应用DGGE分析秸秆日粮对奶牛瘤胃细菌群落的影响

【目的】通过与苜蓿日粮比较,揭示秸秆日粮模式下瘤胃固液相细菌群落的独特结构。【方法】选择12头健康且体重相似的装有永久瘤胃瘘管的中国荷斯坦奶牛,分别饲喂以玉米秸秆（CS）和苜蓿、羊草、青贮玉米三者混合物（MF）为粗饲料组成的日粮,正饲期第13周连续3 d分12个时间点采集瘤胃固、液相内容物样品。提取微生物DNA后,利用PCR结合变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）分析细菌群落结构,并进行聚类分析及差异条带的测序分析。【结果】与MF组相比,CS组奶牛瘤胃固、液相细菌DGGE图谱条带的数目和光密度均有一定差异,两处理组都各有一些稍显优势的条带,CS组优势条带要少于MF组。与MF组相比,CS组液相细菌的香浓多样性指数无差异（P＞0.05）,固相细菌香浓多样性指数显著降低（P＜0.01）;通过对差异条带进行测序,发现与MF组相比,CS组中瘤胃细菌Prevotella sp.、Acetivibrio ethanolgignens和Clostridium sp.减少,并且大量来源于Bacteroidetes、Firmicutes、Tenericutes和Proteobacteria等菌门的未培养细菌有所变化。【结论】秸秆日粮条件下奶牛瘤胃存在独特的细菌群落结构,细菌多样性较低。     

基于DGGE和T-RFLP分析采食不同粗饲料梅花鹿瘤胃细菌区系

【目的】细菌区系在梅花鹿（Cervus nippon）瘤胃发酵中发挥着重要作用,然而有关梅花鹿瘤胃细菌区系的研究鲜有报道。研究梅花鹿瘤胃细菌区系,为梅花鹿瘤胃发酵调控提供分子生物学依据。【方法】选取4头2岁龄的装有永久性瘤胃瘘管的成年雄性梅花鹿为研究对象,分别饲喂以柞树叶（OL组,梅花鹿A和B）和玉米秸秆（CS组,梅花鹿C和D）为主要粗饲料的日粮,持续饲喂30 d。通过瘤胃瘘管取瘤胃内固液混合物,提取瘤胃微生物基因组DNA。扩增瘤胃细菌16S rRNA基因V3区以及16S rRNA基因,分别用于DGGE和T-RFLP分析。DGGE图谱进行聚类分析,并切取优势条带进行克隆测序,鉴定瘤胃内细菌组成。根据T-RFLP图谱结果计算细菌群落的多样性、优势度、均匀度和丰富度,通过Microbial Community AnalysisⅢ（MiCAⅢ）数据库推测T-RFs可能代表的微生物种类,并进行T-RFLP图谱的聚类分析。【结果】DGGE图谱聚类表明,CS组和OL组瘤胃细菌区系相似性低于65%,表明粗饲料种类影响梅花鹿瘤胃细菌区系。OL组梅花鹿A和B的DGGE图谱相似度大于70%,CS组梅花鹿C和D的DGGE图谱相似性大于75%,而且同组不同个体之间瘤胃细菌区系存在差异。OL组和CS组分别获得20和24个DGGE特异性条带。序列分析表明,CS组条带可归类为拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门,而OL组条带可归类为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和互养菌门。OL组与CS组中存在大量Prevotella spp.,但不同组中Prevotella spp.在种水平组成不同,主要纤维降解菌为Clostridium spp.与Eubacterium spp.。T-RFLP结果显示,梅花鹿D（CS组）具有最高的丰富度、多样性、均匀度和最低的优势度,梅花鹿A和B的各项指数相近但低于梅花鹿D,说明OL组中的粗饲料（柞树叶）影响瘤胃中微生物的相对生物量。梅花鹿C和D的各项指数相差较大而且梅花鹿C的指数低于梅花鹿A和B,表明同组不同个体之间存在差异。81、214、272和308 bp的T-RFs为OL组优势条带,90、95、175、273和274 bp的T-RFs为CS组优势条带,161、259、264、266和284 bp的T-RFs为共同条带。根据MiCAⅢ结果,这些T-RFs代表细菌归类于拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和酸杆菌门。T-RFs图谱聚类表明,4头梅花鹿T-RFs聚为两类,粗饲料来源影响梅花鹿瘤胃细菌T-RFs图谱特征,其中梅花鹿A、B和C的T-RFs特征条带图谱相似。【结论】Prevotella spp.是梅花鹿瘤胃优势细菌,但不同粗饲料影响梅花鹿瘤胃细菌区系组成。     

