应用DGGE分析秸秆日粮对奶牛瘤胃细菌群落的影响

【目的】通过与苜蓿日粮比较,揭示秸秆日粮模式下瘤胃固液相细菌群落的独特结构。【方法】选择12头健康且体重相似的装有永久瘤胃瘘管的中国荷斯坦奶牛,分别饲喂以玉米秸秆（CS）和苜蓿、羊草、青贮玉米三者混合物（MF）为粗饲料组成的日粮,正饲期第13周连续3 d分12个时间点采集瘤胃固、液相内容物样品。提取微生物DNA后,利用PCR结合变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）分析细菌群落结构,并进行聚类分析及差异条带的测序分析。【结果】与MF组相比,CS组奶牛瘤胃固、液相细菌DGGE图谱条带的数目和光密度均有一定差异,两处理组都各有一些稍显优势的条带,CS组优势条带要少于MF组。与MF组相比,CS组液相细菌的香浓多样性指数无差异（P＞0.05）,固相细菌香浓多样性指数显著降低（P＜0.01）;通过对差异条带进行测序,发现与MF组相比,CS组中瘤胃细菌Prevotella sp.、Acetivibrio ethanolgignens和Clostridium sp.减少,并且大量来源于Bacteroidetes、Firmicutes、Tenericutes和Proteobacteria等菌门的未培养细菌有所变化。【结论】秸秆日粮条件下奶牛瘤胃存在独特的细菌群落结构,细菌多样性较低。     

应用PCR-DGGE比较奶牛瘤胃中不同粗饲料固相粘附细菌的多样性

为了比较奶牛瘤胃中不同粗饲料粘附细菌菌群结构,选择3头体况相近、健康、装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛,将苜蓿与全株玉米青贮混合粗饲料日粮(MF)和单一玉米秸秆日粮(CS)分别装入尼龙袋,在瘤胃中孵育24h后取出,用磷酸缓冲液洗脱获得饲料固相粘附部分,剩余的饲料残渣是固相超紧密粘附部分,提取总DNA,最终获得固相紧密粘附细菌和固相超紧密粘附细菌,利用PCR-DGGE分析细菌群落结构.结果表明:不同粘附程度的固相细菌的DGGE图谱条带数目和颜色深浅存在较大的差异,而粘附程度相同的不同粗饲料的DGGE图谱条带相似.2种饲料的瘤胃固相紧密粘附细菌的Shannon-Wiener多样性指数,CS高于MF(P<0.05),相比于固相紧密粘附细菌,固相超紧密粘附细菌的Shannon-Wiener多样性指数更高(P<0.01).不同粘附程度的固相细菌差异条带近源种分别归属于Brevundimonas,Prevotella,Pseudobutyrivibrio,Clostridium.因此认为,粗饲料类型和粘附程度影响细菌多样性,其中固相超紧密粘附细菌的多样性较高.     

基于PCR-DGGE技术的冷藏牡蛎鳃部菌群分析

应用PCR-DGGE技术研究4℃冷藏期间牡蛎鳃部菌群的动态变化及腐败菌群.直接从牡蛎鳃部中提取细菌总DNA,对细菌的16S rDNA的V3区进行PCR扩增,扩增产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),分析DGGE微生物指纹图谱.DGGE指纹图谱结果表明,新鲜牡蛎鳃部菌群复杂,随冷藏期的变化菌条带变化明显;整个冷藏期间Lactococcus raffinolactis和Enterobacter sp.为牡蛎鳃部的优势菌,牡蛎冷藏后期腐败的主要菌群为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、气单胞菌属(Aeromonas spp.)、乳球菌属(Lactococcus spp.)、肠杆菌属(Enterobacter spp.)、Weissella confusa和Lactobacillus sakei.     

基于变性梯度凝胶电泳的青县苹果再植障碍园与丰产园土壤细菌多样性研究

为了分析比较青县苹果再植障碍园与丰产园的土壤细菌多样性,利用Quantity One软件对变性梯度凝胶电泳(DGGE)图谱进行多样性分析,并对DGGE图谱上的条带切胶测序,以分析群落结构。结果表明,图谱各泳带中的条带数目相差不大,但其亮度有一定差异;DGGE图谱的峰图中,代表丰产园土壤样品的峰具有较大的峰面积;再植障碍园与丰产园土壤中的主要菌群都属于γ变形菌亚门(γ-Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、α变形菌亚门(α-Proteobacteria);仅存在于再植障碍园样品中的细菌属于厚壁菌门(Firmicutes)、γ变形菌亚门(γ-Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)。可见,环渤海湾苹果产区丰产园土壤中的细菌群落与再植障碍园相比拥有较高的丰富度,两种果园有着相似的细菌群落多样性,造成两种果园细菌群落结构差异的细菌具有多样性。     

