高通量测序分析5例进口鱼粉鱼源性成分构成

为揭示鱼粉原料构成,保证鱼粉质量,本研究应用高通量测序技术对来源于不同国家的5例进口鱼粉样品进行测序,并基于COI基因及其丰度对鱼粉鱼源性成分构成进行分析。提取鱼粉样品DNA后应用鱼类通用COI基因扩增引物进行PCR扩增,得到鱼类混合COI基因序列产物,将扩增产物送测序公司进行高通量测序,将COI基因测序数据与鱼类相关数据库进行比对,通过比对结果进行鱼粉的物种源性成分分析。结果显示,成功获得了5例鱼粉样品中原料鱼成分,其中白鱼粉原料鱼主要成分为鳕鱼;而红鱼粉原料鱼成分较为多样,涉及鲱鱼、竹刀鱼等。通过Python对数据进行统计分析,绘制PCR扩增后鱼类COI基因丰度图,进一步直观提示鱼粉样品中原料的成分构成。本研究结果表明,高通量测序技术可应用于鱼粉质量评估,有助于快速了解鱼粉构成,对其质量及用途进行指导,同时,提示该技术可进一步应用于鱼粉掺杂掺假及致病微生物的监测工作中,对保障鱼粉产品质量、维护正常市场秩序具有重要意义。     

饲料中鱼源性成分真实性鉴别研究

研究旨在建立标准化的饲料中鱼源性成分的PCR检测方法,以形成行业标准推广使用.应用鱼源性引物对35种鱼类、24种非鱼类动物和10种植物样品进行PCR检测,只在35种鱼类中出现224 bp特异扩增条带,在其他的非鱼类动植物DNA中未出现扩增条带.实验表明,PCR检测方法具有特异性,检测限为0.1 ng DNA和0.1 %(W/W).应用该方法对上海口岸进口的100个鱼粉样品进行检测,均能检出鱼源性成分.研究建立的标准化饲料中鱼源性成分PCR检测方法能应用于日常检验检疫工作,可推广使用.     

四川石渠县牦牛源蜱的形态学及分子生物学鉴定

为鉴定四川石渠县牦牛体表寄生蜱的种类,本试验使用体视显微镜观察蜱的形态学特征,对蜱做形态学初步鉴定,同时提取蜱组织DNA,用PCR扩增蜱COI基因,将阳性产物测序、比对,构建分子进化树进行分子生物学鉴定。结果表明,采集自石渠县牦牛体表的蜱为青海血蜱和西藏革蜱,其中西藏革蜱为优势虫种。     

弓形虫529 bp基因的克隆及序列分析

本研究对安徽猪源弓形虫529 bp重复序列进行了分析,为其分子流行病学研究以及诊断方法的建立奠定基础。首先对病料虫体基因组DNA进行提取,然后对弓形虫529 bp基因进行PCR扩增、克隆、测序并对测序结果进行比对、同源性分析和构建系统进化树。结果显示,PCR扩增产物约为528 bp,与已报道的弓形虫同一基因序列具有高度同源性,与GenBank报道的EF648169.1株同源性最高,达99.5%,且遗传距离最为接近;与其他5株猪源弓形虫比对显示主要突变区域在第31～74位和第100～141位碱基。表明该猪源弓形虫与犬源弓形虫EF648169.1株为姊妹株;本基因序列碱基突变较少,保守性较好,适合作为弓形虫病诊断的靶基因。     

青海省海北地区牦牛源贾第虫检测与基因型分析

为研究青海省海北地区牦牛贾第虫的感染情况及虫种基因型,对青海省祁连县、海晏县和刚察县的297份牦牛粪样采用蔗糖密度梯度离心法纯化,之后用免疫荧光方法对贾第虫进行鉴定,对阳性及疑似阳性样品采用基于18SrRNA和谷氨酸脱氢酶(gdh)基因的套式PCR扩增,并对扩增产物进行测序。将测序结果与GenBank中的贾第虫序列进行比对分析。免疫荧光抗体试验结果显示,共检出24份贾第虫阳性粪样,总阴性率为8.1%。套式PCR扩增结果显示,24份阳性样品中18SrRNA基因扩增阳性22份,gdh基因扩增阳性18份,产物大小分别为292bp和432bp。序列分析表明,分离的虫种均为牦牛源肠贾第虫,基因型为集聚体E,未发现人畜共患基因型。     

