水稻抗白叶枯病分子育种的研究进展

白叶枯病是水稻主要病害之一。水稻白叶枯病分子育种包括白叶枯病抗性基因定位、克隆,白叶枯病抗生分子标记辅助选择,抗白叶枯病基因工程育种和白叶枯病抗性基因资源创新与改良。目前已发现和鉴定抗白叶病基因22个,其中Xa1、Xa21基因已图位克隆。随着Xa1-xa24(t)基因等分子生物学研究的深入开展,水稻白叶枯病分子育种也开始实现基因资源的定向操作和育种应用。     

Xa21全生育期表达载体的构建

利用PCR技术,以水稻品种明恢63基因组DNA与携Xa21完整基因组片段的载体pDBXa21作为模板,分别克隆了RSuS1启动子（RSP）、Xa21的开放阅读框至终止子的片段,并构建了RSP驱动水稻广谱抗白叶枯病基因Xa21的转基因表达载体。实时荧光定量PCR技术证实,水稻蔗糖合酶基因1（rice sucrose synthase gene 1,RSuS1）在水稻种子中低表达,在叶鞘与叶中全生育期高效表达。     

6个已克隆水稻白叶枯病抗性基因及其作用机理(综述)

水稻白叶枯病由Xanthomonas oryzae pv.oryzae( Xoo)致病菌引起,导致水稻减产甚至绝收.到目前为止,已有30多个白叶枯病抗性基因被发现,其中仅有Xa1,Xa21,Xa23,X3/Xa26,Xa27,xa5和xa13等基因被克隆.文章概述了其中6个(除Xa23)已克隆抗病基因的结构、表达产物及其作用机理的研究进展,指出该方面研究存在的问题,分析了原因.     

水稻抗白叶枯病基因在物理图谱上的锚定

到目前为止,经国际注册确认和期刊报道的水稻白叶枯病抗性基因共35个。已被定位的抗性基因有26个,即第1染色体上有2个,Xa29(t)和xa34(t);第3染色体上有Xa11;第4染色体上有6个,Xa1、Xa2、Xa12、Xa14、Xa25(t)、Xa31(t);第5染色体上有xa5;第6染色体上有3个,Xa7、Xa27(t)、xa33(t);第7染色体上有xa8;第8染色体上有xa13;第11染色体上有9个,Xa3/Xa26、Xa4、Xa10、Xa21、Xa22(t)、Xa23、Xa30(t)、Xa32(t)、Xa36(t);第12染色体上有2个,xa25、xa32(t)。Xa1、xa5、xa13、Xa21、Xa23、xa25、Xa26、Xa27已成功克隆。文中利用GRAMENE网站公布的抗白叶枯病基因的分子标记,在日本晴的测序图谱Gramene Annotated Nipponbare Sequence 2009上进行物理图谱锚定,将已定位的26个抗白叶枯病基因锚定在其物理图谱的26个位点上,为抗白叶枯病基因的基因克隆、分子标记辅助选择奠定了基础。     

水稻抗白叶枯病基因的鉴定、定位和克隆

综述了水稻抗白叶枯病抗性基因的鉴定、定位和克隆的历史及其进展。到目前为止,已鉴定出的抗性基因编号达到Xa29（t）,定位到染色体上的基因有19个,已克隆出的基因有5个。并讨论了合理利用抗性基因防治白叶枯病及其前景。     

利用克隆的Xa21基因培育抗白叶枯病杂交稻

控制白叶枯病最经济最有效的方法是将抗性基因渗入水稻栽培品种。抗病基因的克隆,特别是广谱抗白叶枯病基因Xa21的克隆,开辟了通过转化改良水稻对白叶枯病的抗性的新领域。利用农杆菌介导的转化系统,成功地将克隆的Xa2l基因转入我国8个水稻品种,并配制出转基因杂交稻。田间试验显示转基因杂交稻     

水稻白叶枯病的研究进展

本文阐述了水稻白叶枯病的研究进展情况水稻对白叶枯病的抗性可以根据发生机制、作用方式、抗病性遗传特点、表达的生育期等进行分类;目前,鉴定并已命名的水稻抗白叶枯病基因有Xa1～Xa26等24个,而且已经克隆三个抗白叶枯病基因即Xa21、Xa1和Xa26;利用水稻抗白叶枯病基因时不仅要考虑质量性状和数量性状的遗传,而且要考虑到抗病的持久性,可以聚合不同的抗病基因、搭配使用多个抗病品系,也可以利用持久抗病基因.     