不同功能性寡糖组合对锦江黄牛瘤胃固相微生物多样性的影响

研究功能性寡糖组合对锦江黄牛的瘤胃固相微生物多样性的影响。选择3头健康且体重相近的安装有永久性瘤胃瘘管的锦江黄牛,采用自身对照方法,试验分3期进行,第1期:对照期,饲喂基础日粮,不添加任何寡糖;第2期:GT1添加期,饲喂基础日粮+0.8%甘露寡糖+1.0%果寡糖+0.8%大豆寡糖,第3期:GT2添加期,饲喂基础日粮+0.8%甘露寡糖+1.20%果寡糖+1.0%大豆寡糖,每期持续14 d。利用PCR-DGGE方法进行分析牛瘤胃固相微生物PCR-DGGE图谱条带数及相似性。结果发现:添加功能性寡糖组合后,对锦江黄牛瘤胃固相微生物PCR-DGGE图谱条带数影响不明显。3头牛3个试验期DGGE图谱的相似度较高。对锦江黄牛瘤胃液相微生物多样性影响有待下一步研究。     

应用变性梯度凝胶电泳和16S rDNA序列分析对山羊瘤胃细菌多样性的研究

 以取自3头安装有永久性瘤胃瘘管的土种山羊的瘤胃内容物为材料, 经过DNA抽提和PCR扩增, 扩增产物利用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE，一种DNA指纹技术)分析瘤胃细菌在两种日粮条件下的多样性。同时利用基因序列分析技术，分析了16个在DGGE胶上有匹配带的克隆的16S rDNA序列，并与现有的数据库进行了比较。结果表明，饲喂基础日粮时3头山羊瘤胃内容物的DGGE图谱有一定的相似性(43%～55%)；饲料中添加大豆黄酮一定程度上影响了瘤胃细菌的组成，DGGE谱带变化程度分别为1号36%、2号46%、3号30%。基因序列分析表明，DGGE图谱中优势条带的16S rDNA基因序列中有5个基因序列与基因数据库登录的相关序列的相似性大于97%，8个基因序列的相似性在90%～96%，余下的低于90%。相似性大于97%的5个克隆中，只有1个被鉴定为Prevotella sp.，其余4个都属于未被鉴定的瘤胃细菌。     

不同纤维素培养基及温度对体外培养瘤胃细菌多样性的影响

为探讨瘤胃细菌多样性,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(Polymerase chain reaction-denaturinggradientgel electrophoresis,PCR-DGGE)技术结合共性及特异性条带的克隆测序和聚类分析及主成分分析,对牛体外厌氧条件下瘤胃细菌在CMC、PCS、J、K培养基及37和50℃培养温度下的多样性进行研究。结果表明:1)37℃条件下不同培养基的DGGE图谱差异较大,虽然具有较高的平均条带数,CMC和K培养基样品分别为20和27条,但各样品间的相似性系数较低,J和CMC培养基间的相似性系数为0.84,J和PCS培养基间的相似性系数仅为0.75。2)50℃条件下不同培养基的DGGE图谱差异较小,平均条带数较低,CMC和K培养基样品均为15条,但各样品间的相似性较高,CMC和PCS培养基间的相似性系数为0.89;而J和PCS培养基间的相似性系数高达0.97。3)DGGE图谱中共性条带序列表明瘤胃优势细菌主要是Streptococcus macedonicus,而特异性条带主要是Escherichia coli、Firmicutes以及Brevundimonas。体外厌氧条件下不同纤维素培养基和温度在一定程度上影响瘤胃细菌的多样性。     

用PCR-DGGE和16S rDNA测序解析吐温对绵羊瘤胃细菌多样性的影响

选取装置永久性瘤胃瘘管的中国美利奴绵羊,采用5×5拉丁方试验设计,在绵羊日粮中分别添加5或10 g/d Tween 20,3或6 g/d Tween 80,以空白为对照,采用PCR-DGGE技术研究不同水平的非离子表面活性剂Tween 20和Tween 80对绵羊瘤胃中细菌多样性的影响;对DGGE指纹图谱中的12个优势DNA条带的16S rDNA进行测序和序列分析,在线寻找其相似的细菌分类。结果显示,5个组之间DGGE指纹图谱的相似性在65.4%～75.4%。与对照组相比,除10 g/d吐温20组外,其他各组的细菌丰度均有不同程度的下降。DNA序列分析表明,DGGE图谱中优势条带的16S rDNA序列中有8个条带序列与GenBank中已知序列的相似性大于97%。受吐温20影响的细菌与Microbacteriumoxydans、Schlegelella aquatica、Brevundi monas sp.、Lachnospir-aceae和Methylobacillus sp.有较高的相似性;而受吐温80影响的细菌与Schlegelella aquatica、Acinetobacter soli和Microbacteriumoxydans有较高的相似性。日粮中添加吐温20和吐温80后,高剂量的吐温20使绵羊瘤胃中的优势菌种类增加,吐温80和低剂量的吐温20使优势菌种类下降。在绵羊瘤胃细菌中,受吐温20和吐温80影响的种类不同。     

不同类型日粮对奶牛血液生化指标及生产性能的影响

试验选取20头中国荷斯坦奶牛,随机分为2组,每组10头.分别为单一玉米秸秆组(CS)和混合粗饲料组(MF).试验共进行7周,其中预试期2周,正试期5周.采集血液样品和乳样,测定血液生化指标和乳常规组分.结果表明:MF组奶牛血液中血糖和总胆固醇含量显著高于CS组(P0.05),血清尿素氮和β-羟丁酸含量极显著低于CS组(P0.01);MF日粮能显著提高奶牛产奶量、乳脂率和总固形物含量(P0.05),尿素氮和体细胞数显著低于CS组(P0.05),其余指标2个组间差异不显著(P0.05).说明MF日粮有利于维持血糖和血清尿素氮的正常水平,并能部分改善乳品质、提高生产性能.     