应用PCR技术检测鸽源性成分

根据鸽子线粒体DNAD-loop环基因中的保守序列,用Primer5.0设计针对鸽的特异性扩增引物。通过聚合酶链式反应从鸽样品中得到约150bp的特异条带。通过测序对扩增产物进行验证,鸽组织的PCR产物序列与基因库中检索到的相应序列相吻合。该实验建立了检测鸽动物源性成分的PCR方法,其检测灵敏度为0.1%。     

鸭茅叶绿体引物筛选

为筛选适用于鸭茅物种的基因引物序列,开展相关系统发育学研究,通过搜集鸭茅近缘物种叶绿体基因引物,使用PCR扩增技术和琼脂糖凝胶电泳检测来筛选出目的基因片段,对目的基因进行BLAST序列比对。结果表明:试验搜集的35对引物中共能筛选出trnL-F 1、 trnL-增产物经测序及比对结果后验证均为目的基因。本研究筛选的7对叶绿体基因引物扩增效果较好,适用于鸭茅的系统发育分析。     

利用荧光实时定量PCR法测定猪肌肉中解偶联蛋白3 mRNA丰度

用SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR技术,以β-actin为参照基因,建立了猪肌肉中解偶联蛋白3(UCP3)基因mRNA丰度的定量分析方法。UCP3基因片段的PCR产物测序与GenBank中该基因的序列一致,定量PCR过程中UCP3的熔解曲线也表明该PCR过程为特异性扩增。猪肌肉样品UCP3 mRNA样品的批内和批间变异系数分别<2%和<11%,标准曲线R2=0.998,线性范围涵盖样品的Ct值。由此,实验建立的猪肌肉UCP3基因mRNA丰度测定方法是可靠的、准确的,可以用于猪肌肉中UCP3 mRNA丰度的测定。     

蜱携带牛丙型肝炎病毒新亚型巢式PCR检测方法的建立

旨在提高新发现的牛丙型肝炎病毒毒株——广东湛江毒株(bovine hepacivirus-GDZJ,BovHepV-GDZJ)的检测及诊断能力,初步了解广东地区蜱携带BovHepV-GDZJ的情况,本研究结合宏转录组学、高通量测序及PCR技术,针对高通量测序结果中丰度高的基因区域,设计该病毒的巢式PCR特异性引物.通过...     

斑点叉尾鮰病毒焦磷酸测序检测方法的建立

旨在建立一种基于PCR的焦磷酸测序检测方法,用于斑点叉尾鮰病毒病的快速检测和确诊。针对斑点叉尾鮰病毒(CCV)蛋白激酶(PK)基因的保守区域设计扩增引物与测序引物,经PCR扩增后对PCR产物进行焦磷酸测序,借助测序结果比对确定是否为CCV核酸序列。通过对反应条件与体系的优化,成功建立了CCV PK基因焦磷酸测序检测方法。结果表明:建立的斑点叉尾鮰病毒焦磷酸测序检测方法扩增基因片段长度为144 bp,能够特异性检测出目的病毒,最低核酸检测限为5×10-6ng/μL,重复测序3次均能准确测出45 bp核酸序列。本研究建立的斑点叉尾鮰病毒焦磷酸测序检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适合高通量检测且耗时短仅需4 h,为CCV的快速检测提供了一种可行方法。     

基于线粒体12S rRNA基因序列鉴别牛肉的种源

 在提取黄牛肉、牦牛肉和水牛肉总DNA的基础上,设计通用引物进行PCR扩增,电泳回收PCR产物后双向测序,再通过构建系统进化树鉴别牛肉的物种来源。PCR扩增获得的牦牛、水牛12S rDNA基因片段大小都为440 bp,黄牛12S rDNA基因片段大小都为439 bp。参照引用的不同牛种12S rDNA基因序列,构建的系统进化树能够清晰地鉴别测序样品的牛种来源。因此,结合运用PCR扩增和DNA测序技术是一种精确可靠的方法,能够有效地运用于牛肉的种源鉴别。     

冬夏季长白猪精液中细菌多样性与精子质量特性关联分析

为探究冬夏季长白猪精液中细菌多样性变化和精子质量特性之间的相关性,利用16S rRNA基因高通量测序技术得到冬夏季长白猪精液中微生物的特征序列(ASV),计算机辅助精子分析系统(CASA)分析冬夏季精子活力参数指标的变化.结果 显示:长白猪精液中细菌多样性在冬夏季之间差异显著(P＜0.05),门水平冬季优势菌群为厚壁菌...     