水稻SLR1基因的克隆及其植物表达载体的构建

[目的]为研究水稻中的SLR1蛋白的功能及寻找与其相互作用的GA信号转导蛋白奠定基础。[方法]以水稻品种日本晴基因组DNA为模板,根据水稻SLR1基因cDNA序列设计1对特异引物进行PCR扩增,回收PCR产物连接到pGEMT载体中,经筛选得到水稻SLR1基因的克隆pGEMTSLR。最后采用酚仿抽提和乙醇沉淀的方法构建水稻SLR1基因的正义和反义表达载体。[结果]通过PCR扩增获得了约为1.9kb的特异片段。回收PCR产物,将克隆片段和pGEMT载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,重组克隆经酶切鉴定后提取重组质粒pGEMTSLR1。该研究成功构建了SLR1基因的正义表达载体pCAMSLR(约0.7kb)和反义表达载体pCAMASLR(约1.2kb)。[结论]采用冻溶法可将表达载体pCAMSLR和pCAMASLR导入农杆菌并进行水稻的遗传转化。利用SLR1基因的正义和反义表达载体,可观察转基因植株中该基因的表达上调和下调对植物的影响。     

水稻抗白叶枯病的分子基础

水稻的白叶枯病抗性符合基因对基因模式。在水稻中已经确定了19个抗病基因（R基因），其中Xa1和Xa21已被克隆并得到了深入的研究。同时在黄单胞杆菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）中已克隆到了4个无毒基因（Avr基因）。本文以水稻的广谱白叶枯病抗病基因Xa21基因为主，综述了水稻R基因的起源、进化、抗性特异性，病原菌Avr基因的进化，R基因和Avr基因之间的互作以及由于这种互作而导致水稻对白叶枯病抗性的分子机制，并对通过基因工程利用R基因和Avr基因增育抗病水稻种质的策略进行了讨论。     

植物HSP70反义基因工程雄性不育表达载体的构建及鉴定

[目的]为更好地研究HSP70热激蛋白基因与植物雄性不育的关系。用PCR方法克隆了水稻花药特异表达启动子Osg6B,将其与设计合成的HSP70反义片段连接,构建了由水稻花药特异表达启动子Osg6B驱动的HSP70反义表达载体,并进行了PCR和酶切鉴定。[结果]克隆的Osg6B启动子序列与所发表的序列同源性高达97%,启动子区域的顺式调控元件完整;构建的由水稻花药特异表达启动子Osg6B驱动的HPS70反义表达载体通过了菌落PCR验证和表达载体值粒的酶切鉴定,载体构建成功。[结论]该表达载体的构建将为植物基因工程雄性不育的利用奠定基础。     

利用分子标记辅助选择育种(MAS)技术改良水稻恢复系粤恢826

[目的]改良杂交稻恢复系粤恢826,以提高其稻瘟病和白叶枯病抗性,改良米质,为选育抗病、优质的杂交稻组合提供良好亲本材料.[方法]以含稻瘟病抗性基因Pi1和Pi2、白叶枯病抗病基因Xa23及蜡质基因Wx的中间材料Z1103为供体亲本,杂交水稻强恢复系粤恢826为受体亲本,利用分子标记辅助选择(MAS)技术和系谱选育方法,聚合4个外源基因以改良粤恢826的抗病性和米质,并进行稻瘟病和白叶枯病抗性及米质鉴定.[结果]经SSR分子标记检测、田间抗病性及米质鉴定,获得以粤恢826为遗传背景且含有目标基因的6个改良株系,通过农艺性状筛选与恢复力测试,优选到一个含有Pi1、Xa23和Wx基因的纯合株系,其恢复力好,农艺性状优良,2014年早造定名为粤恢88,其田间鉴定稻瘟病抗性3级,白叶枯病抗性1级,米质为软米.2014年晚造与两系不育系Y58S配制杂交稻组合Y两优88,其在品比试验中产量达6543 kg/ha,比对照深两优58香油占增产4.97%,未达显著水平(P>0.05),且抗稻瘟病,中抗白叶枯病,米质鉴定为国优3级和省优3级.[结论]MAS技术可有效聚合多基因(Pi1、Xa23和Wx基因),使粤恢826的稻瘟病和白叶枯病抗性及米质明显改良,获得抗稻瘟病、高抗白叶枯病、米质为软米的新恢复系粤恢88,为选育抗病优质的杂交稻组合提供良好亲本材料.     

水稻抗白叶枯病近等基因系CBB30的培育及Xa30(t)的初步定位

 【目的】将普通野生稻资源Y238所携有的抗白叶枯病新基因Xa30(t)导入栽培稻JG30，培育近等基因系，进行分子标记定位，以便应用于育种实践。【方法】以感病籼稻品种JG30为轮回亲本，Y238为供体进行杂交、回交、自交培育近等基因系；以JG30/Y238的一个BC6F2代群体为定位群体，利用分离集团分析法（BSA），借助SSR、EST、STS等分子标记对Xa30(t)进行分子标记定位。【结果】成功培育了携有Xa30(t)基因的水稻抗白叶枯病近等基因系CBB30。从343个分子标记中筛选出4个能揭示抗感多态性的标记RM1341、V88、C189及03STS，用该4个标记对BC6F2代群体303个单株进行分子检测和连锁分析，结果表明上述4个标记均位于水稻第11染色体长臂，与Xa30(t)的遗传距离分别为11.4 cM、11.4 cM、4.4 cM及2.0 cM，且它们位于Xa30(t)基因的同一侧。【结论】通过构建近等基因系及分子标记检测找到4个与Xa30(t)基因连锁的标记RM1341、V88、C189及03STS，将Xa30(t)基因定位于水稻第11染色体长臂上。     