南美白对虾养殖底泥细菌多样性研究

【目的】研究南美白对虾养殖池一个养殖周期的底泥细菌多样性,为指导水产养殖提供参考。【方法】于2011年7-9月,采集上海市金山区水产养殖基地南美白对虾养殖池塘的底泥,提取底泥中细菌的总DNA,扩增细菌16SrDNA的V3可变区,采用DGGE指纹图谱技术以及基因测序技术,对该养殖周期的底泥细菌多样性进行研究。【结果】不同月份虾池底泥中存在一定数量的共有优势菌群,7月和8月的共有优势菌群分别为黄杆菌属和绿弯菌门细菌,8月和9月共有优势菌群为梭菌属细菌,7月份和9月份共有优势菌群为拟杆菌门细菌和硫酸盐还原菌;同时,7-9月底泥中还各自分布有除硫单胞菌属、蛭弧菌属、δ-变形菌门、酸杆菌门、厚壁菌门、聚球藻属等细菌。【结论】南美白对虾养殖底泥中细菌多样性丰富。     

PCR-DGGE技术在水牛瘤胃产甲烷菌多样性分析中的应用

【目的】分析水牛瘤胃产甲烷菌的多样性,为更好地了解水牛瘤胃产甲烷菌提供科学依据。【方法】采集16头广西本地沼泽型水牛瘤胃内容物,提取总DNA,利用产甲烷菌的通用引物扩增16S rRNA基因序列进行DGGE分析,并对DGGE凝胶上7条优势条带进行回收克隆测序。【结果】共获得9条序列（5条为古菌序列、4条为非古菌序列）,5条古菌序列中有3条与甲烷短杆菌（Methanobrevibacter）的同源性高达99%、1条与甲烷短杆菌的同源性达98%、1条与广古菌门（Euryarchaeota）热原体目（Thermoplasmatales）的同源性达98%;而4条非古菌序列分别属于拟杆菌（Bacteroidetes）、厚壁菌（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）,且彼此间同源性较小。【结论】通过PCR-DGGE技术可以较好地分析水牛瘤胃产甲烷菌的多样性。     

PCR-DGGE技术在水牛瘤胃产甲烷菌多样性分析中的应用

【目的】分析水牛瘤胃产甲烷菌的多样性,为更好地了解水牛瘤胃产甲烷菌提供科学依据。【方法】采集16头广西本地沼泽型水牛瘤胃内容物,提取总DNA,利用产甲烷菌的通用引物扩增16SrRNA基因序列进行DGGE分析,并对DGGE凝胶上7条优势条带进行回收克隆测序。【结果】共获得9条序列（5条为古菌序列、4条为非古菌序列）,5条古菌序列中有3条与甲烷短杆菌（Methanobrevibacter）的同源性高达99%、1条与甲烷短杆菌的同源性达98%、1条与广古菌门（Euryarchaeota）热原体目（Thermoplasmatales）的同源性达98%;而4条非古菌序列分别属于拟杆菌（Bac-teroidetes）、厚壁菌（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）,且彼此间同源性较小。【结论】通过PCR-DGGE技术可以较好地分析水牛瘤胃产甲烷菌的多样性。     

粗饲料颗粒替代玉米青贮对肉牛瘤胃发酵及微生物菌群的影响

【目的】研究粗饲料颗粒对肉牛瘤胃发酵及瘤胃菌群结构的影响.【方法】选择20头18月龄、体质量相近的西门塔尔杂种公牛(西门塔尔牛♂×本地黄牛♀),随机分为4组,试验组1、2和3的粗饲料分别以粗饲料颗粒(50%玉米秸秆+50%苜蓿干草)替代20%、50%和80%的全株玉米青贮,对照组粗饲料全部为全株玉米青贮,育肥120天屠宰后,采集4组肉牛瘤胃液,测定瘤胃发酵参数,运用16S rDNA高通量测序分析试验组3和对照组的瘤胃菌群多样性.【结果】粗饲料颗粒替代部分全贮玉米青贮饲喂肉牛,瘤胃总挥发性脂肪酸无显著变化,NH_3-N浓度、乙酸比例和乙酸/丙酸比值显著降低(P0.05)而丙酸比例显著增加(P0.05);粗饲料颗粒替代80%全株玉米青贮,瘤胃菌群中检测到共有操作分类单位(OTUs)802个,对照组和试验组3肉牛瘤胃特有OTUs分别为359个和312个,瘤胃液菌群相对丰度和多样性无显著变化;2组肉牛瘤胃液中相对丰度占82%以上的优势菌群门类为拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes),普雷沃氏菌属(Prevotella)为优势菌属.【结论】粗饲料颗粒替代部分全株玉米青贮,降低了瘤胃液NH_3-N浓度、乙酸比例及乙酸/丙酸比值,提高了丙酸比例,对瘤胃液总VFA浓度、菌群丰度和多样性无显著影响.     

