源分离株(EF620533)和A.salmonicida菌株17-2 (X65048)的溶血素基因亲缘关系较近,同源性大于95％,而与其他菌株的同源性较低.通过构建溶血素重组表达质粒pET-HIy,诱导表达并通过western blot鉴定表达蛋白,结果显示重组菌能高效表达重组溶血素,而且纯化的重组溶血素具有溶解鲤鱼红细胞的活性.为该菌进一步深入研究奠定了基础.     

Ⅰ型与Ⅱ型IBDV前体多聚蛋白B细胞抗原表位的预测与比较

用生物信息学方法比较了GenBank中9株Ⅰ型IBDV与2株Ⅱ型IBDV基因片段A前体多聚蛋白的推导氨基酸(aa)序列,预测并分析了上述两型IBDV毒株前体多聚蛋白的线性B细胞抗原表位.结果表明,两型IBDV毒株的前体多聚蛋白有75个aa残基的差异,其上大多数预测B细胞抗原表位的位置及其指数值均无明显差异;但两型IBDV在第3～10位中的aa残基差异影响了该序列肽的预测指数和结构,以及与Ⅰ型IBDV多抗的反应性.     

猪链球菌荧光DNA扩增片段长度多态性检测方法的建立

利用荧光标记技术,采用2对引物初步建立检测猪链球菌荧光DNA扩增片段长度多态性方法,结果表明12株猪链球菌扩增的多态性位点数从51～98条不等,该方法能够检测猪链球菌的多态性,区分不同血清型以及同一血清型不同特性的菌株,可用于菌株鉴定及流行病学研究中细菌源的追踪。     

临床健康猪群猪链球菌2型带菌率流行情况调查

为了解钦州市临床健康猪群中猪链球菌2型的流行情况,采用PCR方法对采集的病料进行检测分析。374份样品的PCR检测结果显示,链球菌、猪链球菌、猪链球菌2型的带菌率分别为81.8%、48.9%、2.9%,表明钦州市健康猪中猪链球菌带菌率高,但猪链球菌2型带菌率较低。     

湖南省猪链球菌的分离与鉴定

从病猪脏器病料中通过细菌培养、生化试验分离鉴定出了121株猪链球菌.经PCR技术鉴定马链球菌兽疫亚种28株,占23.1%,猪链球菌24株,占19.8% ,其中猪链球菌2型4株,占3.3%,猪链球菌9型2株,占1.7%,猪链球菌1型和7型都没检测到,证实省内除了猪链球菌2型外,也存在其他血清型的猪链球菌.     

猪链球菌2型溶血素B细胞表位预测

目的预测猪链球菌2型(SS2)溶血素(SLY)B细胞表位。方法以DNAstar分析为主,综合分析二级结构、亲水性、表面可及性及抗原性指数,辅以吴玉章氨基酸抗原指数计算方法进行SS2溶血素B细胞表位预测。结果推测最有可能的B细胞表位位于溶血素N端第74～85、231～244区域位。结论应用多参数预测SS2溶血素的特征,为表位疫苗的研制奠定了基础。     

猪链球菌2型毒力因子研究进展

猪链球茵(SS)病是一种严重危害养猪业的人畜共患病,呈世界性分布.根据荚膜抗原特性的不同,猪链球茵被分为35个血清型(1/2型,1型～34型),其中以猪链球菌2型(SS2)流行最广,毒力最强.SS2主要的毒力因子有溶菌酶释放蛋白、胞外蛋白因子、荚膜抗原、溶血素等.然而,新近发现的一些与SS2致病性相关的基因序列和蛋白片段已经成为当前研究的重点和热点.在基因水平上的新发现主要有orf2毒力因子、89 kb毒力岛、转录调节因子、氨基酸通透酶、ABC转运子及表面锚定蛋白基因、反应调节因子RevS基因、纤连蛋白结合蛋白基因、编码噬茵体的基因序列Ssl和分泌性核酸酶SsnA基因等.蛋白水平上的新发现主要有脂磷壁酸的D-丙氨酰位点、自溶素、精氨酸脱亚氨酸酶系统、浑浊因子,38,45,39,44 ku蛋白,以及一些蛋白酶和纤维蛋白溶血酶原受体等.     