黄鳝抗菌肽hepcidin基因大肠杆菌表达载体的构建

[目的]构建黄鳝抗菌肽hepcidin基因大肠杆菌表达载体。[方法]根据Genbank中黄鳝hepcidin基因序列设计引物进行PCR扩增,将测序正确的基因片段连接入载体pET-28a中。[结果]以黄鳝cDNA为模板,扩增出hepcidin基因片段,长度为291 bp,连接到pET-28a上。经PCR扩增、双酶切验证,证实成功构建原核表达载体。[结论]成功构建了黄鳝hepcidin基因大肠杆菌表达载体。     

小粒野生稻抗白叶枯病新基因的鉴定与初步定位

【目的】将小粒野生稻（Acc. No. 101133）的抗白叶枯病基因导入栽培稻IR24,并对其进行鉴定和分子标记定位,以便应用于育种实践。【方法】以小粒野生稻和栽培稻IR24的BC2F2群体及其F3、F4家系为材料,利用分离集团分析法（BSA）,借助SSR标记对Xa35(t)进行分子标记定位。【结果】通过对抗病基因进行抗谱鉴定和遗传分析,结果表明,该基因对白叶枯病菌株PXO86和PXO99表现感病,而对PXO61、PXO112和PXO339表现抗病,初步将其定位于水稻的第11染色体长臂上,同标记RM144共分离,并位于标记RM7654和RM6293之间,与两标记的遗传距离分别为1.1 cM和0.7 cM。【结论】小粒野生稻（Acc. No. 101133）含有新的抗白叶枯病基因,暂定为Xa35(t)。     

纹枯病菌诱导水稻表达的WRKY基因克隆及分析（摘要）

[目的]克隆纹枯病菌诱导的水稻上调表达基因。[方法]对应用抑制差减杂交技术（SSH）获得的纹枯病菌诱导水稻表达的EST序列K16进行电子克隆,根据电子克隆产物设计引物进行RT-PCR、克隆测序,利用生物信息学技术对克隆产物进行功能预测。[结果]克隆出一个长度为1079bp的序列,结构功能分析显示该基因编码236个氨基酸的蛋白,存在多个功能位点,含有2个典型的WRKY结构域和1个C2H2锌指型结构,该基因与水稻WRKY8、WRKY24和WRKY30基因有较高的同源性。[结论]经电子克隆获得的纹枯病菌诱导表达的基因为典型的WRKY家族基因,该基因可能在水稻抗纹枯病中起重要作用。     

抗稻瘟病基因Pib4的转基因研究

[目的]探讨抗稻瘟病基因Pib4的转基因。[方法]利用PCR法克隆Pib基因的NBS功能结构域到双元载体pCAMBIA1301上,以粳稻品种农大18的成熟胚诱导出愈伤组织,以愈伤组织作为转化的受体,采用农杆菌介导法转化Pib4基因。[结果]经PCR和GUS活性检测表明外源基因已整合到水稻基因组中并获得表达;用稻瘟病菌接种阳性植株,获得了抗稻瘟病菌的水稻植株。[结论]为合理利用抗病基因和育种提供了参考。     

水稻抗白叶枯病基因Xa23的EST标记及其在分子育种上的利用

 用水稻抗白叶枯病基因Xa23的近等基因系CBB23与其感病轮回亲本JG30杂交，构建了包含2 562个单株的F2作图群体。抗性鉴定表明，F2植株抗感分离比严格符合3∶1。根据日本水稻基因组计划RGP的数据，筛选并合成12个EST标记的引物，进行亲本间多态性检测，找到2个在CBB23与JG30间有多态性的EST标记，C189和CP02662。用该标记对F2群体中的571个感病单株进行分子检测和连锁分析，结果表明这两个EST标记位于Xa23基因的两侧，C189靠着丝粒一侧，与Xa23的遗传距离为0.8cM；CP02662靠端粒一侧，与Xa23的遗传距离为1.3cM。将C189成功用于水稻分子育种实践，标记辅助选择的正确率接近100%，已培育出3个将Xa23基因与高产、优质、抗褐飞虱等性状聚合的水稻恢复系。     

白叶枯病抗性基因Xa23的分子检测

用与水稻抗白叶枯病基因Xa23紧密连锁的SSR标记RM206,对中野5112、恢复系桂649及其35份优良杂交后代F4材料进行分子检测。结果显示,供体材料中野5112和其中的13份杂交后代材料携带有Xa23抗性等位点,占37.14%,受体材料桂649和另外的22份杂交后代材料没有携带Xa23抗性等位点。说明Xa23基因的遗传比较稳定,出现在优良杂交后代的机率较高,为选育和创新优良的抗白叶枯病育种中间材料,进而育成抗谱广、抗性持久的杂交稻组合和常规稻品种提供了良好的基础。