Sex identification of Japanese black bear,Ursus thibetanus japonicus,by PCR based on amelogenin gene

A method for sex identification of the Japanese black bear was examined using a polymerase chain reaction (PCR) and sequencing of a part of the amelogenin gene. This gene is located on the X and Y chromosomes, and there are 54 nucleotide deletions on the Y chromosome-specific gene. Forty-seven (26 male and 21 female) DNA samples and 23 (13 male and 10 female) DNA samples, respectively extracted from white blood cells and hairs of Japanese black bears were analyzed. The primers SE47 and SE48 from this X-Y homologous region were used in sex identification by PCR amplification. These primers amplified X- and Y-specific bands, which could be used to discriminate between sexes by a length polymorphism in all samples. We suggest that PCR amplification using the primers SE47 and SE48 is useful for sex determination of the Japanese black bear and could be applied to DNA analysis of small samples such as hairs.     

焦磷酸测序技术在确证猪甲型H1N1流感病毒中的应用

目的本研究旨在通过对猪甲型H1N1流感病毒进行序列信息分析的基础上,利用焦磷酸测序技术建立一种快速、简单地确证猪甲型H1N1流感病毒的方法。方法通过序列信息比对,设计H1HA和N1NA基因保守区段的扩增引物及测序引物。从感染猪甲型H1N1病毒的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,RT-PCR扩增目的基因片段,采用焦磷酸测序技术(PSQ)针对HA基因和NA基因进行保守核苷酸区段的测序分析。利用扩增引物与其他猪源病毒进行特异性试验,利用测序引物进行重复性试验。将该方法与病毒分离和荧光定量RT-PCR方法做临床样品的平行检测,并比较结果。结果通过序列信息比对寻找到表征H1N1亚型的核苷酸保守区段,经焦磷酸测序后能进一步确证毒株的序列信息为猪甲型H1N1流感病毒。特异性试验表明,不与其他猪源病毒发生交叉反应;重复性试验表明,重现性为100%。对221份临床样品检测表明,病毒分离鉴定与焦磷酸测序方法结果符合率为96.8%,与TaqMan荧光定量方法检测结果符合率90.3%。经统计学分析,焦磷酸测序确证与病毒分离鉴定在检测临床样品上,两者差异不显著。结论基于序列分析的焦磷酸测序技术可以作为进一步确证方法使用。     

小鼠Zbtb38基因慢病毒过表达质粒的构建与鉴定

本研究旨在构建Zbtb38（zinc finger and BTB domain containing 38）基因慢病毒过表达质粒载体。以小鼠脊髓组织为材料,采用重叠延伸PCR方法扩增小鼠Zbtb38基因的CDS序列,分别设计Zbtb38 CDS序列前段扩增引物1和后段扩增引物2,再以上述两对引物的扩增产物作为模板,设计引物3并进行融合PCR扩增,由此得到Zbtb38 CDS全序列。将获得的Zbtb38基因CDS全序列连接到质粒pGM-T,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,采用直接PCR鉴定阳性克隆并进行测序验证。利用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切方法将Zbtb38 CDS序列连接至慢病毒载体Plvx-puro,获得穿梭质粒Plvx-puro-Zbtb38,再与慢病毒包装质粒共转染293T细胞生产慢病毒颗粒。结果显示,引物1扩增产物包含Zbtb38 CDS全序列的第1-1 794 bp,扩增产物实际测序长度为1 772 bp,引物2扩增产物包含Zbtb38 CDS全序列的第1 762-3 594 bp,扩增产物实际测序长度为1 818 bp,说明分段扩增目的片段已成功。引物3扩增的预期融合产物及菌落PCR扩增产物均包含Zbtb38 CDS全序列（3 594 bp）,与NCBI数据库Zbtb38基因的CDS序列比对后的重合率达99.99%,表明Zbtb38 CDS序列扩增成功。实时荧光定量PCR检测结果显示,病毒滴度达3.25×10⁸ Tu/mL,达到普通动物注射标准要求,提示慢病毒载体构建成功。综上所述,本试验成功构建了小鼠Zbtb38基因慢病毒过表达质粒载体。     