T-RFLP指纹图谱技术分析细菌型微生物肥料菌种稳定性

[目的]建立一种分析微生物肥料菌种稳定性的T-RFLP指纹图谱技术。[方法]采用T-RFLP指纹图谱技术对进口细菌型微生物肥料菌种的稳定性进行分析。[结果]样品中优势菌的T-RFs片段主要是87、246、247、330 bp,其中330 bp为主要片段,Shannon多样性指数和均一性指数测定结果表明,不同批次产品间差异性较小,微生物群落结构较稳定。[结论]建立了微生物肥料菌种稳定性分析的T-RFLP指纹图谱技术,为进出口微生物肥料产品提供了一种快速分析方法。     

PCR-DGGE技术分析断奶仔兔肠道微生物菌群结构及多样性

利用PCR-DGGE技术对断奶后10、20、30 d仔兔的十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠16S rDNA V3区基因进行图谱分析,通过对清晰的特异性和共性条带切胶回收DNA和克隆测序,对不同日龄和不同肠段内容物细菌群落的结构和多样性进行比较,并鉴定其群落成员,分析断奶仔兔不同日龄和肠段部位对微生物群落结构与多样性的影响.肠道菌群DGGE图谱显示断奶仔兔肠道部位和不同日龄对细菌种群结构和多样性影响很大,随着日龄增加,十二指肠和盲肠段微生物种类趋于复杂,空肠和结肠段经历由简单到复杂再到简单的过程,而回肠段肠道微生物则出现由复杂到简单再到复杂的过程.各肠段的优势细菌有厚壁菌门、拟杆菌、梭状杆菌、博德氏菌属、毛螺旋菌科,以及各种不可培养的细菌等.     

新疆彩色丘陵地貌岩石层细菌多样性研究

[目的]了解新疆彩色丘陵地貌中不同颜色岩石层的细菌多样性及其优势种群.[方法]利用末端限制性片段长度多态性(Teminal Restriction Fragment Length Polymorphism,T-RFLP),对5种不同颜色岩石层细菌多样性进行分析.[结果]T-RFLP图谱和聚类分析结果显示,2号(粉红色)岩石层细菌多样性最高,2号(粉红色)和3号(红灰色)样品中细菌群落结构相似性最高,而5号(橙棕色)样品与其他样品间相似性最低,各样品间细菌群落结构相似性介于5.6;～60;;所得结果与RDP数据库比对,推测出5种岩石样品的优势微生物种群分别为Ruminococcaceae,Burkholderiaceae,iron-reducing bacterium,Shewanella,Frateuria和一些免陪养菌群.[结论]新疆彩色丘陵地貌岩石层样品随着颜色由浅至深,其末端限制性片段(Terminal Restriction Fragments,TRFs)的数量由多到少,除5号(橙棕色)外,其余岩石层细菌多样性较高;由分析结果可以推测,新疆彩色丘陵地貌岩石层中可能存在一些潜在新种.     

日粮精粗比对山羊瘤胃内微生物蛋白微循环的影响

 【目的】以4只装有瘤胃瘘管的山羊为试验动物,研究不同精粗比日粮对山羊瘤胃微生态中原虫和细菌区系以及微生物蛋白微循环的影响规律。【方法】试验设精（玉米-豆饼）粗（稻草）比分别为10﹕90、30﹕70、50﹕50和70﹕30的4种日粮（A、B、C、D）,采用4×4拉丁方设计进行饲喂试验,采用荧光染色细菌技术测定瘤胃原虫对细菌的吞噬速率。【结果】日粮精粗比显著影响微生物细胞的密度。原虫密度C组最高;细菌和原虫的密度A组最低;日粮精粗比显著影响原虫吞噬的速率,A、B、C、D 4组的吞噬速率分别为：429.5、366.74、389.48、402.2 cells?cell-1?h-1,换算为对细菌N的吞噬速率分别为：2.319、1.98、2.103、2.172 pg N?cell-1?h-1。【结论】每天每头羊由于原虫的吞噬而造成的细菌N的循环损失估算分别为：136.49;369.02;485.99;440.56 mgN/（d?头）,即菌体蛋白损失为0.853、2.306、3.370和2.754 g/（d?头）,其中以C组菌体蛋白循环损失量最大,细菌周转率最高（3.07%）。     