新疆驴盲肠、腹结肠、背结肠固相食糜细菌多样性研究

运用PCR-DGGE技术研究新疆驴盲肠、腹结肠、背结肠中固相食糜细菌组成多样性。选用3头成年、健康新疆驴,自由采食90%稻草+10%精料混合日粮,舍饲30 d后屠宰、分段取样备用。经过微生物基因组提取、目标片段扩增、变性梯度凝胶电泳、图像分析和数据处理,结果表明,不同肠道固相食糜细菌条带组成上有相似区域,也有各自的特异条带,而同一肠道段的个体样本间的细菌条带具有较高相似性,且盲肠固相食糜细菌的Shannon-Wiener指数、Simpson指数最大,与腹结肠差异不显著,但都分别显著高于背结肠。新疆驴盲肠固相食糜细菌多样性最为丰富,腹结肠次之,背结肠相对最弱。     

不同类型日粮对泌乳奶牛乳腺组织胰岛素通路及JAK2-STAT信号通路影响

研究不同类型日粮对奶牛血清激素、乳腺激素受体及其下游相关基因影响.试验选用10头健康泌乳中期荷斯坦奶牛,随机分成2组,分别饲喂不同类型粗饲料日粮,根据粗饲料来源不同,分为单一秸秆型(CS组)与苜蓿、青贮型(MF组).试验预饲期2周,正饲期4周.于正饲期最后1d清晨采集乳静脉血液以及乳腺组织样本.正饲期最后3d记录产奶量,并按早晚4:6比例采集奶样,使用乳成分分析仪测定乳蛋白.采用ELISA(酶联免疫吸附试验)方法和放射性免疫法(RIA)测定血清胰岛素、瘦素、脂联素、胰岛素样生长因子-1、生长激素、催乳素和雌二醇等激素含量,采用qRT-PCR方法测定乳腺相关激素受体及胰岛素下游通路相关基因mRNA表达丰度.结果表明,MF组奶牛血清中胰岛素和脂联素含量显著高于CS组(P＜o.05),其他激素含量并没有显著差异.MF组奶牛乳腺组织中INSR、PRLR、CSF2RB受体,IRS1、IRS4、S6K、JAK2基因mRNA表达量较CS组显著上调(P＜0.05).结果表明,饲喂苜蓿青贮粗饲料型日粮能提高血清中胰岛素和脂联素浓度,并能激活奶牛乳腺胰岛素信号通路与JAK2-STAT通路中部分重要基因表达,从而提高奶牛对饲料利用、促进脂代谢与蛋白质合成,对提高奶牛乳蛋白产量有重要意义.     

不同类型日粮对泌乳奶牛乳腺组织胰岛素通路及JAK2-STAT信号通路影响

研究不同类型日粮对奶牛血清激素、乳腺激素受体及其下游相关基因影响。试验选用10头健康泌乳中期荷斯坦奶牛,随机分成2组,分别饲喂不同类型粗饲料日粮,根据粗饲料来源不同,分为单一秸秆型(CS组)与苜蓿、青贮型(MF组)。试验预饲期2周,正饲期4周。于正饲期最后1 d清晨采集乳静脉血液以及乳腺组织样本。正饲期最后3 d记录产奶量,并按早晚4 6比例采集奶样,使用乳成分分析仪测定乳蛋白。采用ELISA(酶联免疫吸附试验)方法和放射性免疫法(RIA)测定血清胰岛素、瘦素、脂联素、胰岛素样生长因子-1、生长激素、催乳素和雌二醇等激素含量,采用qRT-PCR方法测定乳腺相关激素受体及胰岛素下游通路相关基因mRNA表达丰度。结果表明,MF组奶牛血清中胰岛素和脂联素含量显著高于CS组(P<0.05),其他激素含量并没有显著差异。MF组奶牛乳腺组织中INSR、PRLR、CSF2RB受体,IRS1、IRS4、S6K、JAK2基因mRNA表达量较CS组显著上调(P<0.05)。结果表明,饲喂苜蓿青贮粗饲料型日粮能提高血清中胰岛素和脂联素浓度,并能激活奶牛乳腺胰岛素信号通路与JAK2-STAT通路中部分重要基因表达,从而提高奶牛对饲料利用、促进脂代谢与蛋白质合成,对提高奶牛乳蛋白产量有重要意义。