猪链球菌精氨酸脱亚氨酸酶序列分析及其PCR检测

对9株猪链球菌2型重庆分离株的精氨酸脱亚氨酸酶基因进行克隆测序,结果表明该基因长度为1231bp,与Genbank发表的该基因序列相比,核苷酸同源性高于99%,推导的氨基酸同源性高于96%。根据精氨酸脱亚氨酸酶基因的测序结果建立扩增片段长度为237bp的PCR检测方法,35株猪链球菌致病株中,30株精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阳性,有5株精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阴性;14株正常猪扁桃体分离株中,11株为精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阳性,3株为精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阴性;猪链球菌1型、7型、9型、13型、1/2型各一株,均能扩增出精氨酸脱亚氨酸酶基因的片段。     

致病性猪链球菌2型的病原分离鉴定及毒力因子的PCR检测

通过对广西某猪场急性死亡的猪进行病原分离,分离到革兰氏阳性球菌,用链球菌快速鉴定试剂条Rapid ID 32 Strep鉴定为猪链球菌2型;并对分离菌进行猪链球菌2型荚膜多糖抗原（cps2J）及其重要毒力因子溶菌酶释放蛋白（MRP）、细胞外蛋白因子（EF）和溶血素（SLY）的多重PCR检测,同时对cps2J基因进行序列测定,与GenBank发表的猪链球菌2型相比,同源性为98.8%,毒力因子MRP、EF和SLY检测均为阳性,证实广西某猪场急性死亡的猪为高毒力猪链球菌2型感染所致。动物试验中,该菌可引起小白鼠部分死亡,家兔体温最高升至40.3℃,最后败血而死。     

猪链球菌PCR检测技术研究进展

猪链球菌是猪的一种重要病原菌,并且也会引起人的链球菌病。有35个荚膜血清型(1/21、~34),通常自发病或死亡猪体分离获得1,2,7,9型和14型菌株,其中2型是毒力最强的血清型。根据已知猪链球菌16 SrRNA及溶血素(sly)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、荚膜多糖(cps)、胞壁蛋白或溶菌酶释放相关蛋白(mrp)、胞外因子(epf)编码基因序列设计特异性引物,建立猪链球菌群和1(14),2(1/2),7型和9型特异性PCR或多重PCR,建立2型致病性菌株和1型高致病性菌株毒力鉴定PCR或多重PCR,用于检测和鉴别临床病料和细菌分离物中的猪链球菌,具有高敏感性和高特异性,与其他致病菌及其他血清的猪链球菌型无交叉反应,为疫病诊断及流行病学的研究提供了快速、简便和有用的工具。     

河南省猪链球菌的分离鉴定及耐药性分析

为探讨河南省猪链球菌的血清型分布和耐药性情况，本试验对2016年5月~2017年5月从河南省猪场采集的各种组织病料进行猪链球菌的分离培养、生化鉴定及PCR鉴定，并进行了血清群的分群鉴定和血清型的分型鉴定，对其中的2型猪链球菌进行了药敏试验。结果显示，试验共鉴定出189株猪链球菌，流行的猪链球菌的血清群主要以D群为主，其次是G群和C群；优势的血清型是2型、7型、9型和1型。其中87株为2型猪链球菌，超过90%的2型菌株对β-内酰胺类（青霉素G、阿莫西林和头孢菌素类）、氯霉素、万古霉素、环丙沙星敏感，超过40%的2型菌株对多西环素、四环素、红霉素、复方新诺明、丁胺卡那霉素、克林霉素、链霉素、米诺环素产生耐药性。以上结果为指导猪场使用敏感药物及时控制疫情、选择血清型相符的疫苗进行预防及减少损失提供参考依据。