Construction and Identification of Lentiviral Overexpression Plasmid of Mouse Zbtb38 Gene

This study was conducted to construct zinc finger and BTB domain containing 38 (Zbtb38) gene lentiviral overexpression plasmid vector.Firstly,the CDS sequence of mouse Zbtb38 gene was amplified by overlap extension PCR method using mouse spinal cord tissue,and the Zbtb38 CDS sequence front amplification primer 1 and the latter amplification primer 2 were designed respectively.Using the amplification products of the above two primers as template,primer 3 was designed and subjected to fusion PCR amplification,thereby obtaining the full CDS sequence of Zbtb38.Then,the obtained Zbtb38 gene CDS full sequence was ligated to the plasmid pGM-T,and the recombinant plasmid was transferred into E.coli DH5α competent cells,the positive clones were identified and verified by direct PCR and sequencing.Finally,the Zbtb38 CDS sequence was ligated into the lentiviral vector Plvx-puro by XhoⅠ and BamHⅠ double digestion to obtain the shuttle plasmid Plvx-puro-Zbtb38,which was co-transfected with lentiviral packaging plasmids to produce lentiviral particles in 293T cells.The results showed that the primer 1 amplification product contained the first 1-1 794 bp of the Zbtb38 CDS sequence,and the actual sequencing length of the amplified product was 1 772 bp.The primer 2 amplification product contained the 1 762-3 594 bp of the entire sequence of Zbtb38 CDS,and the actual sequencing length of the amplified product was 1 818 bp,indicating that the fragmented amplification target fragment was successfully obtained.The expected fusion products amplified by primer 3 and the PCR amplification products of the colonies both contained the complete sequence of Zbtb38 CDS (3 594 bp),which was compared with the CDS sequence of Zbtb38 gene in NCBI database,and the coincidence rate was 99.99%,indicating that the Zbtb38 CDS sequence was successfully amplified.The Real-time PCR results showed that the virus titer reached 3.25×10⁸ Tu/mL,which met the experimental animal injection standard requirement,indicating that the lentiviral vector was successfully constructed.In summary,the mouse Zbtb38 gene lentiviral overexpression plasmid vector was successfully constructed in this experiment.     

基于宏基因组学的鸭源样本中坦布苏病毒检测方法的建立

利用二代高通量测序技术建立检测鸭源样品中坦布苏病毒的方法。首先将样品过滤和经核酸酶处理,再利用等温链位移扩增(SPIA)技术快速制备样品总cDNA,最后经磁珠纯化和文库构建后,通过Ion Torrent进行高通量测序获得基因组信息。结果显示,通过SPIA扩增和核酸文库制备的优化,可从微量病原样本中获得327pmol/μL的核酸文库样本。Ion Torrent测序共获得1 725 436条reads,约6.2M数据,平均109bp。数据拼接并Blast发现,病原样品的核酸序列可注释鸭坦布苏病毒全部基因组数据,与首次发生在我国的鸭坦布苏病毒BYD-1株参考序列的同源性为100%。将所测病毒序列与其他5种黄病毒科成员进行同源性比对,发现与近3年发生在我国的鸭坦布苏病毒同源性最高,在98%以上。且NS基因进化树分析与鸭坦布苏病毒处于同一分支上,符合鸭坦布苏病毒特征。本研究建立的基于未知病原SPIA扩增结合高通量测序检测方法,可同步获知坦布苏病毒基因的核酸信息。     

鸭茅叶绿体引物筛选

为筛选适用于鸭茅物种的基因引物序列,开展相关系统发育学研究,通过搜集鸭茅近缘物种叶绿体基因引物,使用PCR扩增技术和琼脂糖凝胶电泳检测来筛选出目的基因片段,对目的基因进行BLAST序列比对.结果表明:试验搜集的35对引物中共能筛选出trnL-F 1、trnL-F 5、rpL162、rpL164、matK 6、matK ...