日偏食对乌鲁木齐空气细菌多样性的影响

[目的]了解日偏食对乌鲁木齐空气细菌多样性影响.[方法]利用末端限制性片段长度多态性技术(T - RFLP,Terminal- restriction fragment length polymorphism)分析比较日偏食前后乌鲁木齐空气细菌多样性变化.[结果]日偏食当天的各项多样性指数均高于其他几天;酶切图谱和多样性指数结果显示,利用Rsa I酶切样品所得细菌多样性高于利用Hha I酶切所得结果;聚类分析显示,日偏食前1d,后1d和当天空气细菌可聚为一类,其余聚为一类.[结论]乌鲁木齐空气细菌受日偏食的影响多样性有所增加.     

新疆沙尘暴源区塔克拉玛干空气真菌群落的T-RFLP分析

[目的]了解新疆塔克拉玛干沙漠周边地区空气真菌物种多样性及群落结构特征.[方法]应用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术分析和比较塔克拉玛干沙漠空气真菌多样性.[结果]塔克拉玛干沙漠周边且末地区的空气真菌物种多样性最高,尉犁地区最少,9个地区空气样品间相似性介于8.3;～41.9;,其中若羌和莎车地区的相似性最高,达到41.9;;尉犁地区与且末、叶城的相似性最低,为8.3;,与聚类分析结果大体上相一致.典型性相关分析(CCA)表明非生物环境因子(海拔、温度、风速等)影响空气真菌群落的多样性.[结论]塔克拉玛干沙漠周边9个地区空气真菌多样性较丰富,且各地区的优势真菌种群和丰度不同;限制性内切酶的种类对空气真菌群落信息的描述有较大影响.     

不同菌剂处理青贮甘蔗尾叶对努比亚山羊瘤胃微生物群落的影响

【目的】明确不同菌剂处理青贮甘蔗尾叶对山羊瘤胃微生物多样性的影响,为青贮甘蔗尾叶在山羊养殖生产中的应用提供参考依据。【方法】选取72只平均体重24.5 kg的努比亚山羊,随机分为对照组（CK）及3个试验组（T1～T3）,每组2个重复,每个重复9只。CK组饲喂自然青贮甘蔗尾叶的全混合日粮（TMR）,T1组饲喂经植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌及鼠李糖乳杆菌处理青贮甘蔗尾叶的TMR,T2组饲喂经黑曲霉、枯草芽胞杆菌及米曲霉处理青贮甘蔗尾叶的TMR,T3组饲喂经枯草芽胞杆菌和乳酸片球菌处理青贮甘蔗尾叶的TMR。预试期7 d,试验期42 d。饲喂结束后基于Illumina高通量测序技术探究不同菌剂处理青贮甘蔗尾叶对努比亚山羊瘤胃微生物多样性的影响。【结果】从4个处理组努比亚山羊瘤胃液中最终获得的OUT数量排序为T3组（1637个）> T2组（1603个）> CK组（1576个）> T1组（1560个）;各处理组间的Chao1指数排序为T3组> T2组> T1组> CK组,但差异不显著（P> 0.05,下同）;Shannon指数排序为T3组> T2组> T1组> CK组,其中T3组显著高于CK组和T1组（P< 0.05,下同）;Simpson指数排序为T1组> CK组> T2组> T3组,各组间差异也不显著。在门分类水平上,拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）是努比亚山羊瘤胃液中的绝对优势菌门,拟杆菌门相对丰度为57.50%～65.40%,以T1组的相对丰度最高;厚壁菌门相对丰度为14.39%～24.38%,T3组的相对丰度显著高于其他处理组;蓝藻菌门（Cyanobacteria）也表现为T3组的相对丰度最高。在属分类水平上,普雷沃氏菌属-1（Prevotella-1）是努比亚山羊瘤胃液中的绝对优势菌属,其对应的相对丰度排序为T3组> T1组> T2组> CK组,但组间差异不显著;未知属f型拟杆菌目RF16菌（Bacteroidales RF16 group_norank）、普雷沃氏菌科UCG-001（Prevotellaceae UCG-001）和解琥珀酸菌属（Succiniclasticum）的相对丰度均表现为T3组显著高于其他处理组。【结论】经枯草芽孢杆菌+乳酸片球菌处理的甘蔗尾叶青贮效果最佳,以其饲喂努比亚山羊可增加瘤胃微生物种群数量及多样性水平,进而提高努比亚山羊瘤胃降解粗纤维的能力及机体对非纤维性碳水化合物的消化能力。     

PCR-DGGE技术分析蛋鸡MHC基因对肠道细菌种群结构的影响

 【目的】研究蛋鸡MHC（Major Histocompatibility Complex,主要组织相容性复合物）基因对不同周龄和不同部位肠道细菌种群结构的影响。【方法】使用基于16S rDNA的PCR-DGGE技术,结合特异性和共性条带割胶回收DNA进行克隆和测序,对2,4,6和8周龄商品蛋鸡和15I5系蛋鸡嗉囊、十二指肠、空肠、回肠和盲肠内含物细菌群落的结构和多样性进行比较,鉴定8周龄蛋鸡部分特异性和共性群落成员。【结果】商品蛋鸡和15I5系蛋鸡盲肠细菌的多样性最高,其次是回肠和空肠,嗉囊和十二指肠的细菌多样性比较低,且随着蛋鸡周龄增加,各肠段细菌多样性呈上升趋势,MHC基因对细菌多样性无显著影响。DGGE图谱聚类分析表明,蛋鸡MHC基因对4、6周龄肠道细菌的影响最大,对2周龄影响最小;而且MHC基因对消化道前段细菌的影响小于对后段影响。序列分析发现,8周龄商品蛋鸡和15I5系蛋鸡均有大量的三得利乳杆菌（Lactobacillus suntoryeus）,是蛋鸡消化道前段的优势细菌;商品蛋鸡空肠、回肠和盲肠中的特异性条带主要是Ochrobactrum spp,索氏梭菌（Clostridium sordellii）,超巨巨单胞菌（Megamonas hypermegale）和大量不可培养的细菌;15I5系蛋鸡的特异性条带主要是不可培养的细菌。【结论】蛋鸡MHC基因可影响不同周龄、不同肠段细菌群落的结构。     

茶皂素和丝兰皂苷对山羊人工瘤胃发酵和瘤胃微生物的影响

 【目的】研究利用茶皂素和丝兰皂苷混合物对瘤胃发酵和瘤胃内纤维降解菌变化的影响。【方法】采用2×4因子体外培养试验设计,因子一为对照组（不添加皂苷）和添加皂苷组（添加0.3%茶皂素和0.03%丝兰皂苷的混合物）,因子二为不同精粗比水平（20﹕80、40﹕60、50﹕50及60﹕40）,研究不同精粗比以及皂苷条件下对瘤胃发酵和瘤胃微生物的影响。【结果】茶皂素和丝兰皂苷的混合物能降低瘤胃pH,且精粗比为20﹕80时差异极显著（P＜0.01）;能够增加乙酸、丙酸、丁酸以及TVFA的浓度,但从各成分所占比例来看,茶皂素和丝兰皂苷混合物的添加降低了乙酸和丁酸的摩尔百分比例,增加了丙酸的摩尔百分比例,因此降低了乙酸/丙酸;能够降低原虫真蛋白产量而细菌真蛋白产量提高,细菌与原虫的比值提高且差异极显著（P＜0.01）。同一精粗比条件下,添加皂苷组产琥珀酸拟杆菌的相对数量均比非添加组高,除精粗比为20﹕80时差异不显著外（P＞0.05）,其它精粗比状态下差异极显著（P＜0.01）;除精粗比为40﹕60时外,其它精粗比状态下添加皂苷组白色瘤胃球菌和黄化瘤胃球菌的相对数量均比非添加组高。【结论】添加皂苷有降低瘤胃液中原虫总数和pH的趋势,并能够降低原虫真蛋白产量而提高细菌真蛋白产量。茶皂素和丝兰皂苷混合物对瘤胃发酵模式和瘤胃内纤维降解菌变化有一定影响,其作用效果受培养底物精粗比的显著影响。